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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieser Beitrag beschreibt Methoden zur Generierung, medikamentösen Behandlung und Analyse von patientenabgeleiteten Explantaten zur Beurteilung von Tumormedikamentenreaktionen in einem lebenden, patientenrelevanten, präklinischen Modellsystem.

Zusammenfassung

Das Verständnis der Arzneimittelresistenz und die Entwicklung neuartiger Strategien zur Sensibilisierung hochresistenter Krebsarten beruhen auf der Verfügbarkeit geeigneter präklinischer Modelle, die das Ansprechen der Patienten genau vorhersagen können. Einer der Nachteile bestehender präklinischer Modelle ist die Unfähigkeit, die menschliche Tumormikroumgebung (TME) kontextuell zu erhalten und die intratumorale Heterogenität genau darzustellen, wodurch die klinische Übersetzung von Daten eingeschränkt wird. Im Gegensatz dazu ermöglicht die PDE-Plattform (Patient Derived Explant) durch die Darstellung der Kultur lebender Fragmente menschlicher Tumoren die Untersuchung von Arzneimittelreaktionen in einem dreidimensionalen (3D) Kontext, der die pathologischen und architektonischen Merkmale der ursprünglichen Tumoren so genau wie möglich widerspiegelt. Frühere Berichte mit PDEs haben die Fähigkeit der Plattform dokumentiert, chemosensitive von chemoresistenten Tumoren zu unterscheiden, und es wurde gezeigt, dass diese Segregation prädiktiv für das Ansprechen von Patienten auf dieselben Chemotherapien ist. Gleichzeitig ermöglichen PDEs die Möglichkeit, molekulare, genetische und histologische Merkmale von Tumoren zu untersuchen, die Arzneimittelreaktionen vorhersagen, wodurch Biomarker für die Patientenstratifizierung sowie neuartige interventionelle Ansätze zur Sensibilisierung resistenter Tumore identifiziert werden. Dieses Papier berichtet ausführlich über die PDE-Methodik, von der Sammlung von Patientenproben bis hin zur Endpunktanalyse. Es enthält eine detaillierte Beschreibung der Explantatableitungs- und Kulturmethoden und hebt gegebenenfalls maßgeschneiderte Bedingungen für bestimmte Tumore hervor. Für die Endpunktanalyse liegt der Schwerpunkt auf der multiplexierten Immunfluoreszenz und der multispektralen Bildgebung für die räumliche Profilierung wichtiger Biomarker sowohl in tumoralen als auch in stromalen Regionen. Durch die Kombination dieser Methoden ist es möglich, quantitative und qualitative Drug-Response-Daten zu generieren, die mit verschiedenen klinisch-pathologischen Parametern in Beziehung gesetzt und somit potenziell für die Identifizierung von Biomarkern verwendet werden können.

Einleitung

Die Entwicklung wirksamer und sicherer Krebsmedikamente erfordert geeignete präklinische Modelle, die auch Einblicke in Wirkmechanismen geben können, die die Identifizierung prädiktiver und pharmakodynamischer Biomarker erleichtern können. Es istbekannt,dass die inter- und intratumorische Heterogenität1,2,3,4,5 und die TME6,7,8,9,10,11 ,12 die Reaktionen auf Krebsmedikamente beeinflussen, und viele bestehende präklinische Krebsmodelle wie Zelllinien, Organoide und Mausmodelle sind nicht in der Lage, diese entscheidenden Funktionen. Ein "ideales" Modell ist eines, das die komplexen räumlichen Interaktionen von malignen mit nicht-malignen Zellen innerhalb von Tumoren rekapitulieren und die regionalen Unterschiede innerhalb von Tumoren widerspiegeln kann. Dieser Artikel konzentriert sich auf PDEs als eine aufstrebende Plattform, die viele dieser Anforderungen erfüllen kann13.

Das erste Beispiel für die Verwendung menschlicher PDEs, auch histokulturen genannt, stammt aus den späten 1980er Jahren, als Hoffman et al. Scheiben von frisch resezierten menschlichen Tumoren erzeugten und in einer Kollagenmatrixkultivierten 14,15. Dies beinhaltete die Etablierung eines 3D-Kultursystems, das die Gewebearchitektur bewahrte und die Aufrechterhaltung der Stromakomponenten und Zellinteraktionen innerhalb der TME sicherstellte. Ohne den ursprünglichen Tumor zu dekonstruieren, läuteten Hoffman et al.16 einen neuen Ansatz der translationalen Forschung ein, und seit dieser Zeit haben viele Gruppen verschiedene Explantatmethoden optimiert, mit dem Ziel, die Gewebeintegrität zu erhalten und genaue Arzneimittelreaktionsdaten zu generieren17,18,19,20,21,22,23,24 , obwohl einige Unterschiede zwischen den Protokollen offensichtlich sind. Butler et al. kultivierten Expflanzen in Gelatineschwämmen, um die Diffusion von Nährstoffen und Medikamenten durch die Probe20,21,25zu unterstützen, während Majumder et al. ein Tumorökosystem schufen, indem sie Explantaten auf einer Matrix kultivierten, die aus Tumor- und Stromalproteinen in Gegenwart von autologem Serum bestand, das vom selben Patienten stammt22, 23.

In jüngerer Zeit hat unsere Gruppe ein Protokoll aufgestellt, bei dem Explantaten durch Fragmentierung von Tumoren in 2 - 3 mm3-großeStücke erzeugt werden, die dann ohne zusätzliche Komponenten auf durchlässigen Membranen an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche eines Kultursystems platziert werden24. Zusammengenommen haben diese zahlreichen Studien gezeigt, dass PDEs die Kultur intakter, lebender Fragmente menschlicher Tumoren ermöglichen, die die räumliche Architektur und regionale Heterogenität der ursprünglichen Tumoren beibehalten. In ursprünglichen Experimenten wurden Explantaten oder Histokulturen in der Regel nach einer medikamentösen Behandlung einer Homogenisierung unterzogen, wonach verschiedene Lebensfähigkeitstests auf die homogenisierten Proben angewendet wurden, wie der Histokultur-Wirkstoff-Response-Assay20,21, der MTT-Assay (3-(6)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid), der Lactatdehydrogenase-Assay oder der Resazurin-basierte Assay26,27,28 . Jüngste Fortschritte bei den Techniken der Endpunktanalyse, insbesondere der digitalen Pathologie, haben nun das Repertoire an Endpunkttests und Assays erweitert, die an Explantaten durchgeführt werden können29,30. Um diese neuen Technologien anzuwenden, werden Explantate anstelle der Homogenisierung in Formalin fixiert, in Paraffin (FFPE) eingebettet und dann mit Immunfärbungstechniken analysiert, was eine räumliche Profilierung ermöglicht. Beispiele für diesen Ansatz wurden für nicht-kleinzelligen Lungenkrebs (NSCLC), Brustkrebs, Darmkrebs und Mesotheliom-Explantaten dokumentiert, wobei die immunhistochemische Färbung für den Proliferationsmarker Ki67 und den apoptotischen Marker, die gespaltene Poly-ADP-Ribose-Polymerase (cPARP), verwendet wurde, um Veränderungen in der Zellproliferation und im Zelltod zu überwachen24,31,32,33,34.

Die multiplexierte Immunfluoreszenz ist besonders geeignet für die räumliche Profilierung von Arzneimittelreaktionen in Explantaten am Endpunkt35. Beispielsweise ist es möglich, die Relokalisierung und räumliche Verteilung bestimmter Klassen von Immunzellen, wie Makrophagen oder T-Zellen, innerhalb der TME bei medikamentöser Behandlung13 , 36,37,38zumessen und zu untersuchen, ob einTherapeutikumden Übergang vom "kalten Tumor" zum "heißen Tumor" begünstigen kann39 . In den letzten Jahren hat sich diese Gruppe auf die Ableitung von PDEs aus verschiedenen Tumorarten (NSCLC, Nierenkrebs, Brustkrebs, Darmkrebs, Melanom) und die Erprobung einer Reihe von Krebsmedikamenten konzentriert, darunter Chemotherapien, niedermolekulare Inhibitoren und Immun-Checkpoint-Inhibitoren (ICIs). Endpunktanalysemethoden wurden optimiert, um die multiplexierte Immunfluoreszenz einzubeziehen, um eine räumliche Profilierung von Biomarkern für die Lebensfähigkeit sowie von Biomarkern für verschiedene Bestandteile der TME zu ermöglichen.

Protokoll

1. Gewebeentnahme

  1. Nach der Operation frisch resezierte menschliche Tumorproben in ein Röhrchen mit 25 ml Frischekulturmedium (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium, ergänzt mit 4,5 g/L Glucose und L-Glutamin + 1% (v/v) fetalem Kälberserum + 1% Penicillin-Streptomycin) und auf Eis gelagert. Verarbeiten Sie die Explantation innerhalb von 2 h nach der Operation in einer sterilen Haube der Klasse II.

2. Explant Vorbereitung

  1. Reinigen Sie alle chirurgischen Geräte (Transplantatklingen / Zahnwachsoberfläche / Pinzette) mit 70% iger industrieller Methylbenzinlösung (IMS).
  2. Füllen Sie eine 10 cm lange Kulturschale (siehe Materialtabelle)mit ~ 25 ml frischem Medium und legen Sie sie auf ein Eisbett.
  3. Übertragen Sie die Probe mit einer Pinzette auf eine Zahnwachsoberfläche (siehe Materialtabelle)und schneiden Sie das Gewebe mit zwei Hauttransplantatklingen in Fragmente von etwa2–3 mm3.
    HINWEIS: Für eine optimale Leistung beginnen Sie mit dem Schneiden des Gewebes, um einen einzelnen Streifen von 2-3 mm Dicke zu erhalten, und schneiden Sie dann den Streifen entlang der Länge, um die endgültigen Explantate zu erhalten. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die gesamte Probe gehackt ist.
  4. Die Explantate zeitnah in das eiskalte Kulturmedium in der 10 cm großen Schale geben. Nehmen Sie einen Teil der Explantate (6-9 Stück), legen Sie sie in ein 1 ml Röhrchen, das 10% nicht gepufferte Formalinlösung enthält, und lassen Sie sie bei Raumtemperatur (RT) für 24 h stehen.
    HINWEIS: Diese Fragmente stellen die Kontrollexplantaten für den "unkultivierten" Zustand dar.
  5. Füllen Sie die gewünschte Anzahl von Vertiefungen mit 6-Well-Platten mit 1,5 ml frischem Medium pro Vertiefung und legen Sie eine organotypische Kultureinlagenscheibe (siehe Materialtabelle)in jede Vertiefung, so dass sie auf dem Medium schwebt und Luftblasen an der Medieneinfügeschnittstelle sorgfältig vermeidet.
  6. Wählen Sie Explantate nach dem Zufallsprinzip aus und legen Sie sie nacheinander auf die Einlegescheibe. Um mit der "unkultivierten" Bedingung konsistent zu sein, verwenden Sie 6-9 Expflanzen pro Brunnen. Legen Sie die Multiwell-Platte in einen CO2 -Inkubator bei 37 °C und5% CO2und lassen Sie die Explantate 16 h lang zurückgewinnen.
    HINWEIS: Um ein Zerquetschen des Gewebes zu vermeiden, wird ein schonender Umgang mit der Pinzette dringend empfohlen.

3. Medikamentöse Behandlung

  1. Nehmen Sie nach 16 h neue 6-Well-Platten, geben Sie 1,5 ml frisches Medium zu jeder Vertiefung hinzu, fügen Sie die relevanten Medikamente in den gewünschten Konzentrationen hinzu und fügen Sie eine Vertiefung für die Fahrzeugsteuerung hinzu. Bewegen Sie mit der Pinzette jeden Einsatz, der die Expflanzen enthält, auf die neu vorbereiteten 6-Well-Platten mit den Medikamenten. Legen Sie die Platten bei37 °C und 5% CO2 für 24–48 h in den CO 2-Inkubator.
  2. Die zuvor in Formalin fixierten unkultivierten Expflanzen werden in eine Histologiekassette (siehe Abschnitt 4 unten) überführt und bis zum Ende des Experiments in 70 % IMS gelagert.

4. Histologische Verarbeitung

  1. Gewebefixierung
    1. Nach der medikamentösen Behandlung die Insert-Discs, die die Explantate enthalten, in neue 6-Well-Platten mit 10% Formalin überführen und einige Tropfen 10% Formalin auf die Oberseite der Explantate geben, um eine vollständige Abdeckung mit dem Fixiermittel zu gewährleisten.
      VORSICHT: Formalin ist gefährlich. Vermeiden Sie jeglichen Kontakt mit der Haut und behandeln Sie sie in einem Rauchfutter, um ein Einatmen zu verhindern.
    2. Lassen Sie die Explantate über Nacht (20–24 h) im 10% igen Formalin verbleiben.
    3. Am nächsten Tag die relevante Anzahl kleiner Histologieschwämme in 70% IMS einweichen und in Histologiekassetten legen. Übertragen Sie vorsichtig alle Explantate aus einem bestimmten medikamentösen Behandlungszustand auf einen einzigen Schwamm (behalten Sie die Ausrichtung der Explantate bei, so dass die Seiten der Explantate in Kontakt mit den Insert-Discs und damit die mit Medikamenten behandelten Bereiche mit dem Schwamm in Kontakt gebracht werden). Legen Sie einen weiteren vorgesaugten Schwamm auf die Explantate und befestigen Sie ihn in einer Histologiekassette (eine Kassette pro Vertiefung / Behandlung).
    4. Tauchen Sie die Kassetten in 70% IMS und lassen Sie sie bei RT für 24 h stehen.
  2. Paraffineinbettung und Gewebeschnitt
    1. Am folgenden Tag die Histologiekassetten mit den Explantaten in den Probenkorb des Gewebeprozessors (siehe Materialtabelle)überführen und den Deckel sichern. Legen Sie den Korb in die Retorte und schließen Sie ihn vorsichtig. Wählen Sie das gewünschte Programm aus und starten Sie den Prozessor. Lassen Sie die Retorte abtropfen, öffnen Sie sie, um den Korb zu entfernen, und geben Sie den Korb in das Einbettungszentrum Wachsbad.
    2. Nach dem Einbetten die Metallkassettendeckel in den Korb geben und für das Reinigungsprogramm in die Retorte des Tissue-Prozessors zurückkehren. Wischen Sie den Sensor mit einem trockenen Tuch ab, entfernen Sie überschüssiges Wachs aus dem Retortendeckel und fahren Sie mit dem Reinigungsprogramm fort.
    3. Positionieren Sie einen Paraffinblock im rotierenden Mikrotom, schneiden Sie einige Abschnitte bei 4 μm und bringen Sie den Block wieder auf Eis. Positionieren Sie den Block neu und schneiden Sie weitere 4 μm-Abschnitte. Übertragen Sie die Abschnitte mit einem kleinen Pinsel und einer Pinzette auf ein Wasserbad, um Falten und Blasen zu entfernen.
    4. Positionieren Sie die Schnitte mittig auf Objektträgern, lassen Sie die Objektträger einige Minuten ablaufen und legen Sie sie in ein Objektträgergestell, um sie über Nacht in einem Inkubator bei 37 ° C zu trocknen. Wenn die Abschnitte trocken sind, lagern Sie sie bei RT in einem Dia-Ordner oder einer Box, um sie vor Staub zu schützen.

5. Hämatoxylin- und Eosin (H&E)-Färbung

  1. Füllen Sie den Färber (siehe Materialtabelle)mit Reagenzien und stellen Sie das erforderliche Programm für die H & E-Färbung ein: Hämatoxylin-Inkubationszeit: 5 min; Eosin Inkubationszeit: 3 min.
  2. Befestigen Sie das Schiebegestell am Träger, legen Sie es in den ersten Behälter mit Xylol und starten Sie das Programm. Entfernen Sie den Schieberträger aus dem Rack und bringen Sie den Behälter mit dem Schiebegestell in den Montagebereich.
  3. Montieren Sie die Objektträger mit Dibutylphthalat-Xylol (DPX) unter der Absaughaube. Legen Sie DPX auf jeden Deckglas und senken Sie den Schieber mit dem Abschnitt nach unten auf den Deckglas, damit sich der DPX ausbreiten kann.
    HINWEIS: DPX ist gefährlich. Vermeiden Sie jeglichen Hautkontakt und verwenden Sie ihn in einem dafür vorgesehenen Abzug.

6. Immunfärbung

HINWEIS: Die folgenden Schritte sollten bei RT durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben.

  1. Deparaffinisierung und Rehydratation
    1. Legen Sie die Dias in ein Diagestell und erhitzen Sie sie bei 65 °C für 10 min, bevor Sie die Abschnitte für 3 min (2x) in Xylol entparaffinisieren. Minimieren Sie die Menge der Verschleppungslösung.
      HINWEIS: Xylol ist brennbar, gefährlich und reizend. Griff in der Abzugshaube, während Sie doppellagige Handschuhe verwenden. Vermeiden Sie Haut- und Augenkontakt. Entsorgen Sie den Abfall in einem versiegelten Behälter.
    2. Rehydrieren Sie die Objektträger in einem Alkoholgradienten wie folgt: 99% IMS für 1 min (2x) und 95% IMS für 1 min. Minimieren Sie die Menge der Verschleppungslösung.
      HINWEIS: IMS ist leicht entzündlich, flüchtig und reizend. Griff in den Abzug und Vermeiden Sie Haut- und Augenkontakt.
    3. Tauchen Sie das Schiebegestell 5 Minuten lang vollständig in hochreinem (UP) Wasser ein.
  2. Antigen-Retrieval
    1. Bereiten Sie den Antigen-Retrieval-Puffer gemäß den Richtlinien des Herstellers für den jeweiligen verwendeten Antikörper vor.
      ANMERKUNG: Citratpuffer 0,2 M, pH 6 oder Tris(Hydroxymethyl)aminomethan (Tris)-ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) 0,1 M, pH 9 sind die üblichen Puffer, die für saure bzw. alkalische Bedingungen verwendet werden. Zitronensäuremonohydrat und Tris sind Reizstoffe. Bereiten Sie alle Lagerlösungen im Abzug vor. Vermeiden Sie den Kontakt mit Haut und Augen.
    2. Tauchen Sie das Rack mit den Objektträgern in den Antigen-Retrieval-Puffer und die Mikrowelle (siehe Materialtabelle)bei voller Leistung (800 W) für 20 Minuten.
      HINWEIS: Halten Sie die Folien während des gesamten Vorgangs vollständig im Puffer untergetaucht. Um eine übermäßige Reduzierung des Puffervolumens zu vermeiden, legen Sie einen Deckel auf den verwendeten Behälter.
  3. Multiplex-Immunfluoreszenz (mIF)
    HINWEIS: Dieser Vorgang dauert 1–2 Tage.
    1. Füllen Sie einen sauberen Behälter mit 250 ml UP-Wasser und tauchen Sie das Schiebegestell für 2 min (2x) vollständig ein. Fahren Sie mit dem Zusammenbau jedes Objektträgers zu einer Diadeckplatte fort (siehe Tabelle der Materialien).
      1. Um einen Schlitten auf einer Deckplatte zusammenzusetzen, bereiten Sie einen Glastrog mit Wasser vor. Tauchen Sie sowohl die Deckplatte als auch den Gleiter in das Wasser und legen Sie den Gewebeabschnitt seitlich auf die Deckplatte.
      2. Positionieren Sie die untere Kante des Objektträgers oben auf den Ausstülpungen an der Unterseite der Deckplatte und richten Sie den Schlitten schließlich an der Abdeckplatte aus, so dass das Wasser den Spalt dazwischen füllen kann, ohne dass Luft eingeschlossen ist. Halten Sie die Abdeckplatte zusammen und schieben Sie sie zusammen und legen Sie sie in ein Abdeckplattengestell.
    2. Füllen Sie die Deckplatte mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und warten Sie, bis der Puffer die durch Schwerkraft (2x) abfließenden Objektträger gewaschen hat. Pipet 110 μL Blockierpuffer (siehe Tabelle der Materialien)auf jede Deckplatte und inkubieren Sie für 10 min.
    3. Bereiten Sie die gewünschte primäre Antikörperverdünnung in PBS oder Blockierpuffer gemäß den Empfehlungen des Herstellers vor. Inkubieren Sie die Objektträger mit primärem Antikörper (110 μL pro Objektträger) für 30 min. Waschen Sie die Objektträger mit 5 ml PBS (2x), wie in 6.3.2 beschrieben.
    4. Die Objektträger mit 110 μL Meerrettichperoxidase-Polymer für 30 min inkubieren. Waschen Sie die Objektträger mit 5 ml PBS (2x), wie in 6.3.2 beschrieben.
    5. Die Fluorophorverdünnung in Amplifikationsverdünner 1:100 (v/v) vorbereiten und die Objektträger mit Fluorophor (110 μL pro Objektträger) für 10 min inkubieren. Waschen Sie die Objektträger mit 5 ml PBS (2x), wie in 6.3.2 beschrieben.
      HINWEIS: Befolgen Sie für die Verwendung von Fluorophor 780 die Richtlinien des Herstellers. Das Experiment kann hier unterbrochen werden, wenn die Objektträger in der letzten Wäsche von PBS inkubiert und über Nacht bei 4 °C gelagert werden.
    6. Lösen Sie die Objektträger von den Deckplatten und kehren Sie zum Antigen-Retrieval-Schritt zurück, um die Färbung mit einem anderen Antikörper zu beginnen. Wiederholen Sie die Färbung für die gewünschte Anzahl von Antikörpern, die getestet werden sollen.
    7. Halten Sie nach Schritt 6.3.5 für das letzte verwendete Fluorophor die Objektträger auf den Deckplatten, bereiten Sie eine 6-μM-Lösung mit 4'-6-Diamidino-2-phenylindolat (DAPI) -Dilactat mit UP-Wasser vor und halten Sie die Objektträger für 5 min (110 μL pro Objektträger) auf. Waschen Sie die Objektträger mit UP-Wasser (2x) und entfernen Sie überschüssiges Wasser, indem Sie die Ränder der Objektträger trocknen. Montieren Sie die Deckgläser auf den Dias mit einem Montagemedium und lagern Sie sie bei RT im Dunkeln.

7. Scannen

HINWEIS: Das Scannen von Objektträgern wurde mit einem multispektralen automatisierten Bildgebungssystem durchgeführt (siehe Materialtabelle).

  1. Montieren Sie die Dias in den Träger und legen Sie sie in der gewünschten Reihenfolge in den Scanner ein.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, einen Kontrollobjektträger beizufügen, in dem während der immunhistochemischen Färbung kein Fluorophor oder DAPI verwendet wird. Dieser Objektträger wird als Kontrolle für die intrinsische Blüte (Autofluoreszenz (AF)) des Gewebes verwendet.
  2. Nachdem Sie die Diascanner-Software gestartet haben, wählen Sie auf der Startseite Protokoll bearbeiten aus. Erstellen Sie ein neues Protokoll, das sich mit dem Namen, dem Bildgebungsmodus, der Art des durchzuführenden multispektralen Scans (4–7 Kanäle) und der Studie (Verzeichnis) befasst.
    HINWEIS: Um die Standardeinstellungen der analysierten Bänder zu ändern, aktivieren/deaktivieren Sie die gewünschten Filter mit der Funktion Scanbänder auswählen
  3. Fahren Sie mit Scan Exposure und Load Carrierfort und wählen Sie schließlich den Carrier für die Protokolleinrichtung aus. Wählen Sie Übersicht übernehmen, um das Gewebe auf dem Objektträger zu erkennen. Wählen Sie eine Folie, die auf dem Trägerangezeigt wird, und wählen Sie einen bestimmten Bereich des Gewebes mit dem roten Cursor aus, um ihn im linken Fenster des Bildschirms in die Live-Ansicht zu bringen.
  4. Wählen Sie den DAPI-Filteraus und klicken Sie auf Autofokus oder passen Sie den Schieberegler Bühnenhöhe manuell an, um das Interessengebiet zu fokussieren. Klicken Sie auf Autoexpose, damit das System die beste Belichtung für diesen Filter / dieses Band finden kann.
    HINWEIS: Die Belichtungszeit für jeden Filter ist auf 12 ms eingestellt. Nachdem Sie das System automatisch belichtet haben, verfeinern Sie die Belichtungszeit auf eine bessere Schätzung. Es ist auch möglich, den Autobelichtungswert zu überschreiben, indem Sie einen Wert manuell in die markierte Zelle eingeben.
  5. Wiederholen Sie die obigen Schritte für alle Filter im Protokoll. Ändern Sie bei Bedarf die Positionen und/oder Dias, um die besten Signale für die Einstellung der Belichtungen zu finden.
    HINWEIS: Wenn das Gewebe in der Live-Ansicht rot hervorgehoben ist, ist das Fluoreszenzsignal des analysierten Filters gesättigt und die Autobelichtung muss wiederholt werden.
  6. Sobald die Belichtungseinstellungen festgelegt wurden, klicken Sie auf die Schaltfläche Zurück und speichern Sie das Protokoll. Wählen Sie auf der Software-Homepage (siehe Materialtabelle) dieOption Folien scannenaus.
  7. Stapeln Sie alle zu scannenden Träger in das Slide Carrier Hotelund notieren Sie sich die Reihenfolge der Dias, um ihre ID dem System zuzuweisen.
    HINWEIS: Auf dem Softwarebildschirm wird jeder Träger mit einem Steckplatz mit 4 Dias verknüpft.
  8. Um mehrere Folien mit den gleichen Parametern zu konfigurieren, klicken Sie auf Tasks konfigurierenund wählen Sie einen oder mehrere Slots mit der Option Using the same rules for the same slides. Sobald die Folien bearbeiten geöffnet ist, konfigurieren Sie: Aufgaben, Studieund Protokoll, und klicken Sie auf OK.
  9. Beschriften Sie jede Folie, indem Sie auf das Symbol Steckplatz klicken, und geben Sie einen Namen in die Zelle Folien-ID ein. Klicken Sie auf Scannen, um den Scanvorgang zu starten.
    HINWEIS: Sobald das Slot-Symbol blau wird und die Dias mit einem blauen Pfeil markiert sind, hat der Träger alle Regeln und kann gescannt werden. Es ist möglich, die Folien-IDs, Studien, Protokolle und Aufgaben zu speichern, indem Sie auf die Schaltfläche Setup speichern klicken.

8. Würdigung

HINWEIS: Das folgende Protokoll veranschaulicht die Methode zur Phänotypanalyse.

  1. Bildvorbereitung
    1. Um die Bilder für die Analyse vorzubereiten, öffnen Sie die Viewer-Software (siehe Materialtabelle)und wählen Sie Folien laden. Wählen Sie auf der rechten Seite des Bildschirms die gewünschten Scans für das Trainingsprojekt aus.
    2. Klicken Sie für jeden Scan auf Stempelund wählen Sie Projekt im Feld Auswählen für: Definieren Sie einen Stempel mit der Größe 1 x 1 im Bildfeld, der später als Vorlage für die Trainingsanalyse verwendet werden soll. Beachten Sie, dass dieser Stempel als rotes Quadrat markiert wird.
      HINWEIS: Die Anzahl der Stempelanmerkungen für das Projekt ist beliebig. Es wird empfohlen, einen für den intrinsischen Fluoreszenzscan und einige weitere zu erzeugen, die im Allgemeinen repräsentativ für die Signalverteilung innerhalb des Gewebes sind.
    3. Öffnen Sie schließlich alle Scans des Experiments. Klicken Sie für jeden einzelnen auf Stempel, und wählen Sie diesmal die Option Stapel im Feld Auswählen für: Platzieren Sie einen Stempel, der jede Expflanze umschreibt.
      HINWEIS: Diesmal werden die Stempel als grüne Quadrate markiert und sind erforderlich, sobald die Chargenanalyse gestartet ist. Wählen Sie die geeignete Größe für die Briefmarken (1 x 1, 2 x 2, 3 x 3) und vermeiden Sie Überlappungen der Stempel, die doppelte Daten in der exportierten Datei erzeugen würden.
  2. Trainingsanalyse
  3. Starten Sie die Software für die Analyse (siehe Tabelle der Materialien)und erstellen Sie ein neues Projekt: Wählen Sie Datei | Neue | Projekt.
  4. Geben Sie einen Namen in das Feld Projektname ein, und konfigurieren Sie den Projekttyp.
    ANMERKUNG: Die Experimente wurden unter Verwendung der folgenden Spezifikationen durchgeführt: trainierbare Gewebesegmentierung; adaptive Zellsegmentierung; Phänotypisierung.
  5. Laden Sie die Scans mit den Stempeln für das Training: Datei | | öffnen Bild. Navigieren Sie in der Singlemode-Ansichtdurch die Bilder und wählen Sie die Scans mit intrinsischer Fluoreszenz aus.
  6. Klicken Sie auf die Schaltfläche Autofluoreszenz (AF) und zeichnen Sie mit der Autofluoreszenz-Auswahlauf einen nicht gefärbten Teil des Gewebes. Klicken Sie auf Bilder vorbereiten, damit die Software die Intensität der intrinsischen Fluoreszenz von allen zum Training hochgeladenen Bildern subtrahieren kann.
  7. Klicken Sie auf die Schaltfläche Markierungen und Farben bearbeiten und geben Sie die Markernamen in das Feld ein, das mit ihrem Fluorophor verknüpft ist. Klicken Sie auf den Schritt Gewebe segmentieren oben auf dem Bildschirm, um das Fenster Gewebesegmentierungstraining zu öffnen.
  8. Geben Sie im Fenster Gewebekategorien den Namen der Gewebekategorien ein, in die die Bilder unterteilt werden sollen (z. B. Tumor, Stroma, Hintergrund, Nekrose).
  9. Klicken Sie im Fenster Gewebesegmentierungstraining auf die Schaltfläche Zeichnen und zeichnen Sie Regionen um Zellgruppen, um eine Gewebekategorie von Interesse zu definieren. Um beispielsweise einen Tumorbereich zu definieren, zeichnen Sie eine Region um eine Gruppe von Tumorzellen. Wechseln Sie zur nächsten Kategorie und wiederholen Sie den Zeichenvorgang.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, in den meisten Bildern, die für das Training hochgeladen wurden, Regionen zu zeichnen. Es ist auch möglich, das Training zu verfeinern, indem Sie die Musterskala und die Segmentierungsauflösung bearbeiten, deren Details im Benutzerhandbuch besser beschrieben sind.
  10. Nachdem Sie die Trainingsregionen definiert haben, fahren Sie mit Train the Tissue Segmenterfort.
    HINWEIS: Während des Trainingsprozesses zeigt die Software den Prozentsatz der Genauigkeit der Gewebesegmentierung an. Für optimale Ergebnisse wird empfohlen, dass die Gewebesegmentierung mindestens 90% genau ist. Sobald sich der Segmenter stabilisiert hat, klicken Sie auf die Schaltfläche Fertig.
  11. Um die Gewebekategorie-Maske auf allen Bildern anzuzeigen, klicken Sie auf die Schaltfläche Alle segmentieren.
  12. Nachdem Sie die Qualität der Gewebesegmentierung überprüft haben, zeichnen Sie die Trainingsregionen um die Bereiche, die falsch klassifiziert wurden, neu und trainieren Sie den Tissue Segmenter neu, bis der Prozess erfolgreich ist.
  13. Klicken Sie auf den Schritt Zellsegmentierung in der Schrittleiste oben im Fenster, um mit der Analyse fortzufahren.
  14. Wählen Sie die zellularen Kompartimente, um sie zu segmentieren: Kerne, Zytoplasmaund / oder Membran.
    HINWEIS: Da die adaptive Zellsegmentierung nur Zellen mit Kernsignal erkennen kann, sollten Sie die Kerne nicht auswählen. Obwohl es auch möglich ist, Zytoplasma und/oder Membran zu segmentieren, wird empfohlen, zuerst die stärkste und am häufigsten vorkommende Kernkomponente (z. B. DAPI) zu wählen.
  15. Konfigurieren Sie die Kernkomponente mit dem Schieberegler Typische Intensität, um den Schwellenwert anzupassen, der zum Erkennen von Kernpixeln verwendet wird. Beachten Sie das Vorschaufenster, das sich öffnet und Live-Feedback gibt, wenn der Schwellenwert angepasst wird.
    HINWEIS: Dieser Schwellenwert ist adaptiv und wird relativ zum umgebenden Hintergrund gemessen. Erhöhen Sie diesen Wert, wenn zu viel Hintergrund als nuklear erkannt wird. Senken Sie diesen Wert, wenn schwache Kerne übersehen werden. Verwenden Sie die Schaltfläche Ein-/Ausblenden von Bereichen, um die Segmentierungsmasken ein- und auszublenden und zu überprüfen, ob die richtigen Pixel als nuklear erkannt werden.
  16. Um Cluster von Kernpixeln zu teilen, verwenden Sie das Bedienfeld "Kernkomponentenaufteilung". Wählen Sie die Schaltfläche, die die Färbequalität der Kerne am besten beschreibt. Verwenden Sie dann den Schieberegler, um die Teilungsempfindlichkeitanzupassen, wobei zu beachten ist, dass niedrigere Werte zu einer stärkeren Aufteilung führen.
  17. Klicken Sie auf die Schaltfläche Alle segmentieren, um alle Bilder zu segmentieren. Wenn das Ergebnis nicht korrekt ist, ändern Sie die Einstellungen und trainieren Sie die Software neu, bis eine zufriedenstellende Segmentierung erreicht ist.
  18. Fahren Sie mit dem letzten Schritt der Analyse fort: Phänotypisierung. Fügen Sie im Bedienfeld "Phänotypen" die Liste der zu erkennenden Phänotypen hinzu, und geben Sie den Namen in das entsprechende Textfeld ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Phänotypen bearbeiten, wählen Sie eine bestimmte Zelle aus, um ein Dropdown-Menü aufzurufen, und wählen Sie den entsprechenden Phänotyp aus.
    HINWEIS: Mindestens fünf Zellen für jeden Phänotyp sind notwendig, um den Klassifikator zu trainieren. Das Ausschalten der Visualisierung der Kerne ermöglicht eine bessere Visualisierung des Zellphänotyps, der zugewiesen werden muss.
  19. Sobald die Auswahl für das Training abgeschlossen ist, klicken Sie auf die Schaltfläche Train Classifier.
    HINWEIS: Die Software klassifiziert jede einzelne Zelle im Bild, und wann immer Fehler in der Klassifizierung auftreten, ist es möglich, den Phänotyp der Zellen zu bearbeiten und das Training des Klassifikators zu wiederholen. Speichern Sie das Projekt, bevor Sie mit der Stapelanalyse fortfahren, und klicken Sie in der Symbolleiste oben auf dem Bildschirm auf Exportieren.
  20. Wählen Sie im linken Menü die Registerkarte Bath-Analyse aus, und laden Sie das Projekt in das Feld Batch-Algorithmus oder Projekt.
  21. Klicken Sie auf Exportoptionen, um separate Verzeichnisse für jedes Bild zu erstellen, und navigieren Sie mit der Schaltfläche Durchsuchen, um den Speicherort für den Export der Daten zu finden. Klicken Sie auf alle Optionen der zu exportierenden Bilder und Tabellen.
  22. Klicken Sie auf der rechten Seite des Bildschirms auf Folien hinzufügen und laden Sie alle Bilder, die Stempel für zuvor vorbereitete Stapel enthalten (Schritt 7.3). Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um die Stapelanalyse zu starten und einen Stempel nach dem anderen zu verarbeiten und die entsprechenden Daten zu exportieren.

Ergebnisse

Die multispektrale Bildgebung von mIF-gefärbten histologischen Schnitten ermöglicht die Identifizierung und Phänotypisierung einzelner Zellpopulationen sowie die Identifizierung von Tumor- und Stromakomponenten im explantierten TME (Abbildung 2). Die multispektrale Bildgebung ist besonders nützlich für die Analyse von Geweben mit hoher intrinsischer Autofluoreszenz, wie z. B. Gewebe mit hohem Kollagengehalt, da sie es ermöglicht, das Autofluoreszenzsignal von anderen Signalen zu entpac...

Diskussion

Dieser Beitrag beschreibt die Methoden zur Erzeugung, medikamentösen Behandlung und Analyse von PDEs und beleuchtet die Vorteile der Plattform als präklinisches Modellsystem. Die Ex-vivo-Kultivierung eines frisch resezierten Tumors, die keine Dekonstruktion beinhaltet, ermöglicht die Beibehaltung der Tumorarchitektur13,24 und damit der räumlichen Wechselwirkungen zellulärer Komponenten in der TME sowie der intratumoralen Heterogenität. Diese Methode zeigt, ...

Offenlegungen

Nichts zu enthüllen

Danksagungen

Wir danken den Chirurgen und Pathologen des University Hospitals of Leicester NHS Trust für die Bereitstellung von chirurgisch reseziertem Tumorgewebe. Wir danken auch der Histology-Einrichtung innerhalb von Core Biotechnology Services für die Hilfe bei der Gewebeverarbeitung und dem Schneiden von FFPE-Gewebeblöcken und Kees Straatman für die Unterstützung bei der Verwendung des Vectra Polaris. Diese Forschung wurde vom Explant Consortium unterstützt und finanziert, das aus vier Partnern besteht: der University of Leicester, der MRC Toxicology Unit, den Cancer Research UK Therapeutic Discovery Laboratories und LifeArc. Zusätzliche Unterstützung kam vom CRUK-NIHR Leicester Experimental Cancer Medicine Centre (C10604/A25151). Die Finanzierung für GM, CD und NA wurde durch das Catalyst-Programm von Breast Cancer Now (2017NOVPCC1066) bereitgestellt, das durch Eine Finanzierung von Pfizer unterstützt wird.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidSigma320099Staining reagent
Antibody Diluent / Block, 1xPerkin ElmerARD1001EAAntibody diluent/blocking buffer
Barnstead NANOpure DiamondBarnsteadUltra Pure (UP) H2O machine
Citric Acid MonohydrateSigma-AldrichC7129Reagent for citrate buffer
Costar Multiple Well Cell Culture PlatesCorning Incorporated35166 multiwell plate
DAPI DilactateLife TechnologiesD3571
100 x 17 mm Dish, Nunclon DeltaThermoFisher Scientific150350100 mm diameter dish for tissue culture
DMEM (1x) Dubelcco's Modified Eagle Medium + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/mL Sodium PyruvateGibco (Life Technologies)10569-010Tissue culture medium (500 mL)
DPX mountantVWR360294HMounting medium
DPX mountantMerck6522Mounting medium
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma-Aldrich3609Reagent for TE buffer
EosinCellPathRBC-0100-00AStaining reagent
Foetal Bovine SerumGibco10500-064For use in tissue culture medium
37% FormaldehydeFisher (Acros)11969001010% Formalin
iGenix, microwave oven IG2095iGenixIG2095Microwave used for antigen retreival
Industrial methylated spirit (IMS)Genta Medical19905099% Industrial Denatured Alcohol (IDA)
InForm Advanced Image Analysis SoftwareAkoya BiosciencesInForm
Leica ASP3000 Tissue ProcessorLeica BiosystemsAutomated Vacuum Tissue Processor
Leica Arcadia H and CLeica BiosystemsEmbedding wax bath
Leica RM2125RTLeica BiosystemsRotary microtome
Leica ST4040 Linear StainerLeica BiosystemsH&E stainer
Mayer's HaematoxylinSigmaGHS132-1LStaining reagent
Millicell Cell Culture Inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µmMerck MiliporePICMORG50Organotypic culture insert disc
Novolink Polymer Detection SystemLeica BiosystemsRE7150-KDAB staining kit
OPAL 480Akoya BiosciencesFP1500001KTFluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 520Akoya BiosciencesFP1487001KTFluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 570Akoya BiosciencesFP1488001KTFluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 620Akoya BiosciencesFP1495001KTFluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 650Akoya BiosciencesFP1496001KTFluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 690Akoya BiosciencesFP1497001KTFluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 780 / OPAL TSA-DIG ReagentAkoya BiosciencesFP1501001KTFluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent and TSA-DIG reagent
Opal Polymer HRP Ms Plus Rb, 1xPerkin ElmerARH1001EAHRP polymer
Penicillin/streptomycin solutionFisher Scientific11548876For use in tissue culture medium
PhenoChart Whole Slide Contextual ViewerAkoya BiosciencesPhenoChartViewer software for scanned images
Phosphate Buffered Saline TabletsThermo Scientific OxoidBR0014GPBS
1x Plus Amplification DiluentPerkin ElmerFP1498Fluorophore diluent
Prolong Diamond Antifade MountantInvitrogenP36961Mounting medium
Slide CarrierPerkin ElmerTo load slides into Slide Carrier Hotel for scanning with Vectra Polaris
Sodium ChlorideFisher ScientificS/3160/6310% Formalin
Sodium Hydroxide pelletsFisher ScientificS/4920/53Reagent for citrate buffer
Tenatex Toughened Wax - Pink (500 g)KEMDENT1-601Dental wax surface
Thermo Scientific Shandon Sequenza Slide Rack for Immunostaining CenterFisher Scientific10098889Holder for slides and slide clips
Thermo Scientific Shandon Plastic CoverplatesFisher Scientific11927774Slide clips
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)Sigma-Aldrich252859Reagent for TE buffer
VectaShieldVecta LaboratoriesH-1000-10Mounting medium
Vectra Polaris Slide ScannerPerkin ElmerVectra PolarisSlide scanner
XyleneGenta MedicalXYL050De-waxing agent

Referenzen

  1. Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. The New England Journal of Medicine. 366 (10), 883-892 (2012).
  2. Jamal-Hanjani, M., et al. Tracking the evolution of non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 376 (22), 2109-2121 (2017).
  3. McGranahan, N., Swanton, C. Biological and therapeutic impact of intratumor heterogeneity in cancer evolution. Cancer Cell. 27 (1), 15-26 (2015).
  4. Casey, T., et al. Molecular signatures suggest a major role for stromal cells in development of invasive breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 114 (1), 47-62 (2009).
  5. Gerdes, M. J., et al. Emerging understanding of multiscale tumor heterogeneity. Frontiers in Oncology. 4, 366 (2014).
  6. Komohara, Y., Takeya, M. CAFs and TAMs: maestros of the tumour microenvironment. The Journal of Pathology. 241 (3), 313-315 (2017).
  7. Miyake, M., et al. CXCL1-mediated interaction of cancer cells with tumor-associated macrophages and cancer-associated fibroblasts promotes tumor progression in human bladder cancer. Neoplasia. 18 (10), 636-646 (2016).
  8. Hisamitsu, S., et al. Interaction between cancer cells and cancer-associated fibroblasts after cisplatin treatment promotes cancer cell regrowth. Human Cell. 32 (4), 453-464 (2019).
  9. Witz, I. P. The tumor microenvironment: the making of a paradigm. Cancer Microenvironment. 2, 9-17 (2009).
  10. Fu, X. T., et al. Tumor-associated macrophages modulate resistance to oxaliplatin via inducing autophagy in hepatocellular carcinoma. Cancer Cell International. 19, 71 (2019).
  11. Chen, D., Zhang, X. Tipping tumor microenvironment against drug resistance. Journal of Oncology Translational Research. 1 (1), 106 (2015).
  12. Roma-Rodrigues, C., Mendes, R., Baptista, P. V., Fernandes, A. R. Targeting tumor microenvironment for cancer therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (4), 840 (2019).
  13. Powley, I. R., et al. Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery. British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).
  14. Freeman, A. E., Hoffman, R. M. In vivo-like growth of human tumors in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 83 (8), 2694-2698 (1986).
  15. Vescio, R., et al. A. al. In vivo-like drug responses of human tumors growing in three-dimensional gel-supported primary culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 84 (14), 5029-5033 (1987).
  16. Hoffman, R. M. 3D Sponge-matrix histoculture: an overview. Methods in Molecular Biology. 1760, 11-17 (2018).
  17. Vescio, R. A., Connors, K. M., Kubota, T., Hoffman, R. M. Correlation of histology and drug response of human tumors grown in native-state three-dimensional histoculture and in nude mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 88 (12), 5163-5166 (1991).
  18. Furukawa, T., Kubota, T., Hoffman, R. M. Clinical applications of the histoculture drug response assay. Clinical Cancer Research. 1 (3), 305-311 (1995).
  19. Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nature Reviews Urology. 10 (8), 483-487 (2013).
  20. Centenera, M. M., et al. Evidence for efficacy of new Hsp90 inhibitors revealed by ex vivo culture of human prostate tumors. Clinical Cancer Research. 18 (13), 3562-3570 (2012).
  21. Dean, J. L., et al. Therapeutic response to CDK4/6 inhibition in breast cancer defined by ex vivo analyses of human tumors. Cell Cycle. 11 (14), 2756-2761 (2012).
  22. Majumder, B., et al. Predicting clinical response to anticancer drugs using an ex vivo platform that captures tumour heterogeneity. Nature Communications. 6, 6169 (2015).
  23. Goldman, A., et al. Temporally sequenced anticancer drugs overcome adaptive resistance by targeting a vulnerable chemotherapy-induced phenotypic transition. Nature Communications. 6, 6139 (2015).
  24. Karekla, E., et al. Ex vivo explant cultures of non-small cell lung carcinoma enable evaluation of primary tumor responses to anticancer therapy. Cancer Research. 77 (8), 2029-2039 (2017).
  25. Ricciardelli, C., et al. Novel ex vivo ovarian cancer tissue explant assay for prediction of chemosensitivity and response to novel therapeutics. Cancer Letters. 421, 51-58 (2018).
  26. Yoshimasu, T., et al. Histoculture drug response assay (HDRA) guided induction concurrent chemoradiotherapy for mediastinal node-positive non-small cell lung cancer. Gan To Kagaku Ryoho. Cancer and chemotherapy. 30 (2), 231-235 (2003).
  27. Pirnia, F., et al. Ex vivo assessment of chemotherapy-induced apoptosis and associated molecular changes in patient tumor samples. Anticancer Research. 26, 1765-1772 (2006).
  28. Maund, S. L., Nolley, R., Peehl, D. M. Optimization and comprehensive characterization of a faithful tissue culture model of the benign and malignant human prostate. Laboratory Investigation. 94 (2), 208-221 (2014).
  29. Vasaturo, A., Galon, J. Multiplexed immunohistochemistry for immune cell phenotyping, quantification and spatial distribution in situ. Methods in Enzymology. 635, 51-66 (2020).
  30. Fuhrman, K., et al. Molecularly guided digital spatial profiling for multiplexed analysis of gene expression with spatial and single cell resolution. Journal of Biomolecular Techniques. 31, 14-15 (2020).
  31. Twiddy, D., et al. A TRAIL-R1-specific ligand in combination with doxorubicin selectively targets primary breast tumour cells for apoptosis. Breast Cancer Research. 12 (1), 58 (2010).
  32. Cai, H., et al. Cancer chemoprevention: Evidence of a nonlinear dose response for the protective effects of resveratrol in humans and mice. Science Translational Medicine. 7 (298), (2015).
  33. Busacca, S., et al. Resistance to HSP90 inhibition involving loss of MCL1 addiction. Oncogene. 35 (12), 1483-1492 (2016).
  34. Kolluri, K. K., et al. Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells. Elife. 7, 30224 (2018).
  35. Toki, M. I., et al. High-plex predictive marker discovery for melanoma immunotherapy-treated patients using digital spatial profiling. Clinical Cancer Research. 25 (18), 5503-5512 (2019).
  36. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
  37. Park, I. J., et al. Prediction of radio-responsiveness with immune-profiling in patients with rectal cancer. Oncotarget. 8 (45), 79793-79802 (2017).
  38. Mezheyeuski, A., et al. Multispectral imaging for quantitative and compartment-specific immune infiltrates reveals distinct immune profiles that classify lung cancer patients. The Journal of Pathology. 244 (4), 421-431 (2018).
  39. Kather, J. N., et al. Topography of cancer-associated immune cells in human solid tumors. Elife. 7, 36967 (2018).
  40. Zollinger, D. R., Lingle, S. E., Sorg, K., Beechem, J. M., Merritt, C. R. GeoMx™ RNA assay: high multiplex, digital, spatial analysis of RNA in FFPE tissue. Methods in Molecular Biology. 2148, 331-345 (2020).
  41. Zugazagoitia, J., et al. Biomarkers associated with beneficial PD-1 checkpoint blockade in non-small cell lung cancer (NSCLC) identified using high-plex digital spatial profiling. Clinical Cancer Research. 26 (16), 4360-4368 (2020).
  42. Allo, B., Lou, X., Bouzekri, A., Ornatsky, O. Clickable and high-sensitivity metal-containing tags for mass cytometry. Bioconjugate Chemistry. 29 (6), 2028-2038 (2018).
  43. Gerdtsson, E., et al. Multiplex protein detection on circulating tumor cells from liquid biopsies using imaging mass cytometry. Convergent Science Physical Oncology. 4 (1), 015002 (2018).
  44. Reck, M., et al. Pembrolizumab versus chemotherapy for PD-L1-positive non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1823-1833 (2016).
  45. Le, D. T., et al. KEYNOTE-164: Phase 2 study of pembrolizumab for patients with previously treated, microsatellite instability-high advanced colorectal carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 34, 3631 (2016).
  46. Diaz, L. A., et al. KEYNOTE-177: Randomized phase III study of pembrolizumab versus investigator-choice chemotherapy for mismatch repair-deficient or microsatellite instability-high metastatic colorectal carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 35, 815 (2017).
  47. Long, G. V., et al. Impact of baseline serum lactate dehydrogenase concentration on the efficacy of pembrolizumab and ipilimumab in patients with advanced melanoma: data from KEYNOTE-006. European Journal of Cancer. 72, 122-123 (2017).
  48. Voong, K. R., Feliciano, J., Becker, D., Levy, B. Beyond PD-L1 testing-emerging biomarkers for immunotherapy in non-small cell lung cancer. Annals of Translational Medicine. 5 (18), 376 (2017).

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