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Resumo

Este artigo descreve métodos para a geração, tratamento medicamentoso e análise de explants derivados do paciente para avaliar as respostas de medicamentos tumorais em um sistema modelo pré-clínico vivo, relevante para o paciente.

Resumo

A compreensão da resistência a medicamentos e o desenvolvimento de novas estratégias para sensibilizar cânceres altamente resistentes dependem da disponibilidade de modelos pré-clínicos adequados que possam prever com precisão as respostas dos pacientes. Uma das desvantagens dos modelos pré-clínicos existentes é a incapacidade de preservar contextualmente o microambiente tumoral humano (TME) e representar com precisão a heterogeneidade intratumoral, limitando assim a tradução clínica dos dados. Em contraste, representando a cultura de fragmentos vivos de tumores humanos, a plataforma de explante derivada do paciente (PDE) permite que as respostas medicamentosas sejam examinadas em um contexto tridimensional (3D) que espelha as características patológicas e arquitetônicas dos tumores originais o mais de perto possível. Relatórios anteriores com PDEs documentaram a capacidade da plataforma de distinguir quimosensitivos de tumores quimorsistantes, e foi demonstrado que essa segregação é preditiva das respostas dos pacientes às mesmas quimoterapias. Simultaneamente, os PDEs permitem a oportunidade de interrogar características moleculares, genéticas e histológicas de tumores que predizem respostas medicamentosas, identificando assim biomarcadores para estratificação do paciente, bem como novas abordagens intervencionistas para sensibilizar tumores resistentes. Este artigo relata em detalhes a metodologia do PDE, desde a coleta de amostras de pacientes até a análise de ponto final. Fornece uma descrição detalhada dos métodos de derivação e cultura explanta, destacando condições sob medida para tumores específicos, quando apropriado. Para análise de ponto final, há um foco em imunofluorescência multiplexada e imagem multiespectral para o perfil espacial de biomarcadores-chave dentro das regiões tumorais e estrômicas. Ao combinar esses métodos, é possível gerar dados quantitativos e qualitativos de resposta a medicamentos que possam estar relacionados a vários parâmetros clínicopatológicos e, portanto, potencialmente utilizados para identificação de biomarcadores.

Introdução

O desenvolvimento de agentes anticancerígenos eficazes e seguros requer modelos pré-clínicos adequados que também possam fornecer insights sobre mecanismos de ação que possam facilitar a identificação de biomarcadores preditivos e farmacodinâmicos. Heterogeneidade inter e intratumor1,2,3,4,5 e o TME6,7,8,9,10,11,12 são conhecidos por influenciar respostas anticancerígenas, e muitos modelos de câncer pré-clínico existentes, como linhas celulares, organoides e modelos de camundongos não são capazes de acomodar totalmente esses modelos cruciais de medicamentos Características. Um modelo "ideal" é aquele que pode recapitular as complexas interações espaciais de malignos com células não malignas dentro dos tumores, bem como refletir as diferenças regionais dentro dos tumores. Este artigo se concentra nos PDEs como uma plataforma emergente que pode cumprir muitos desses requisitos13.

O primeiro exemplo do uso de PDEs humanos, também conhecidos como histoculturas, remonta ao final da década de 1980, quando Hoffman et al. geraram fatias de tumores humanos recém-ressecados e os cultivaram em uma matriz de colágeno14,15. Isso envolveu o estabelecimento de um sistema de cultura 3D que preservasse a arquitetura tecidual, garantindo a manutenção de componentes estrômicos e interações celulares dentro do TME. Sem desconstruir o tumor original, Hoffman et al.16 anunciaram uma nova abordagem da pesquisa translacional, e desde então, muitos grupos otimizaram diferentes métodos de explantamento com o objetivo de preservar a integridade do tecido e gerar dados precisos de resposta a medicamentos17,18,19,20,21,22,23,24 , embora algumas diferenças entre os protocolos sejam evidentes. Butler et al. cultivaram explanações em esponjas de gelatina para ajudar a difusão de nutrientes e medicamentos através do espécime20,21,25, enquanto Majumder et al. criaram um ecossistema tumoral ao cultivar explants em cima de uma matriz composta de tumor e proteínas estrômicas na presença de soro autólogo derivado do mesmo paciente22, 23.

Mais recentemente, nosso grupo criou um protocolo pelo qual as explanações são geradas pela fragmentação de tumores em peças do tamanho de 2 - 3 mm3que são então colocadas sem componentes adicionais em membranas permeáveis na interface ar-líquido de um sistema de cultura24. Juntos, esses inúmeros estudos demonstraram que os PDEs permitem a cultura de fragmentos vivos intactos de tumores humanos que retêm a arquitetura espacial e a heterogeneidade regional dos tumores originais. Em experimentos originais, explanações ou histoculturas eram geralmente submetidas à homogeneização após o tratamento medicamentoso, após os quais vários ensaios de viabilidade foram aplicados às amostras homogeneizadas, tais como o ensaio de resposta a medicamentos de histocultura20,21, o ensaio MTT (3-(6)-2,5-difeniltetrazolium), o ensaio lactato desidrogenase, ou o ensaio baseado em resazurina26,27,28 . Os recentes avanços nas técnicas de análise de endpoint, particularmente a patologia digital, agora ampliaram o repertório de testes de ponto final e ensaios que podem ser realizados em explants29,30. Para aplicar essas novas tecnologias, em vez de homogeneização, as explicações são fixadas em formalina, incorporadas na parafina (FFPE) e depois analisadas utilizando técnicas de imunossuagem, permitindo o perfil espacial. Exemplos dessa abordagem foram documentados para câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), câncer de mama, o câncer colorretal, e as explanações de mesotelioma pelas quais a coloração imunohistoquímica para o marcador de proliferação, Ki67, e o marcador apoptótico, poli-ADP de poli-ADP (cPARP), foi usada para monitorar alterações na proliferação celular e morte celular24,31,32,33,34.

A imunofluorescência multiplexada é particularmente favorável ao perfil espacial das respostas de medicamentos em explantes no pontofinal 35. Por exemplo, é possível medir a relocalização e a distribuição espacial de classes específicas de células imunes, como macrófagos ou células T, dentro do TME após o tratamento medicamentoso13,36,37,38, e investigar se um agente terapêutico pode favorecer a transição de "tumor frio" para "tumor quente"39 . Nos últimos anos, esse grupo se concentrou na derivação de PDEs de diferentes tipos de tumores (NSCLC, câncer de mama, câncer colorretal, melanoma) e no teste de uma série de agentes anticancerígenos, incluindo quimioterapias, inibidores de pequenas moléculas e inibidores de checkpoint imunológico (ICIs). Os métodos de análise de ponto final foram otimizados para incluir imunofluorescência multiplexada para permitir o perfil espacial de biomarcadores para viabilidade, bem como biomarcadores para diferentes constituintes do TME.

Protocolo

1. Coleta de tecidos

  1. Após a cirurgia, transfira amostras de tumor humanos recentemente resseccionadas em um tubo contendo 25 mL de meio de cultura fresca (o meio águia modificado de Dulbecco suplementado com 4,5 g/L de glicose e L-glutamina + 1% (v/v) soro fetal do bezerro + 1% penicilina-estreptomicina) e armazenado no gelo. Processe a explanta dentro de 2h de cirurgia em um capô estéril classe II.

2. Preparaçãode xplant

  1. Limpe todos os equipamentos cirúrgicos (lâminas de enxerto/superfície de cera dentária/pinças) com solução de espírito metilado industrial (IMS) 70%.
  2. Encha um prato de cultura de 10 cm (veja a Tabela de Materiais) com ~25 mL de meio fresco, e coloque-o em cima de uma cama de gelo.
  3. Utilizando pinças, transfira a amostra para uma superfície de cera dentária (ver a Tabela de Materiais),e corte o tecido em fragmentos de aproximadamente 2-3 mm3 usando duas lâminas de enxerto de pele.
    NOTA: Para melhor desempenho, comece a cortar o tecido para obter uma tira individual de 2-3 mm de espessura e, em seguida, corte a tira ao longo do comprimento para obter as explantas finais. Repita o processo até que todo o espécime seja picado.
  4. Transfira as explantes prontamente para o meio de cultura gelada no prato de 10 cm. Pegue uma proporção das explantas (6-9 peças), coloque-as em um tubo de 1 mL contendo 10% da solução de formalina não tamponada e deixe à temperatura ambiente (RT) por 24 h.
    NOTA: Esses fragmentos representarão as explanações de controle para a condição "não culturada".
  5. Encha o número desejado de poços de placas de 6 poços com 1,5 mL de meio fresco por poço, e coloque um disco de inserção de cultura organotípica (veja a Tabela de Materiais) em cada poço para que flutue em cima do meio, evitando cuidadosamente bolhas de ar na interface de inserção de mídia.
  6. Selecione explantas aleatoriamente e coloque-as uma de cada vez em cima do disco de inserção. Para ser consistente com a condição "não culturada", use 6-9 explants por poço. Coloque a placa multiwell em uma incubadora de CO2 a 37 °C e 5% de CO2, e deixe que as explantes se recuperem por 16h.
    NOTA: Para evitar esmagar o tecido, o manuseio suave da pinça é altamente recomendado.

3. Tratamento medicamentoso

  1. Depois de 16 horas, pegue novas placas de 6 poços, adicione 1,5 mL de meio fresco a cada poço, adicione os medicamentos relevantes nas concentrações desejadas e inclua um poço para o controle do veículo. Utilizando a pinça, mova cada inserção contendo as explantas para as placas recém-preparadas de 6 poços contendo as drogas. Coloque as placas na incubadora de CO2 a 37 °C e 5% de CO2 para 24-48 h.
  2. Transfira as explantas não culturadas previamente fixadas em formalina em um de histologia (ver seção 4 abaixo) e armazene em 70% de IMS até o final do experimento.

4. Processamento histológico

  1. Fixação tecidual
    1. Após o tratamento medicamentoso, transfira os discos de inserção contendo as explantas em novas placas de 6 poços contendo 10% de formalina, e adicione algumas gotas de 10% de formalina na parte superior das explants para garantir uma cobertura completa com o fixador.
      ATENÇÃO: A formalina é perigosa. Evite qualquer contato com a pele e manuseie-a dentro de um alimento de fumaça para evitar a inalação.
    2. Deixe que as explantas permaneçam durante a noite (20-24 h) na formalina de 10%.
    3. No dia seguinte, mergulhe o número relevante de pequenas esponjas de histologia em 70% IMS, e coloque-as dentro de de histologia. Transfira suavemente todas as explantas de uma determinada condição de tratamento medicamentoso para uma única esponja (mantenha a orientação das explantas para que as laterais das explantas em contato com os discos de inserção e, portanto, as áreas tratadas com drogas, sejam colocadas em contato com a esponja). Coloque outra esponja pré-colocada em cima das explantas, e fixe dentro de um de histologia (um por bem/tratamento).
    4. Submergir as fitas em 70% IMS, e sair em RT por 24 h.
  2. Incorporação de parafinas e secção de tecidos
    1. No dia seguinte, transfira as fitas de histologia contendo as explantas para a cesta de amostras do processador de tecido (veja a Tabela de Materiais),e proteja a tampa. Coloque a cesta na réplica e feche delicadamente. Selecione o programa desejado e inicie o processador. Escorra a réplica, abra-a para remover a cesta e transfira a cesta para o banho de cera do centro de incorporação.
    2. Após a incorporação, transfira as tampas de de metal para a cesta e retorne à réplica do processador de tecido para o programa de limpeza. Limpe o sensor com um tecido seco, remova qualquer excesso de cera da tampa da réplica e proceda com o programa de limpeza.
    3. Posicione um bloco de parafina no microtome rotativo, corte algumas seções a 4 μm e devolva o bloco ao gelo. Reposicione o bloco e corte mais seções de 4 μm. Transfira as seções com uma pequena escova de tinta e fórceps em um banho de água para remover vincos e bolhas.
    4. Posicione as seções centralmente em slides de microscópio, escorra os slides por alguns minutos e coloque-os em um rack de slides para secar durante a noite em uma incubadora a 37 °C. Quando as seções estiverem secas, armazene-as no RT em uma pasta de slides ou caixa para proteger contra o pó.

5. Hemaoxilina e eosina (H&E) de coloração

  1. Encha o colorador (veja a Tabela de Materiais) com reagentes, e defina o programa necessário para a coloração de H&E: tempo de incubação de hematoxilina: 5 min; tempo de incubação da eosina: 3 min.
  2. Conecte o rack de slides ao porta-malas, coloque-o no primeiro recipiente com xileno e inicie o programa. Remova o porta-slides do rack e leve o recipiente com o rack de slides para a área de montagem.
  3. Monte os slides com xileno de ftalato de dibutílico (DPX) sob a capa de extração. Coloque o DPX em cada deslizamento de cobertura e abaixe o slide na tampa com a seção para baixo, permitindo que o DPX se espalhe.
    NOTA: DPX é perigoso. Evite qualquer contato com a pele e use em um capô de fumaça designado.

6. Imunostaining

NOTA: As seguintes etapas devem ser realizadas na RT, a menos que seja indicado o contrário.

  1. Desparaffinização e reidratação
    1. Coloque os slides em um rack de slides e aqueça a 65 °C por 10 minutos antes de desparafinar as seções em xileno por 3 min (2x). Minimize a quantidade de solução de transporte.
      NOTA: O xileno é inflamável, perigoso e irritante. Manuseie dentro do capô da fumaça enquanto usa luvas de duas camadas. Evite o contato com a pele e o contato visual. Descarte resíduos dentro de um recipiente selado.
    2. Reidratar os slides em um gradiente de álcool da seguinte forma: 99% IMS para 1 min (2x) e 95% IMS por 1 min. Minimize a quantidade de solução de transporte.
      NOTA: O IMS é altamente inflamável, volátil e irritante. Manuseie dentro do capô da fumaça e evite o contato com a pele e o contato visual.
    3. Submergir completamente o rack de lâminas em água ultrauso (UP) por 5 minutos.
  2. Recuperação de antígenos
    1. Prepare o tampão de recuperação de antígeno de acordo com as diretrizes do fabricante para o anticorpo específico utilizado.
      NOTA: Tampão citrato 0,2 M, pH 6 ou tris(hidroximetila)aminometano (Tris)-ácido tetraáctico de etilenodiamina (EDTA) 0,1 M, pH 9, são os tampões comuns utilizados para condições ácidas ou alcalinas, respectivamente. Monohidrato de ácido cítrico e Tris são agentes irritantes. Prepare todas as soluções de estoque no capô da fumaça. Evite contato com a pele e os olhos.
    2. Submergir o rack contendo os slides no tampão de recuperação de antígeno e micro-ondas (ver a Tabela de Materiais) com potência total (800 W) por 20 minutos.
      NOTA: Mantenha os slides totalmente submersos no buffer durante todo o processo. Para evitar uma redução excessiva do volume do buffer, coloque uma tampa em cima do recipiente utilizado.
  3. Imunofluorescência multiplex (mIF)
    NOTA: Este processo leva de 1 a 2 dias.
    1. Encha um recipiente limpo com 250 mL de água UP e submerse completamente o rack de slides por 2 min (2x). Continue montando cada slide em uma placa de cobertura de slides (veja a tabela de materiais).
      1. Para montar um slide em uma placa de cobertura, prepare um cocho de vidro com água. Submerque tanto a placa de cobertura quanto deslize na água, colocando o lado da seção do tecido de frente para a placa de cobertura.
      2. Posicione a borda inferior do slide em cima das protuberâncias na parte inferior da placa de cobertura e, finalmente, alinhe o slide para a placa de cobertura, permitindo que a água preencha a lacuna entre sem ar preso. Segure a placa de cobertura e deslize junto, e coloque-as em um rack de placa de cobertura.
    2. Encha a placa de cobertura com soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) e espere que o buffer lave os slides, fluindo por gravidade (2x). Pipet 110 μL de tampão de bloqueio (ver a Tabela de Materiais) em cada placa de cobertura e incubar por 10 minutos.
    3. Prepare a diluição de anticorpos primário desejada no PBS ou bloqueie o buffer de acordo com as recomendações do fabricante. Incubar os slides com anticorpo primário (110 μL cada slide) por 30 minutos. Lave os slides com 5 mL de PBS (2x), conforme descrito em 6.3.2.
    4. Incubar os slides com 110 μL de polímero de peroxidase de rabanete por 30 min. Lave os slides com 5 mL de PBS (2x), conforme descrito em 6.3.2.
    5. Prepare a diluição do fluoródoto em diluente de amplificação 1:100 (v/v), e incubar os slides com fluoróforo (110 μL cada slide) por 10 minutos. Lave os slides com 5 mL de PBS (2x), conforme descrito em 6.3.2.
      NOTA: Para o uso do fluorohore 780, siga as orientações do fabricante. O experimento pode ser pausado aqui se os slides forem incubados na lavagem final do PBS e armazenados a 4 °C durante a noite.
    6. Despresece os slides das placas de cobertura, e volte para a etapa de recuperação de antígeno para iniciar a coloração com um anticorpo diferente. Repita a coloração para que o número desejado de anticorpos seja testado.
    7. Seguindo a etapa 6.3.5 para o último fluorohore em uso, mantenha os slides nas placas de cobertura, prepare a solução de 6 μM de 4'-6-diamidino-2-fenilôndole (DAPI) dilatação com água UP e contratença os slides por 5 min (110 μL cada slide). Lave os slides com água UP (2x) e remova o excesso de água secando as bordas dos slides. Monte as tampas nos slides usando meio de montagem e armazene no RT no escuro.

7. Digitalização

NOTA: A varredura de slides foi realizada utilizando um sistema de imagem automatizado multiespectral (ver a Tabela de Materiais).

  1. Monte os slides no porta-aviões e carregue-os no scanner na ordem desejada.
    NOTA: Recomenda-se que seja incluído um slide de controle no qual não seja utilizado fluorohore ou DAPI durante a coloração imunohistoquímica. Este slide será usado como controle para florescence intrínseca (autofluorescência (AF)) do tecido.
  2. Depois de iniciar o software do scanner de slides, selecione Editar protocolo na página inicial. Crie um novo protocolo que aborda o nome, modo de imagem,o tipo de varredura multiespectral a ser realizada(4-7 canais)e estude(diretório).
    NOTA: Para modificar as configurações padrão das bandas analisadas, selecione/desmarque os filtros desejados usando a função Selecionar faixas de varredura
  3. Proceda com a operadora de exposição e cargade varredura e, finalmente, selecione a operadora para a configuração do protocolo. Selecione Take Overview para detectar o tecido na lâmina. Escolha um slide exibido no portadore selecione uma área específica do tecido com o cursor vermelho para trazê-lo à vista ao vivo na janela esquerda da tela.
  4. Selecione o filtro DAPIe clique em Foco Automático ou ajuste manualmente o controle deslizante de altura do estágio para focar o campo de interesse. Clique em Autoexpore para permitir que o sistema encontre a melhor exposição para esse filtro/banda.
    NOTA: O tempo de exposição de cada filtro é fixado em 12 ms. Depois de autoexporar o sistema, refine o tempo de exposição para uma estimativa melhor. Também é possível substituir o valor da autoexposição digitando um valor manualmente na célula destacada.
  5. Repita as etapas acima para todos os filtros do protocolo. Se necessário, altere os locais e/ou slides para encontrar os melhores sinais para definir as exposições.
    NOTA: Se o tecido for destacado em vermelho em exibição ao vivo, o sinal fluorescente do filtro analisado está saturado, e a autoexposição deve ser repetida.
  6. Uma vez estabelecidas as configurações de exposição, clique no botão Voltar e Salve o protocolo. Na página inicial do software (ver a tabela de materiais),selecione Digitalizar slides.
  7. Empilhe todas as operadoras a serem digitalizadas no Slide Carrier Hotele tome nota da ordem dos slides para atribuir seu ID ao sistema.
    NOTA: Na tela do software, cada operadora estará relacionada a um slot contendo 4 slides.
  8. Para configurar vários slides com os mesmos parâmetros, clique em Configurar Tarefase selecione um ou mais Slots com a opção Ucantando as mesmas regras para os mesmos slides. Uma vez que os Slides de edição se abram, configure: Tarefas, Estudoe Protocoloe clique em OK.
  9. Rotule cada slide clicando no ícone Slot e digite um nome na célula Slide ID. Clique em Digitalizar para iniciar a varredura.
    NOTA: Uma vez que o ícone slot fique azul e os slides estejam marcados com uma seta azul, o portador tem todas as regras e está pronto para ser escaneado. É possível salvar os IDs de slides, estudos, protocolos e tarefas clicando no botão Salvar configuração.

8. Análise

NOTA: O protocolo abaixo ilustra o método de análise do fenótipo.

  1. Preparação de imagens
    1. Para preparar as imagens para análise, abra o software do visualizador (consulte a Tabela de Materiais)e selecione Deslizars de carga. Selecione as varreduras desejadas para o projeto de treinamento no lado direito da tela.
    2. Para cada varredura, clique em Carimboe escolha Projeto na caixa Selecione para: Defina um selo com tamanho 1 x 1 no campo de imagem a ser usado posteriormente como um modelo para a análise de treinamento. Observe que este selo será marcado como um quadrado vermelho.
      NOTA: O número de anotações de selos para o Projeto é arbitrário. Recomenda-se gerar um para o exame de fluorescência intrínseca e alguns outros que são geralmente representativos da distribuição de sinal dentro do tecido.
    3. Finalmente, abra todos os exames do experimento. Para cada um, clique em Carimbo, e desta vez, escolha a opção Lote na caixa Selecione para: Coloque um carimbo circunscrevendo cada explanta.
      NOTA: Desta vez, os selos serão marcados como quadrados verdes e serão exigidos assim que a análise do lote for lançada. Escolha o tamanho apropriado para os selos (1 x 1, 2 x 2, 3 x 3) e evite a sobreposição dos selos, o que geraria dados duplicados no arquivo exportado.
  2. Análise de treinamento
  3. Inicie o software para análise (veja a Tabela de Materiais),e crie um novo projeto: Selecione Arquivo | Nova | Projeto.
  4. Digite um nome na caixa Nome do Projeto e configure o tipo de projeto.
    NOTA: Os experimentos foram realizados utilizando as seguintes especificações: segmentação de tecidos tretilizáveis; segmentação celular adaptativa; fenotítipo.
  5. Carregue as varreduras contendo os selos para treinamento: Arquivo | | aberto Imagem. Em uma visão de modo único,navegue pelas imagens e selecione as varreduras com fluorescência intrínseca.
  6. Clique no botão Autofluorescência (AF) e com o catador de autofluorescência,desenhe em uma porção não manchada de tecido. Clique em Preparar imagens para permitir que o software subtraia a intensidade da fluorescência intrínseca de todas as imagens enviadas para treinamento.
  7. Clique no botão Editar marcadores e cores e digite os nomes marcadores na caixa associados ao fluoróforo. Clique no passo do tecido do segmento no topo da tela para abrir a janela de treinamento de segmentação de tecidos.
  8. Na janela Categorias de Tecidos, digite o nome das categorias teciduais para segmentar as imagens (por exemplo, Tumor, Estroma, Fundo, Necrose).
  9. Na janela Treinamento de Segmentação de Tecidos, clique no botão Desenhar e desenhe regiões ao redor de grupos de células para definir uma categoria de interesse tecidual. Por exemplo, para definir uma área tumoral, desenhe uma região em torno de um grupo de células tumorais. Mude para a próxima categoria e repita o processo de desenho.
    NOTA: Recomenda-se desenhar regiões na maioria das imagens enviadas para treinamento. Também é possível refinar o treinamento editando a Escala de Padrão e a Resolução de Segmentação cujos detalhes são melhor descritos no manual do usuário.
  10. Tendo definido as regiões de treinamento, prossiga com o Train the Tissue Segmenter.
    NOTA: Durante o processo de treinamento, o software exibe a porcentagem de precisão da segmentação tecidual. Para obter resultados ideais, recomenda-se que a segmentação tecidual seja pelo menos 90% precisa. Uma vez estabilizado o Segmenter, clique no botão Fazer.
  11. Para ver a máscara categoria de tecido em todas as imagens, clique no botão Segment All.
  12. Após verificar a qualidade da segmentação tecidual, resenhe as regiões de treinamento ao redor das áreas classificadas incorretamente e ree treine o Segmentador de Tecidos até que o processo seja bem sucedido.
  13. Clique na etapa de Segmentação celular na Barra de Passo na parte superior da janela para prosseguir com a análise.
  14. Escolha os compartimentos celulares para segmentar: Núcleos, Citoplasmae/ou Membrana.
    NOTA: Como a segmentação celular adaptativa só pode detectar células com sinal nuclear, não dese selecione núcleos. Embora também seja possível segmentar citoplasma e/ou membrana, recomenda-se escolher primeiro o componente nuclear mais forte e abundante (por exemplo, DAPI).
  15. Configure o componente nuclear usando o controle deslizante de intensidade típica para ajustar o limiar usado para detectar pixels nucleares. Tome nota da janela de visualização que abre e fornece feedback ao vivo à medida que o limiar é ajustado.
    NOTA: Este limiar é adaptativo e é medido em relação ao fundo circundante. Aumente esse valor se muito fundo for detectado como nuclear. Abaixe esse valor se núcleos fracos forem perdidos. Use o botão Mostrar/Ocultar regiões para piscar as máscaras de segmentação e verificar se os pixels corretos estão sendo detectados como nucleares.
  16. Para dividir clusters de pixels nucleares, use o painel de divisão de componentes nucleares. Escolha o botão que melhor descreve a qualidade de coloração dos núcleos. Em seguida, use a barra de controle deslizante para ajustar a Sensibilidade de Divisão,tendo em mente que valores mais baixos resultarão em mais divisão.
  17. Clique no botão Segmentar Tudo para segmentar todas as imagens. Se o resultado não for preciso, modifique as configurações e ree treine o software até que uma segmentação satisfatória seja alcançada.
  18. Proceda à última etapa da análise: Fenotipagem. No painel Phenotypes, adicione a lista de fenótipos a serem detectados e digite o nome na caixa de texto correspondente. Clique no botão Editar fenótipos, selecione uma célula específica para criar um menu suspenso e escolha o fenótipo correspondente.
    NOTA: Pelo menos cinco células para cada fenótipo são necessárias para treinar o classificador. Desligar a visualização dos núcleos permite uma melhor visualização do fenótipo celular que precisa ser atribuído.
  19. Quando a seleção para treinamento estiver concluída, clique no botão Classificador de trem.
    NOTA: O software classificará cada célula da imagem e, sempre que ocorrerem erros na classificação, é possível editar o fenótipo das células e repetir o treinamento do classificador. Salve o projeto antes de prosseguir para a análise em lote e clique na barra de exportação na barra de ferramentas na parte superior da tela.
  20. Selecione a guia Análise de banho no menu esquerdo e carregue o projeto na caixa Algoritmo de lote ou Projeto.
  21. Clique em Exportar opções para criar diretórios separados para cada imagem e, com o botão Procurar, navegue para encontrar o local para exportar os dados. Clique em todas as opções das Imagens e Tabelas para exportar.
  22. No lado direito da tela, clique em Adicionar slides e carregue todas as imagens contendo selos para lotes previamente preparados (etapa 7.3). Clique no botão Executar para iniciar a análise do lote e processe um carimbo de cada vez, exportando os dados correspondentes.

Resultados

A imagem multiespectral de seções histológicas manchadas pelo IFM permite a identificação e fenotipagem de populações celulares individuais e identificação de componentes tumorais e estroma na explanação TME (Figura 2). A imagem multiespectral é particularmente útil para a análise de tecidos com alta autofluorescência intrínseca, como tecido com alto teor de colágeno, pois permite que o sinal de autofluorescência seja desconvoluído de outros sinais e excluído da análise ...

Discussão

Este artigo descreve os métodos de geração, tratamento medicamentoso e análise de PDEs e destaca as vantagens da plataforma como um sistema de modelo pré-clínico. A ex-cultura de um tumor recém-ressecado, que não envolve sua desconstrução, permite a retenção da arquitetura tumoral13,24 e, portanto, as interações espaciais dos componentes celulares no TME, bem como a heterogeneidade intratumoral. Este método demonstra como, utilizando um marcador es...

Divulgações

Nada para revelar

Agradecimentos

Agradecemos aos cirurgiões e patologistas dos Hospitais Universitários de Leicester NHS Trust por fornecer tecido tumoral ressecado cirúrgico. Agradecemos também à instalação de Histologia dentro dos Serviços de Biotecnologia Core por ajudar no processamento e secção de tecidos FFPE e Kees Straatman pelo apoio com o uso do Vectra Polaris. Esta pesquisa foi apoiada e financiada pelo Consórcio Explant composto por quatro parceiros: A Universidade de Leicester, a Unidade de Toxicologia da MRC, o Cancer Research UK Therapeutic Discovery Laboratories e o LifeArc. Apoio adicional foi fornecido pelo CRUK-NIHR Leicester Experimental Cancer Medicine Centre (C10604/A25151). O financiamento para GM, CD e NA foi fornecido pelo Programa Catalisador do Câncer de Mama Now (2017NOVPCC1066), que é apoiado por financiamento da Pfizer.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidSigma320099Staining reagent
Antibody Diluent / Block, 1xPerkin ElmerARD1001EAAntibody diluent/blocking buffer
Barnstead NANOpure DiamondBarnsteadUltra Pure (UP) H2O machine
Citric Acid MonohydrateSigma-AldrichC7129Reagent for citrate buffer
Costar Multiple Well Cell Culture PlatesCorning Incorporated35166 multiwell plate
DAPI DilactateLife TechnologiesD3571
100 x 17 mm Dish, Nunclon DeltaThermoFisher Scientific150350100 mm diameter dish for tissue culture
DMEM (1x) Dubelcco's Modified Eagle Medium + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/mL Sodium PyruvateGibco (Life Technologies)10569-010Tissue culture medium (500 mL)
DPX mountantVWR360294HMounting medium
DPX mountantMerck6522Mounting medium
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma-Aldrich3609Reagent for TE buffer
EosinCellPathRBC-0100-00AStaining reagent
Foetal Bovine SerumGibco10500-064For use in tissue culture medium
37% FormaldehydeFisher (Acros)11969001010% Formalin
iGenix, microwave oven IG2095iGenixIG2095Microwave used for antigen retreival
Industrial methylated spirit (IMS)Genta Medical19905099% Industrial Denatured Alcohol (IDA)
InForm Advanced Image Analysis SoftwareAkoya BiosciencesInForm
Leica ASP3000 Tissue ProcessorLeica BiosystemsAutomated Vacuum Tissue Processor
Leica Arcadia H and CLeica BiosystemsEmbedding wax bath
Leica RM2125RTLeica BiosystemsRotary microtome
Leica ST4040 Linear StainerLeica BiosystemsH&E stainer
Mayer's HaematoxylinSigmaGHS132-1LStaining reagent
Millicell Cell Culture Inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µmMerck MiliporePICMORG50Organotypic culture insert disc
Novolink Polymer Detection SystemLeica BiosystemsRE7150-KDAB staining kit
OPAL 480Akoya BiosciencesFP1500001KTFluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 520Akoya BiosciencesFP1487001KTFluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 570Akoya BiosciencesFP1488001KTFluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 620Akoya BiosciencesFP1495001KTFluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 650Akoya BiosciencesFP1496001KTFluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 690Akoya BiosciencesFP1497001KTFluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 780 / OPAL TSA-DIG ReagentAkoya BiosciencesFP1501001KTFluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent and TSA-DIG reagent
Opal Polymer HRP Ms Plus Rb, 1xPerkin ElmerARH1001EAHRP polymer
Penicillin/streptomycin solutionFisher Scientific11548876For use in tissue culture medium
PhenoChart Whole Slide Contextual ViewerAkoya BiosciencesPhenoChartViewer software for scanned images
Phosphate Buffered Saline TabletsThermo Scientific OxoidBR0014GPBS
1x Plus Amplification DiluentPerkin ElmerFP1498Fluorophore diluent
Prolong Diamond Antifade MountantInvitrogenP36961Mounting medium
Slide CarrierPerkin ElmerTo load slides into Slide Carrier Hotel for scanning with Vectra Polaris
Sodium ChlorideFisher ScientificS/3160/6310% Formalin
Sodium Hydroxide pelletsFisher ScientificS/4920/53Reagent for citrate buffer
Tenatex Toughened Wax - Pink (500 g)KEMDENT1-601Dental wax surface
Thermo Scientific Shandon Sequenza Slide Rack for Immunostaining CenterFisher Scientific10098889Holder for slides and slide clips
Thermo Scientific Shandon Plastic CoverplatesFisher Scientific11927774Slide clips
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)Sigma-Aldrich252859Reagent for TE buffer
VectaShieldVecta LaboratoriesH-1000-10Mounting medium
Vectra Polaris Slide ScannerPerkin ElmerVectra PolarisSlide scanner
XyleneGenta MedicalXYL050De-waxing agent

Referências

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