JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этой статье описываются методы генерации, медикаментозного лечения и анализа эксплантов, полученных от пациента, для оценки реакций на лекарства от опухоли в живой, соответствующей пациенту, доклинической модельной системе.

Аннотация

Понимание лекарственной устойчивости и разработка новых стратегий сенсибилизации высокорезистентных видов рака зависят от наличия подходящих доклинических моделей, которые могут точно прогнозировать реакцию пациентов. Одним из недостатков существующих доклинических моделей является невозможность контекстуально сохранить микроокружение опухоли человека (TME) и точно представить внутриопухолевую гетерогенность, тем самым ограничивая клиническую трансляцию данных. Напротив, представляя культуру живых фрагментов опухолей человека, платформа эксплантата, полученная от пациента (ФДЭ), позволяет исследовать лекарственные реакции в трехмерном (3D) контексте, который максимально точно отражает патологические и архитектурные особенности исходных опухолей. Предыдущие отчеты с ФДЭ документировали способность платформы отличать хемочувствительные опухоли от хеморезистентных, и было показано, что эта сегрегация является прогностической реакцией пациентов на одну и ту же химиотерапию. Одновременно ФДЭ позволяют исследовать молекулярные, генетические и гистологические особенности опухолей, которые предсказывают реакции на лекарства, тем самым выявляя биомаркеры для стратификации пациентов, а также новые интервенционные подходы к сенсибилизации резистентных опухолей. В этом документе подробно описывается методология ФДЭ, от сбора образцов пациентов до анализа конечных точек. В нем приводится подробное описание методов экстраплантного получения и культивирования, выделяя индивидуальные условия для конкретных опухолей, где это уместно. Для анализа конечных точек основное внимание уделяется мультиплексированной иммунофлуоресценции и мультиспектральной визуализации для пространственного профилирования ключевых биомаркеров как в опухолевых, так и в стромальных областях. Комбинируя эти методы, можно генерировать количественные и качественные данные о лекарственном ответе, которые могут быть связаны с различными клинико-патологическими параметрами и, таким образом, потенциально могут быть использованы для идентификации биомаркеров.

Введение

Разработка эффективных и безопасных противоопухолевых агентов требует соответствующих доклинических моделей, которые также могут дать представление о механизмах действия, которые могут облегчить идентификацию прогностических и фармакодинамических биомаркеров. Известно, что меж- и внутриопухолевая гетерогенность1,2,3,4,5 и TME6,7,8,9,10,11,12 влияют на реакции на противоопухолевые препараты, и многие существующие доклинические модели рака, такие как клеточные линии, органоиды и мышиные модели, не способны полностью приспособиться к этим критическим Функции. «Идеальная» модель — это модель, которая может повторять сложные пространственные взаимодействия злокачественных и незлокачественных клеток в опухолях, а также отражать региональные различия в опухолях. В этой статье основное внимание уделяется PDE как новой платформе, которая может выполнять многие из этих требований13.

Первый пример использования ФДЭ человека, также известный как гистокультуры, относится к концу 1980-х годов, когда Hoffman et al. генерировали срезы свежерезецированных опухолей человека и культивировали их в коллагеновой матрице14,15. Это включало в себя создание системы 3D-культур, которая сохраняла архитектуру тканей, обеспечивая поддержание стромальных компонентов и клеточных взаимодействий в TME. Не деконструируя исходную опухоль, Hoffman et al.16 провозгласили новый подход к трансляционным исследованиям, и с этого времени многие группы оптимизировали различные методы экспланта с целью сохранения целостности тканей и получения точных данных о лекарственном ответе17,18,19,20,21,22,23,24 , хотя некоторые различия между протоколами очевидны. Butler et al. культивировали экспланты в желатиновых губках, чтобы помочь диффузии питательных веществ и лекарств через образец20,21,25,тогда как Majumder et al. создали опухолевую экосистему путем культивирования эксплантов поверх матрицы, состоящей из опухолевых и стромальных белков в присутствии аутологичной сыворотки, полученной от того же пациента22, 23г.

Совсем недавно наша группа установила протокол, в соответствии с которым экспланты генерируются путем фрагментации опухолей на кусочки размером 2 - 3 мм3,которые затем помещаются без дополнительных компонентов на проницаемые мембраны на воздушно-жидкостном интерфейсе культуральной системы24. Взятые вместе, эти многочисленные исследования продемонстрировали, что ФДЭ позволяют культивировать неповрежденные, живые фрагменты опухолей человека, которые сохраняют пространственную архитектуру и региональную гетерогенность исходных опухолей. В оригинальных экспериментах экспланты или гистокультуры обычно подвергали гомогенизации после медикаментозной обработки, после чего к гомогенизированным образцам применяли различные анализы жизнеспособности, такие как анализ реакции на гистокультурные лекарственные средства20,21,анализ МТТ (3-(6)-2,5-дифенилтетразолия бромида), анализ лактатдегидрогеназы или анализ на основе ресазурина26,27,28 . Недавний прогресс в методах анализа конечных точек, особенно цифровой патологии, теперь расширил репертуар тестов и анализов конечных точек, которые могут быть выполнены на эксплантатах29,30. Чтобы применить эти новые технологии, вместо гомогенизации экспланты фиксируются в формалине, встраиваются в парафин (FFPE), а затем анализируются с использованием методов иммуноокрашения, что позволяет пространственное профилирование. Примеры этого подхода были задокументированы для немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ), рака молочной железы, колоректального рака и эксплантов мезотелиомы, при этом иммуногистохимическое окрашивание для маркера пролиферации Ki67 и апоптотического маркера, расщепленной поли-АДФ рибозной полимеразы (cPARP), использовалось для мониторинга изменений в пролиферации клеток и гибели клеток24,31,32,33,34.

Мультиплексированная иммунофлуоресценция особенно поддается пространственному профилированию ответов на лекарственные средства в эксплантатах в конечной точке35. Например, можно измерить релокализацию и пространственное распределение специфических классов иммунных клеток, таких как макрофаги или Т-клетки, в пределах ТМЭ при медикаментозномлечении 13,36,37,38и исследовать, может ли терапевтический агент способствовать переходу от «холодной опухоли» к «горячей опухоли»39. . В последние годы эта группа сосредоточилась на получении ФДЭ из различных типов опухолей (НМРЛ, рак почек, рак молочной железы, колоректальный рак, меланома) и тестировании ряда противоопухолевых агентов, включая химиотерапию, ингибиторы малых молекул и ингибиторы иммунных контрольных точек (ИКИ). Методы анализа конечных точек были оптимизированы для включения мультиплексированной иммунофлуоресценции, чтобы обеспечить пространственное профилирование биомаркеров для жизнеспособности, а также биомаркеров для различных компонентов TME.

протокол

1. Сбор тканей

  1. После операции перенесите свежерезецированные образцы опухоли человека в трубку, содержащую 25 мл свежей питательной среды (модифицированная среда Eagle от Dulbecco, дополненная 4,5 г / л глюкозы и L-глутамина + 1% (v / v) сыворотки для телят плода + 1% пенициллина-стрептомицина) и хранить на льду. Обработайте эксплант в течение 2 ч после операции в стерильной вытяжке класса II.

2. Подготовка Explant

  1. Очистите все хирургическое оборудование (лезвия трансплантата / поверхность зубного воска / пинцет) 70% раствором промышленного метилированного спирта (IMS).
  2. Наполните 10-сантиметровое блюдо для культуры (см. Таблицу материалов)~ 25 мл свежей среды и положите его поверх грядки со льдом.
  3. С помощью пинцета перенесите образец на поверхность зубного воска (см. Таблицу материалов)и нарежьте ткань на фрагменты размером примерно 2–3мм3 с помощью двух лезвий кожного трансплантата.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучшей производительности начните нарезку ткани, чтобы получить индивидуальную полосу толщиной 2-3 мм, а затем разрежьте полосу по длине, чтобы получить окончательные экспланты. Повторяйте процесс до тех пор, пока весь образец не будет измельчен.
  4. Своевременно переложите экспланты в ледяную культуральную среду в 10-сантиметровой посуде. Взять часть эксплантов (6–9 штук), поместить их в пробирку объемом 1 мл, содержащую 10% небуферизованного раствора формалина, и оставить при комнатной температуре (РТ) на 24 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти фрагменты будут представлять контрольные экспланты для «некультурного» состояния.
  5. Заполните нужное количество скважин из 6-луночных плит 1,5 мл свежей среды на скважину и поместите в каждую скважину пластинчатый диск органотипической культуры (см. Таблицу материалов)так, чтобы он плавал поверх среды, тщательно избегая пузырьков воздуха на границе раздела медиа-вставки.
  6. Выберите экспланты случайным образом и поместите их по одному в верхнюю часть диска вставки. Чтобы соответствовать «некультурному» состоянию, используйте 6–9 эксплантов на скважину. Поместите многолуночную пластину в инкубатор CO2 при 37 °C и 5% CO2и дайте эксплантам восстановиться в течение 16 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать раздавливания ткани, настоятельно рекомендуется бережное обращение с пинцетом.

3. Медикаментозное лечение

  1. Через 16 ч берут новые 6-луночные пластины, добавляют 1,5 мл свежей среды в каждую лунку, добавляют соответствующие препараты в желаемых концентрациях и включают лунку для контроля транспортного средства. Используя пинцет, переместите каждую вставку, содержащую экспланты, на вновь подготовленные 6-луночные пластины, содержащие лекарственные средства. Поместите пластины в инкубатор CO2 при 37 °C и 5% CO2 в течение 24–48 ч.
  2. Переместите некультивированные экспланты, ранее зафиксированные в формалине, в гистологическую кассету (см. раздел 4 ниже) и храните в 70% IMS до конца эксперимента.

4. Гистологическая обработка

  1. Фиксация тканей
    1. После лечения препаратом переместите вставные диски, содержащие экспланты, в новые 6-луночные пластины, содержащие 10% формалина, и добавьте несколько капель 10% формалина на верхнюю часть эксплантов, чтобы обеспечить полное покрытие фиксатором.
      ВНИМАНИЕ: Формалин опасен. Избегайте любого контакта с кожей и обрабатывайте ее внутри вытяжной пищи, чтобы предотвратить вдыхание.
    2. Дайте эксплантам остаться на ночь (20–24 ч) в 10% формалине.
    3. На следующий день замочите соответствующее количество мелких гистологических губок в 70% ИМС и поместите их внутрь гистологических кассет. Осторожно перенесите все экспланты из данного состояния лекарственного лечения на одну губку (поддерживайте ориентацию эксплантов таким образом, чтобы стороны эксплантов, контактирующих со вставными дисками, и, следовательно, обработанные препаратом области, были помещены в контакт с губкой). Поместите еще одну предварительно смоченную губку поверх эксплантов и закрепите в гистологической кассете (одна кассета на каждую лунку / обработку).
    4. Погрузите кассеты в 70% IMS и оставьте в RT на 24 ч.
  2. Встраивание парафина и сечение тканей
    1. На следующий день перенесите гистологические кассеты, содержащие экспланты, в корзину образцов тканевого процессора (см. Таблицу материалов)и закрепите крышку. Поместите корзину в реторту и аккуратно закройте. Выберите нужную программу и запустите процессор. Слейте реторту, откройте ее, чтобы снять корзину, и переложите корзину во встраиваемую восковую ванну.
    2. После встраивания переложите крышки металлических кассет в корзину и вернитесь в реторту тканевого процессора для программы очистки. Протрите датчик сухой тканью, удалите лишний воск из крышки реторты и приступайте к программе очистки.
    3. Поместите парафиновый блок во вращающийся микротом, вырежьте несколько секций на 4 мкм и верните блок в лед. Переместите блок и вырежьте более 4 мкм секций. Переложите секции небольшой кистью и щипцами на водяную баню, чтобы удалить складки и пузырьки.
    4. Поместите секции по центру на предметные стекла микроскопа, слейте их в течение нескольких минут и поместите их в стойку для слайдов, чтобы высохнуть в течение ночи в инкубаторе при 37 °C. Когда секции высохнут, храните их в RT в папке для слайдов или коробке для защиты от пыли.

5. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E)

  1. Заполните окрашиватель (см. Таблицу материалов)реагентами, и установите необходимую программу для окрашивания H&E: время инкубации гематоксилина: 5 мин; Время инкубации эозина: 3 мин.
  2. Прикрепите скользящую стойку к держателю, поместите ее в первый контейнер с ксилолом и запустите программу. Снимите держатель слайдов со стойки и отнесите контейнер со стойкой для слайдов в зону монтажа.
  3. Установите слайды с дибутилфталатомсилолом (DPX) под вытяжной вытяжкой. Поместите DPX на каждую крышку и опустите слайд на крышку с секцией вниз, чтобы DPX растянулся.
    ПРИМЕЧАНИЕ: DPX опасен. Избегайте любого контакта с кожей и используйте в специально отведенном вытяжном шкафу.

6. Иммуноокрашивание

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги должны быть выполнены в RT, если не указано иное.

  1. Депарафинизация и регидратация
    1. Поместите слайды в стойку для слайдов и нагрейте при 65 °C в течение 10 минут, прежде чем депарафинизировать участки в ксилоле в течение 3 минут (2x). Минимизируйте количество переносимого раствора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ксилол является легковоспламеняющимся, опасным и раздражающим. Управляйте внутри вытяжного капюшона, используя двухслойные перчатки. Избегайте контакта с кожей и глазами. Утилизируйте отходы в герметичном контейнере.
    2. Регидратируйте слайды в градиенте спирта следующим образом: 99% IMS в течение 1 мин (2x) и 95% IMS в течение 1 мин. Минимизируйте количество переносимого раствора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: IMS является легковоспламеняющимся, летучим и раздражающим. Используйте вытяжной капюшон и избегайте контакта с кожей и глазами.
    3. Полностью опустите стойку для слайдов в сверхчистую (UP) воду на 5 минут.
  2. Извлечение антигена
    1. Подготовьте буфер извлечения антигена в соответствии с рекомендациями производителя для конкретного используемого антитела.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цитратный буфер 0,2 М, рН 6 или трис(гидроксиметил)аминометан (трис)-этилендиамин тетрауксусная кислота (ЭДТА) 0,1 М, рН 9 являются общими буферами, используемыми для кислых или щелочных условий, соответственно. Моногидрат лимонной кислоты и трис являются раздражающими агентами. Подготовьте все стоковые растворы в вытяжном шкафу. Избегайте контакта с кожей и глазами.
    2. Погрузите стойку, содержащую слайды, в буфер извлечения антигена и микроволновую печь (см. Таблицу материалов)на полной мощности (800 Вт) в течение 20 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держите слайды полностью погруженными в буфер в течение всего процесса. Чтобы избежать чрезмерного уменьшения объема буфера, поместите крышку поверх используемого контейнера.
  3. Мультиплексная иммунофлуоресценция (mIF)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс занимает 1–2 дня.
    1. Наполните чистый контейнер 250 мл воды UP и полностью опустите стойку для слайдов на 2 минуты (2x). Приступайте к сборке каждого слайда в пластину крышки слайда (см. Таблицу материалов).
      1. Чтобы собрать горку на крышке, подготовьте стеклянную корыто с водой. Погрузите в воду как крышку, так и горку, поместив участок ткани лицом к крышке.
      2. Расположите нижний край затвора поверх выступов в нижней части крышки и, наконец, выровняйте затвор с крышкой, позволяя воде заполнить зазор между ними без попадания воздуха. Держите крышку и сдвиньте вместе, а затем поместите их в стойку для накладки.
    2. Заполните крышку фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) и подождите, пока буфер смоет слайды, вытекающие под действием силы тяжести (2x). Пипеткой 110 мкл блокирующего буфера (см. Таблицу материалов)на каждую крышку и инкубируют в течение 10 мин.
    3. Подготовьте желаемое первичное разведение антител в PBS или блокирующий буфер в соответствии с рекомендациями производителя. Инкубируйте слайды с первичным антителом (110 мкл с каждым слайдом) в течение 30 мин. Мойте слайды 5 мл PBS (2x), как описано в 6.3.2.
    4. Инкубировать горки со 110 мкл полимера пероксидазы хрена в течение 30 мин. Мойте слайды 5 мл PBS (2x), как описано в 6.3.2.
    5. Приготовьте разбавление флуорофора в разбавителе амплификации 1:100 (v/v) и инкубируйте слайды с флуорофором (110 мкл каждый слайд) в течение 10 мин. Мойте слайды 5 мл PBS (2x), как описано в 6.3.2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для использования флуорофора 780 следуйте рекомендациям производителя. Эксперимент может быть приостановлен здесь, если слайды инкубируются в окончательной промывке PBS и хранятся при 4 °C в течение ночи.
    6. Отсоедините слайды от обложек и вернитесь к этапу извлечения антигена, чтобы начать окрашивание другим антителом. Повторите окрашивание для желаемого количества антител, подлежащих тестированию.
    7. Следуя шагу 6.3.5 для последнего используемого флуорофора, держите слайды на крышках, приготовьте 6 мкМ раствора 4'-6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) дилактата с водой UP и противодействуйте окрашиванию слайдов в течение 5 минут (110 мкл каждого слайда). Промойте горки водой UP (2x) и удалите лишнюю воду, высушив края горок. Соберите крышки на слайдах, используя монтажную среду, и храните в RT в темноте.

7. Сканирование

ПРИМЕЧАНИЕ: Сканирование слайдов выполнялось с использованием мультиспектральной автоматизированной системы визуализации (см. Таблицу материалов).

  1. Соберите слайды в держатель и загрузите их в сканер в нужном порядке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется включить контрольный слайд, в котором при иммуногистохимическом окрашивании не используется флуорофор или DAPI. Этот слайд будет использоваться в качестве контроля для внутренней флуоресценции (аутофлуоресценции (ФП)) ткани.
  2. После запуска программного обеспечения сканера слайдов выберите Изменить протокол на домашней странице. Создайте новый протокол, адресованный имени, режиму визуализации, типу выполняемого мультиспектрального сканирования (4–7 каналов),и исследованию(каталог).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы изменить настройки по умолчанию анализируемых полос, выберите/отмените выбор нужных фильтров с помощью функции Select Scan Bands
  3. Перейдите к разделу Scan Exposure и Load carrierи, наконец, выберите носитель для настройки протокола. Выберите «Обзор», чтобы обнаружить ткань на слайде. Выберите слайд, отображаемый на носителе,и выберите определенную область ткани с помощью красного курсора, чтобы вывести ее в режиме реального времени в левом окне экрана.
  4. Выберите фильтр DAPIи нажмите кнопку автофокусировки или вручную отрегулируйте ползунок «Высота рабочей области», чтобы сфокусировать интересующее поле. Нажмите «Автоэкспозиция», чтобы система могла найти наилучшую экспозицию для этого фильтра / полосы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время экспозиции для каждого фильтра установлено на уровне 12 мс. После автоэкспонирования системы уточните время экспозиции до лучшей оценки. Также можно переопределить значение автоэкспозиции, введя значение вручную в выделенную ячейку.
  5. Повторите описанные выше шаги для всех фильтров в протоколе. При необходимости измените местоположения и/или слайды, чтобы найти наилучшие сигналы для установки экспозиций.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если ткань выделена красным цветом в режиме реального времени, флуоресцентный сигнал анализируемого фильтра насыщается, и автоэкспозиция должна быть повторена.
  6. После того, как настройки экспозиции установлены, нажмите кнопку «Назад» и сохраните протокол. На домашней странице программного обеспечения (см. Таблицу материалов)выберите Сканировать слайды.
  7. Сложите все носители для сканирования в отель Slide Carrierи обратите внимание на порядок слайдов, чтобы присвоить их идентификатор в системе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На экране программного обеспечения каждый носитель будет связан с слотом, содержащим 4 слайда.
  8. Чтобы настроить несколько слайдов с одинаковыми параметрами, нажмите «Настроить задачи»и выберите один или несколько слотов с параметром Using одинаковые правила для одних и тех же слайдов. Как только откроется Редактировать слайды, настройте: Задачи, Исследованиеи Протоколи нажмите OK.
  9. Пометьте каждый слайд, щелкнув значок Слот, и введите имя в ячейку Идентификатор слайда. Нажмите «Сканировать», чтобы начать сканирование.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как только значок слота становится синим, а слайды помечены синей стрелкой, носитель имеет все правила и готов к сканированию. Можно сохранить идентификаторы слайдов, исследования, протоколы и задачи, нажав на кнопку Сохранить настройки.

8. Анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенный ниже протокол иллюстрирует метод анализа фенотипов.

  1. Подготовка изображения
    1. Чтобы подготовить изображения к анализу, откройте программное обеспечение средства просмотра (см. Таблицу материалов)и выберите Загрузить слайды. Выберите нужные сканы для обучающего проекта в правой части экрана.
    2. Для каждого сканирования нажмите штампи выберите Проект в поле Выбрать для: Определите штамп размером 1 x 1 в поле изображения, который будет использоваться позже в качестве шаблона для анализа обучения. Обратите внимание, что эта марка будет помечена красным квадратом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество аннотаций штампов для Проекта является произвольным. Рекомендуется генерировать один для внутреннего флуоресцентного сканирования и еще несколько, которые, как правило, репрезентативны для распределения сигнала в ткани.
    3. Наконец, откройте все сканы эксперимента. Для каждого из них нажмите штамп, и на этот раз выберите опцию Batch в поле Выбрать для: Поместите штамп, ограничивающий каждый эксплант.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этот раз марки будут помечены как зеленые квадраты и потребуются после запуска пакетного анализа. Выберите подходящий размер для марок (1 x 1, 2 x 2, 3 x 3) и избегайте перекрытия штампов, что приведет к дублированию данных в экспортируемом файле.
  2. Анализ обучения
  3. Запустите программу для анализа (см. Таблицу материалов)и создайте новый проект: Выберите Файл | Новые | Проект.
  4. Введите имя в поле Имя проекта и настройте тип проекта.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты проводились с использованием следующих спецификаций: обучаемая сегментация тканей; адаптивная сегментация клеток; фенотипирование.
  5. Загрузите сканы, содержащие штампы для обучения: Файл | Открыть | Изображение. В однорежимном представленииперемещайтесь по изображениям и выбирайте сканы с внутренней флуоресценцией.
  6. Нажмите кнопку автофлуоресценции (AF) и с помощью автофлуоресцентного выборанарисуйте неокрашенную часть ткани. Нажмите «Подготовить изображения», чтобы позволить программному обеспечению вычитать интенсивность внутренней флуоресценции из всех изображений, загруженных для обучения.
  7. Нажмите кнопку «Редактировать маркеры и цвета» и введите имена маркеров в поле, связанное с их флуорофором. Нажмите на шаг Сегмент ткани в верхней части экрана, чтобы открыть окно Тренировка сегментации тканей.
  8. В окне «Категории тканей» введите название категорий тканей, чтобы сегментировать изображения на (например, опухоль, строма, фон, некроз).
  9. В окне «Тренировка сегментации тканей» нажмите кнопку «Нарисовать» и нарисуйте области вокруг групп клеток, чтобы определить интересующую категорию тканей. Например, чтобы определить область опухоли, нарисуйте область вокруг группы опухолевых клеток. Переключитесь на следующую категорию и повторите процесс рисования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется рисовать регионы в большинстве изображений, загруженных для обучения. Также можно уточнить обучение, отредактировав шкалу шаблона и разрешение сегментации, детали которых лучше описаны в руководстве пользователя.
  10. Определив области обучения, переходите к разделу Train the Tissue Segmenter.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В процессе обучения программное обеспечение отображает процент точности сегментации тканей. Для достижения оптимальных результатов рекомендуется, чтобы сегментация тканей была по крайней мере на 90% точной. Как только сегментатор стабилизируется, нажмите кнопку Готово.
  11. Чтобы увидеть маску «Категория тканей» на всех изображениях, нажмите кнопку «Сегментировать все».
  12. После проверки качества сегментации тканей повторно нарисуйте тренировочные области вокруг областей, которые были неправильно классифицированы, и повторно обучите сегментатора тканей до тех пор, пока процесс не будет успешным.
  13. Нажмите на шаг Сегментация ячеек на панели шагов в верхней части окна, чтобы продолжить анализ.
  14. Выберите клеточные компартменты для сегментации: ядра, цитоплазмаи/или мембрана.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку адаптивная сегментация клеток может обнаруживать только клетки с ядерным сигналом, не отменяйте отбор ядер. Хотя также можно сегментировать цитоплазму и / или мембрану, рекомендуется сначала выбрать самый сильный, наиболее распространенный ядерный компонент (например, DAPI).
  15. Настройте ядерный компонент с помощью ползунка «Типичная интенсивность», чтобы настроить пороговое значение, используемое для обнаружения ядерных пикселей. Обратите внимание на открывающееся окно предварительного просмотра, которое обеспечивает обратную связь в реальном времени при настройке порогового значения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот порог является адаптивным и измеряется относительно окружающего фона. Увеличьте это значение, если слишком много фона обнаружено как ядерное. Уменьшите это значение, если слабые ядра пропускаются. Используйте кнопку Показать/Скрыть области, чтобы включить и выключить маски сегментации и проверить, не определены ли правильные пикселы как ядерные.
  16. Чтобы разделить кластеры ядерных пикселей, используйте панель «Разделение ядерных компонентов». Выберите кнопку, которая лучше всего описывает качество окрашивания ядер. Затем используйте ползунок, чтобы настроить чувствительность к расщеплению,имея в виду, что более низкие значения приведут к большему расщеплению.
  17. Нажмите кнопку Сегментировать все, чтобы сегментировать все изображения. Если результат не является точным, измените настройки и переобучайте программное обеспечение до тех пор, пока не будет достигнута удовлетворительная сегментация.
  18. Переходим к последнему шагу анализа: Фенотипированию. На панели «Фенотипы» добавьте список фенотипов, которые необходимо обнаружить, и введите имя в соответствующее текстовое поле. Нажмите кнопку «Редактировать фенотипы», выберите определенную ячейку, чтобы открыть раскрывающееся меню, и выберите соответствующий фенотип.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для обучения классификатора необходимо не менее пяти клеток для каждого фенотипа. Отключение визуализации ядер позволяет лучше визуализировать фенотип клетки, который необходимо назначить.
  19. После того, как выбор для обучения будет завершен, нажмите на кнопку Train Classifier.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение будет классифицировать каждую отдельную клетку на изображении, и всякий раз, когда возникают ошибки в классификации, можно редактировать фенотип клеток и повторять обучение классификатора. Сохраните проект, прежде чем приступить к пакетному анализу, и нажмите «Экспорт» на панели инструментов в верхней части экрана.
  20. Выберите вкладку Анализ Bath в меню слева и загрузите проект в поле Пакетный алгоритм или Проект.
  21. Нажмите «Параметры экспорта», чтобы создать отдельные каталоги для каждого изображения, и с помощью кнопки «Обзор» перейдите, чтобы найти местоположение для экспорта данных. Нажмите на все опции изображений и таблиц для экспорта.
  22. В правой части экрана нажмите «Добавить слайды» и загрузите все изображения, содержащие штампы для ранее подготовленных партий (шаг 7.3). Нажмите кнопку Выполнить, чтобы начать пакетный анализ и обрабатывать по одному штампу за раз, экспортируя соответствующие данные.

Результаты

Мультиспектральная визуализация гистологических срезов, окрашенных mIF, позволяет идентифицировать и фенотипировать отдельные клеточные популяции и идентифицировать опухолевые и стромальные компоненты в эксплантном TME(рисунок 2). Мультиспектральная визуализация осо?...

Обсуждение

В данной работе описываются методы генерации, медикаментозного лечения и анализа ФДЭ и подчеркиваются преимущества платформы как доклинической модельной системы. Культивирование ex vivo свежерезецированной опухоли, которое не предполагает ее деконструкции, позволяет сохранить архите?...

Раскрытие информации

Нечего раскрывать

Благодарности

Мы благодарим хирургов и патологоанатомов в университетских больницах Лестера NHS Trust за предоставление хирургической резецированной опухолевой ткани. Мы также благодарим гистологический центр в рамках Core Biotechnology Services за помощь в обработке тканей и секционировании тканевых блоков FFPE и Kees Straatman за поддержку с использованием Vectra Polaris. Это исследование было поддержано и профинансировано консорциумом Explant, состоящим из четырех партнеров: Университета Лестера, Токсикологического подразделения MRC, Лаборатории терапевтических открытий Рака Великобритании и LifeArc. Дополнительную поддержку оказал Центр экспериментальной онкологической медицины CRUK-NIHR Leicester (C10604/A25151). Финансирование GM, CD и NA было предоставлено программой Breast Cancer Now's Catalyst Program (2017NOVPCC1066), которая поддерживается финансированием Pfizer.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidSigma320099Staining reagent
Antibody Diluent / Block, 1xPerkin ElmerARD1001EAAntibody diluent/blocking buffer
Barnstead NANOpure DiamondBarnsteadUltra Pure (UP) H2O machine
Citric Acid MonohydrateSigma-AldrichC7129Reagent for citrate buffer
Costar Multiple Well Cell Culture PlatesCorning Incorporated35166 multiwell plate
DAPI DilactateLife TechnologiesD3571
100 x 17 mm Dish, Nunclon DeltaThermoFisher Scientific150350100 mm diameter dish for tissue culture
DMEM (1x) Dubelcco's Modified Eagle Medium + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/mL Sodium PyruvateGibco (Life Technologies)10569-010Tissue culture medium (500 mL)
DPX mountantVWR360294HMounting medium
DPX mountantMerck6522Mounting medium
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma-Aldrich3609Reagent for TE buffer
EosinCellPathRBC-0100-00AStaining reagent
Foetal Bovine SerumGibco10500-064For use in tissue culture medium
37% FormaldehydeFisher (Acros)11969001010% Formalin
iGenix, microwave oven IG2095iGenixIG2095Microwave used for antigen retreival
Industrial methylated spirit (IMS)Genta Medical19905099% Industrial Denatured Alcohol (IDA)
InForm Advanced Image Analysis SoftwareAkoya BiosciencesInForm
Leica ASP3000 Tissue ProcessorLeica BiosystemsAutomated Vacuum Tissue Processor
Leica Arcadia H and CLeica BiosystemsEmbedding wax bath
Leica RM2125RTLeica BiosystemsRotary microtome
Leica ST4040 Linear StainerLeica BiosystemsH&E stainer
Mayer's HaematoxylinSigmaGHS132-1LStaining reagent
Millicell Cell Culture Inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µmMerck MiliporePICMORG50Organotypic culture insert disc
Novolink Polymer Detection SystemLeica BiosystemsRE7150-KDAB staining kit
OPAL 480Akoya BiosciencesFP1500001KTFluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 520Akoya BiosciencesFP1487001KTFluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 570Akoya BiosciencesFP1488001KTFluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 620Akoya BiosciencesFP1495001KTFluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 650Akoya BiosciencesFP1496001KTFluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 690Akoya BiosciencesFP1497001KTFluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 780 / OPAL TSA-DIG ReagentAkoya BiosciencesFP1501001KTFluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent and TSA-DIG reagent
Opal Polymer HRP Ms Plus Rb, 1xPerkin ElmerARH1001EAHRP polymer
Penicillin/streptomycin solutionFisher Scientific11548876For use in tissue culture medium
PhenoChart Whole Slide Contextual ViewerAkoya BiosciencesPhenoChartViewer software for scanned images
Phosphate Buffered Saline TabletsThermo Scientific OxoidBR0014GPBS
1x Plus Amplification DiluentPerkin ElmerFP1498Fluorophore diluent
Prolong Diamond Antifade MountantInvitrogenP36961Mounting medium
Slide CarrierPerkin ElmerTo load slides into Slide Carrier Hotel for scanning with Vectra Polaris
Sodium ChlorideFisher ScientificS/3160/6310% Formalin
Sodium Hydroxide pelletsFisher ScientificS/4920/53Reagent for citrate buffer
Tenatex Toughened Wax - Pink (500 g)KEMDENT1-601Dental wax surface
Thermo Scientific Shandon Sequenza Slide Rack for Immunostaining CenterFisher Scientific10098889Holder for slides and slide clips
Thermo Scientific Shandon Plastic CoverplatesFisher Scientific11927774Slide clips
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)Sigma-Aldrich252859Reagent for TE buffer
VectaShieldVecta LaboratoriesH-1000-10Mounting medium
Vectra Polaris Slide ScannerPerkin ElmerVectra PolarisSlide scanner
XyleneGenta MedicalXYL050De-waxing agent

Ссылки

  1. Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. The New England Journal of Medicine. 366 (10), 883-892 (2012).
  2. Jamal-Hanjani, M., et al. Tracking the evolution of non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 376 (22), 2109-2121 (2017).
  3. McGranahan, N., Swanton, C. Biological and therapeutic impact of intratumor heterogeneity in cancer evolution. Cancer Cell. 27 (1), 15-26 (2015).
  4. Casey, T., et al. Molecular signatures suggest a major role for stromal cells in development of invasive breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 114 (1), 47-62 (2009).
  5. Gerdes, M. J., et al. Emerging understanding of multiscale tumor heterogeneity. Frontiers in Oncology. 4, 366 (2014).
  6. Komohara, Y., Takeya, M. CAFs and TAMs: maestros of the tumour microenvironment. The Journal of Pathology. 241 (3), 313-315 (2017).
  7. Miyake, M., et al. CXCL1-mediated interaction of cancer cells with tumor-associated macrophages and cancer-associated fibroblasts promotes tumor progression in human bladder cancer. Neoplasia. 18 (10), 636-646 (2016).
  8. Hisamitsu, S., et al. Interaction between cancer cells and cancer-associated fibroblasts after cisplatin treatment promotes cancer cell regrowth. Human Cell. 32 (4), 453-464 (2019).
  9. Witz, I. P. The tumor microenvironment: the making of a paradigm. Cancer Microenvironment. 2, 9-17 (2009).
  10. Fu, X. T., et al. Tumor-associated macrophages modulate resistance to oxaliplatin via inducing autophagy in hepatocellular carcinoma. Cancer Cell International. 19, 71 (2019).
  11. Chen, D., Zhang, X. Tipping tumor microenvironment against drug resistance. Journal of Oncology Translational Research. 1 (1), 106 (2015).
  12. Roma-Rodrigues, C., Mendes, R., Baptista, P. V., Fernandes, A. R. Targeting tumor microenvironment for cancer therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (4), 840 (2019).
  13. Powley, I. R., et al. Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery. British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).
  14. Freeman, A. E., Hoffman, R. M. In vivo-like growth of human tumors in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 83 (8), 2694-2698 (1986).
  15. Vescio, R., et al. A. al. In vivo-like drug responses of human tumors growing in three-dimensional gel-supported primary culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 84 (14), 5029-5033 (1987).
  16. Hoffman, R. M. 3D Sponge-matrix histoculture: an overview. Methods in Molecular Biology. 1760, 11-17 (2018).
  17. Vescio, R. A., Connors, K. M., Kubota, T., Hoffman, R. M. Correlation of histology and drug response of human tumors grown in native-state three-dimensional histoculture and in nude mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 88 (12), 5163-5166 (1991).
  18. Furukawa, T., Kubota, T., Hoffman, R. M. Clinical applications of the histoculture drug response assay. Clinical Cancer Research. 1 (3), 305-311 (1995).
  19. Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nature Reviews Urology. 10 (8), 483-487 (2013).
  20. Centenera, M. M., et al. Evidence for efficacy of new Hsp90 inhibitors revealed by ex vivo culture of human prostate tumors. Clinical Cancer Research. 18 (13), 3562-3570 (2012).
  21. Dean, J. L., et al. Therapeutic response to CDK4/6 inhibition in breast cancer defined by ex vivo analyses of human tumors. Cell Cycle. 11 (14), 2756-2761 (2012).
  22. Majumder, B., et al. Predicting clinical response to anticancer drugs using an ex vivo platform that captures tumour heterogeneity. Nature Communications. 6, 6169 (2015).
  23. Goldman, A., et al. Temporally sequenced anticancer drugs overcome adaptive resistance by targeting a vulnerable chemotherapy-induced phenotypic transition. Nature Communications. 6, 6139 (2015).
  24. Karekla, E., et al. Ex vivo explant cultures of non-small cell lung carcinoma enable evaluation of primary tumor responses to anticancer therapy. Cancer Research. 77 (8), 2029-2039 (2017).
  25. Ricciardelli, C., et al. Novel ex vivo ovarian cancer tissue explant assay for prediction of chemosensitivity and response to novel therapeutics. Cancer Letters. 421, 51-58 (2018).
  26. Yoshimasu, T., et al. Histoculture drug response assay (HDRA) guided induction concurrent chemoradiotherapy for mediastinal node-positive non-small cell lung cancer. Gan To Kagaku Ryoho. Cancer and chemotherapy. 30 (2), 231-235 (2003).
  27. Pirnia, F., et al. Ex vivo assessment of chemotherapy-induced apoptosis and associated molecular changes in patient tumor samples. Anticancer Research. 26, 1765-1772 (2006).
  28. Maund, S. L., Nolley, R., Peehl, D. M. Optimization and comprehensive characterization of a faithful tissue culture model of the benign and malignant human prostate. Laboratory Investigation. 94 (2), 208-221 (2014).
  29. Vasaturo, A., Galon, J. Multiplexed immunohistochemistry for immune cell phenotyping, quantification and spatial distribution in situ. Methods in Enzymology. 635, 51-66 (2020).
  30. Fuhrman, K., et al. Molecularly guided digital spatial profiling for multiplexed analysis of gene expression with spatial and single cell resolution. Journal of Biomolecular Techniques. 31, 14-15 (2020).
  31. Twiddy, D., et al. A TRAIL-R1-specific ligand in combination with doxorubicin selectively targets primary breast tumour cells for apoptosis. Breast Cancer Research. 12 (1), 58 (2010).
  32. Cai, H., et al. Cancer chemoprevention: Evidence of a nonlinear dose response for the protective effects of resveratrol in humans and mice. Science Translational Medicine. 7 (298), (2015).
  33. Busacca, S., et al. Resistance to HSP90 inhibition involving loss of MCL1 addiction. Oncogene. 35 (12), 1483-1492 (2016).
  34. Kolluri, K. K., et al. Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells. Elife. 7, 30224 (2018).
  35. Toki, M. I., et al. High-plex predictive marker discovery for melanoma immunotherapy-treated patients using digital spatial profiling. Clinical Cancer Research. 25 (18), 5503-5512 (2019).
  36. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
  37. Park, I. J., et al. Prediction of radio-responsiveness with immune-profiling in patients with rectal cancer. Oncotarget. 8 (45), 79793-79802 (2017).
  38. Mezheyeuski, A., et al. Multispectral imaging for quantitative and compartment-specific immune infiltrates reveals distinct immune profiles that classify lung cancer patients. The Journal of Pathology. 244 (4), 421-431 (2018).
  39. Kather, J. N., et al. Topography of cancer-associated immune cells in human solid tumors. Elife. 7, 36967 (2018).
  40. Zollinger, D. R., Lingle, S. E., Sorg, K., Beechem, J. M., Merritt, C. R. GeoMx™ RNA assay: high multiplex, digital, spatial analysis of RNA in FFPE tissue. Methods in Molecular Biology. 2148, 331-345 (2020).
  41. Zugazagoitia, J., et al. Biomarkers associated with beneficial PD-1 checkpoint blockade in non-small cell lung cancer (NSCLC) identified using high-plex digital spatial profiling. Clinical Cancer Research. 26 (16), 4360-4368 (2020).
  42. Allo, B., Lou, X., Bouzekri, A., Ornatsky, O. Clickable and high-sensitivity metal-containing tags for mass cytometry. Bioconjugate Chemistry. 29 (6), 2028-2038 (2018).
  43. Gerdtsson, E., et al. Multiplex protein detection on circulating tumor cells from liquid biopsies using imaging mass cytometry. Convergent Science Physical Oncology. 4 (1), 015002 (2018).
  44. Reck, M., et al. Pembrolizumab versus chemotherapy for PD-L1-positive non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1823-1833 (2016).
  45. Le, D. T., et al. KEYNOTE-164: Phase 2 study of pembrolizumab for patients with previously treated, microsatellite instability-high advanced colorectal carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 34, 3631 (2016).
  46. Diaz, L. A., et al. KEYNOTE-177: Randomized phase III study of pembrolizumab versus investigator-choice chemotherapy for mismatch repair-deficient or microsatellite instability-high metastatic colorectal carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 35, 815 (2017).
  47. Long, G. V., et al. Impact of baseline serum lactate dehydrogenase concentration on the efficacy of pembrolizumab and ipilimumab in patients with advanced melanoma: data from KEYNOTE-006. European Journal of Cancer. 72, 122-123 (2017).
  48. Voong, K. R., Feliciano, J., Becker, D., Levy, B. Beyond PD-L1 testing-emerging biomarkers for immunotherapy in non-small cell lung cancer. Annals of Translational Medicine. 5 (18), 376 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

168

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены