μTongue: פלטפורמת הדמיה פונקציונלית מבוססת מיקרופלואידיקה עבור הלשון ב- Vivo

Summary

המאמר מציג את מכשיר μTongue (microfluidics-on-a-tongue) להדמיית תאי טעם פונקציונליים ב- vivo על ידי שילוב מיקרופלואידיקה בחלון הדמיה תוך-וינטלי על הלשון.

Abstract

מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות תוך-וינטלית היא כלי המשמש באופן נרחב לחקר דינמיקה רב-תאית בחיה חיה. עם זאת, זה לא נעשה שימוש מוצלח באיבר החושי טעם. על ידי שילוב מיקרופלואידיקה בחלון הדמיית הלשון התוך-ויטלי, ה- μTongue מספק תמונות פונקציונליות אמינות של תאי טעם ב- vivo תחת חשיפה מבוקרת לטעמים מרובים. במאמר זה מוצג הליך מפורט שלב אחר שלב לשימוש במערכת μTongue. קיימות חמש סעיפים: הכנת פתרונות טעימים, הקמת מודול מיקרופלואידי, הרכבה לדוגמה, רכישת נתוני תמונה פונקציונליים וניתוח נתונים. כמה טיפים וטכניקות כדי לפתור את הבעיות המעשיות שעלולות להתעורר בעת שימוש μTongue מוצגים גם.

Introduction

מיקרוסקופ פלואורסצנטיות תוך-וינטלית נמצא בשימוש נרחב כדי לחקור את הדינמיקה השופעת על רקמות חיות. חוקרים מפתחים במהירות חיישנים מקודדים גנטית המספקים טרנספורמציות ספציפיות ורגישות של התהליכים הביולוגיים לאותות פלואורסצנטיות - אשר ניתן להקליט בקלות באמצעות מיקרוסקופים פלואורסצנטיים הזמינים באופן נרחב^1,2. למרות שרוב האיברים הפנימיים במכרסמים נחקרו באמצעות המיקרוסקופ, היישום המוצלח שלה ללשון עדיין לא הצליח³.

מחקרים קודמים על הדמיית סידן של תאי טעם נערכו ex vivo על ידי חתך דק של רקמת לשון כדי לקבל בלוטות טעם להקיף^4,5,⁶ או על ידי קילוף אפיתל הטעם כדי להשיג^{בלוטות טעם}פטרייתיות^7,8. הכנת דגימות אלה הייתה פולשנית באופן בלתי נמנע, ולכן המיקרו-סביבה הטבעית כגון פנימיות העצבים, מחסומי החן וזרימת הדם, היו מוטרדות במידה רבה. חלון הדמיית הלשון התוך-ויטלי הראשון דווח בשנת 2015 על ידי Choi et al., אך הקלטה פונקציונלית אמינה לא הייתה ברת השגה בגלל התנועה וממצאים אופטיים הנגרמים על ידי גירויים טעימים נוזלים⁹.

לאחרונה, microfluidics-על-לשון (μTongue) הוצג¹⁰. התקן זה משלב מערכת מיקרופלואידית עם חלון הדמיה על לשון העכבר. על-ידי השגת זרימה מעין-יציבה-יציבה של גירויים טעימים לאורך כל תקופת ההדמיה, ניתן היה למזער חפצים מתנועה נוזלית (איור 1). יציאת הקלט ניזונה מסדרה של בקרי לחץ רב-ערוציים, בעוד שיציאת הפלט מחוברת למשאבת מזרק, השומרת על 0.3 מ"ל/דקה. בנוסף, ממצאים אופטיים שנגרמו על ידי ההבדל במדדים שבירה של פתרונות טעימים צומצמו על ידי ניתוח יחסי המציג אינדיקטור סידן חסר רגישות (tdTomato) כמו גם מחוון סידן (GCaMP6)¹¹. עיצוב זה סיפק יציבות מיקרוסקופית של תאי טעם ב- vivo אפילו עם מעבר פתאומי בין ערוצים נוזליים. כתוצאה מכך, μTongue ליישם הקרנה פונקציונלית אמינה של tastants מרובים בלוטות הטעם של העכבר ב vivo.

בפרוטוקול זה, ההליכים הניסיוניים מוסברים בפירוט עבור הדמיית סידן של בלוטות הטעם פטריות העכבר ב vivo באמצעות μTongue. ראשית, הכנת רוק מלאכותי ופתרונות טעימים מתוארת. שנית, הקמת המערכת המיקרופלואידית להשגת זרימת מצב מעין-יציבה מוצגת. שלישית, ההליכים המשמשים להרכבה של לשון העכבר על μTongue כדי לאפשר רכישת תמונה הם מתויגים. לבסוף, כל שלב לניתוח תמונה, כולל תיקון של ממצאי תנועה לרוחב ויחס, מצוין. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בקלות לכל מעבדת מחקר עם מתקן עכבר ומיקרוסקופ שני פוטון או ציוד שווה ערך.

Protocol

כל ההליכים הכירורגיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) של אוניברסיטת סונגקיונקוואן והאוניברסיטה הלאומית של סיאול.

1. הכנת פתרונות: רוק מלאכותי וטרסמים

1. הכן רוק מלאכותי על ידי המסת 2 מ"מ NaCl, 5 mM KCl, 3 mM NaHCO₃, 3 mM KHCO₃, 0.25 מ"מ CaCl₂, 0.25 מ"מ MgCl₂, 0.12 מ"מ K₂HPO₄, 0.12 מ"מ KH₂PO₄, ו 1.8 mM HCl במים מזוקקים (>1 L), ולהתאים את ה- pH של הפתרון ל 7 (ראה טבלת חומרים)¹².
2. הכן טעים, כגון חמוץ: 10 mM חומצת לימון; מלוח: 400 mM NaCl, אופציונלי עם 50 מיקרומטר אמילורי; מתוק: 40 מ"מ אצסולפאם K; מריר: תערובת של 5 mM כינין, 5 mM denatonium ו 20 μM cycloheximide, על ידי המסת כימי הטעימה ברוק מלאכותי מוכן בשלב 1.1.

2. הכנת המערכת המיקרופלואידית

הערה: פריטים טעימים הועברו ללשון העכבר באמצעות מערכת משלוח נוזלית רב-ערוצית בלחץ (עיין באיור 1 ובטבלת החומרים).

1. מלאו את המאגרים של מערכת זלוף הזרימה בלחץ ברוק מלאכותי וטסמים.
2. חבר את קו האוויר הדחוס לקלט הווסת והגדר את לחץ האוויר בין 30 ל -50 פסאיי במערכת האספקה הנוזלית.
3. הגדר את לחץ הפלט של הרגולטור ל 0.4 פסאיי ולבדוק אם נוזל יוצא מהצינור תחת לחץ זה.
4. חבר את הסעפת מהמאגרים ליציאת הקלט של μTongue.
5. חבר את יציאת הפלט של μTongue למשאבת מזרק ולמשוך נוזל עם ~ 300 μL∙min^-1 כדי לקבוע את מצב יציב. שימו לב לנפח הקבוע של טיפה תלויה מתחת ל-μTongue. התאם את הערך של פרמטר ההגדרה בהתאם לגובה הדוגמה.
6. נתק את קו האוויר הדחוס והפסק את משאבת המזרק עד להשלמת שלב 3 של הפרוטוקול.

3. הכנת עכבר להדמיית ויוו (איור 2).

הערה: כל ההכנות לבעלי חיים בוצעו בשעות היום בתנאים אספטיים על שולחן עבודה במעבדה.

1. הרדמה של עכבר
   1. הכן עכבר בן 7 שבועות או מבוגר משני המינים. השתמש בקו עכבר מהונדס גנטית המבטא חלבוני פלואורסצנטיות חישת סידן בתאי הטעם.
   2. העכבר מרוסן להרדמה. תערובת של 100 מ"ג/ק"ג קטמין ו 10 מ"ג/ק"ג קסילאצין מוזרק תוך-איפריטונית לעכבר¹³.
2. TRITC-dextran (500 kDa) ב 2.5% W / V תמיסת מלח פוספט הוא administrated תוך ורידי לתוך העכבר דרך מסלול רטרו-מסלולית כדי לצפות במחזור הדם במהלך מפגש הדמיה.
3. חבר מתקן ראש על גולגולת העכבר כדי למזער את חפצי התנועה.
   1. ראש העכבר מרוסס ב- 70% ETOH בזמן שהעכבר ממוקם במצב על-גוף. הרם את העור ראש קלות עם מלקחיים ולגזור כ 7 מ"מ² עם מספריים.
   2. נקו את השיער סביב הקרקפת, הסירו את ה- periosteum מתחת לעור, החל דבק מיידי על הגולגולת וחיברו מתקן ראש מותאם אישית.
   3. לאחר הדבקה מיידית הוא התקשה, להחיל דבק דנטלי סביב מתקן הראש ולהאיר עם אור כחול כדי לחזק את הדבק הדנטלי.
4. מקם את לשון העכבר על היחידה התחתונה של μTongue.
   1. חבר את השפה התחתונה של העכבר ליחידה התחתונה של μTongue עם דבק מיידי.
   2. הניחו את העכבר על הלוח (לוח הכנת העכבר באיור 1B) והכניסו את היחידה התחתונה של ה-μTongue לעמדות (עמדת אחיזה של μTongue באיור 1B). ודא כי החורים בקצה היחידה התחתונה מיושרים לעמדה.
   3. הדק את מתקן ראש העכבר למחזיק מתקן הראשים בלוח. לאחר מכן, התאם את המרחק בין ראש העכבר להתקן. סובב את ראש העכבר בצורה חלקה בערך 45° באמצעות מחזיק מתקן הראש. תהליך זה מונע מגע פיזי של אף העכבר עם מטרת מיקרוסקופ.
   4. צייר את לשון העכבר בעדינות באמצעות פינצטה מפלסטיק וחבר את הצד הגחון של הלשון לצד העליון של היחידה התחתונה של ה- μTongue. לאחר מכן, לנגב את פני השטח של לשון העכבר עם צמר גפן רטוב.
   5. השרו פיסת נייר ברוק המלאכותי ומניחים אותה על המשטח החשוף של לשון העכבר כדי לשמור על מצב רטוב.
   6. הנח את מכונות הכביסה המעוקלות על העמודים המכילים את שני קצות החלק התחתון של μTongue.
5. הנח את הכנת העכבר על במת המיקרוסקופ. מקם את לשון העכבר החשופה מתחת למרכז המשוער של האזור האובייקטיבי של המיקרוסקופ. הקפד לא לסטות מהטווח הדינמי של הבמה. לאחר מכן, הדק את לוח העכבר על הבמה עם ברגים.
6. מניחים את כרית החימום מתחת לגוף העכבר ולשמור על הטמפרטורה ב 36 °C (37 °F) °C (5 °F) נטר את טמפרטורת גוף העכבר באמצעות חיישן טמפרטורה ושלט בטמפרטורת כרית החימום באמצעות אות משוב מחיישן הטמפרטורה.
7. לסובב פיסת נייר דקה ומניחים אותה בפתח העכבר כדי למנוע מהנוזל להיכנס קנה הנשימה של העכבר.
8. הסר את הרקמה הרטובה מלשון העכבר והניח את μTongue מוכן על לשון העכבר. שים ערוץ microfluidic על הלשון ולהתאים את המיקום שלה כדי לצפות את פני השטח של הלשון דרך חלון ההדמיה.
9. אבטחו את ה-μTongue על ידי הברגה עדינה בשני הקצוות בלחץ דחיסה מינימלי.

4. רכישת הדמיה

1. הפעל את לייזר 920 ננומטר שני פוטון ואת המיקרוסקופ לפני השימוש.
2. הר את המטרה טבילת מים (16x, NA 0.80 או 25x, NA 1.1) על המיקרוסקופ. זרוק את המים המזוקקים על חלון ההדמיה של μTongue ולטבול את המטרה.
3. במצב מצלמה, הפעל את האור באמצעות מנורת כספית והאיר את פני הלשון.
4. על-ידי התאמת ציר Z, חפשו באות ההפללה האוטומטית מהפיפילה הקליפורמית כדי למצוא את מישור המוקד המשוער. לאחר מכן, באמצעות ידית ההתאמה X ו- Y, אתר בלוטות טעם.
5. עבור למצב מולטיפוט. הגדר את תנאי רכישת התמונה כדלקמן: אורך גל עירור: 920 ננומטר; סט מסנני פליטה: 447/60 ננומטר, 525/50 ננומטר ו- 607/70 ננומטר; מצב סריקת רסטר דו-כיווני, גודל מסגרת: 512 x 512.
6. כווננו את מיקומי X ו- Y כדי למקם את בלוטות הטעם במרכז חלון התמונה.
7. חפש בכלי הדם המקיפים את בלוטות הטעם בערך בגובה של כשני שלישים של בלוטות הטעם. דמיינו את זרימת הדם על ידי הזרקת TRITC-dextran (500 kDa) מהפרוטוקול שלב 3.2. אם זרימת הדם קבקבים, לשחרר את ברגי תיקון מעט כדי לאפשר זרימת דם.
8. התאם את ציר Z ומצא את מישור Z של בלוטות הטעם המכיל מספר מספיק של תאי טעם.
9. המשך הדמיית סידן עם 2-6 הרץ עבור 80 s. ספק פתרון טעם של 20 s על ידי הפעלת המאגר של המערכת הנוזלית לאחר תחילת ההדמיה. לאחר 20 s של גירוי טעם, להעביר את המאגר בחזרה לרוק מלאכותי.
10. לאחר סיום ההדמיה הריציפה, המתן כ-3-4 דקות מראש למפגש ההדמיה הבא. שמור את הרוק המלאכותי זורם ללשון העכבר כדי לשטוף את המעכב הטעים מפגישת ההדמיה הקודמת. בהתאם לעיצוב הניסוי, חזור על הפגישה כנדרש.
11. כאשר הדמיית סידן ויו הושלמה, להרדים את העכבר על פי הליך IACUC. העכבר תחת הרדמה מוקרב בתא CO_2.
    הערה: בדוק את עומק ההרדמה באמצעות רפלקס צביטת בוהן. במהלך מפגש הדמיה, רוק מלאכותי מהמאגרים צריך להיות מסופק באופן עקבי. אם בועות מופיעות בחלון ההדמיה של μTongue, להסיר את הבועות על ידי דוחף אותם דרך הקלט או את הפלט של μTongue באמצעות לחץ נוזלי חזק.

5. ניתוח תמונה (איור 3)

1. המרת תמונה
   1. פתח את קבצי התמונה הגולמיים באמצעות פיג'י¹⁴ או תוכנת ניתוח תמונה דומה.
   2. המר את קובץ התמונה לקובץ מחסנית RGB לשימוש בקוד מנתח באד NPL.
      1. תמונה > צבע > ערוצים מפוצלים
      2. תמונה > צבע > מיזוג ערוצים ובחר את התמונה מהשלב 5.2.1.
      3. תמונה > צבע > מחסנית ל- RGB
2. רישום תמונה
   הערה: השתמש בקוד הכתוב בהתאמה אישית לניתוח נתונים. אנא עיינו https://github.com/neurophotonic/Tastebud-analyzer.
   1. הפעל את הקוד בשם Taste_GUI.m; חלון GUI בשם מנתח ניצני NPL יופיע. לחץ על לחצן ניתוח חדש בפינה השמאלית העליונה ולאחר מכן טען את התמונה המומרת בשלב 5.1. הגדר את קצב הפריימים מעל התמונה שנטענה.
   2. צייר את אזור העניין (ROI) מעל התמונה שנטענה לרישום. לחץ פעמיים על ההבחז הנבחר והרישום המחושב האוטומטי יתחיל.
3. להשיג את השינויים בעוצמת הפלואורסצנטיות היחסית (ΔF/F)
   1. חזור לחלון מנתח באד NPL כדי להציג את התמונה הרשומה מהשלב 5.2 באופן אוטומטי. אם למשתמש כבר יש קובץ reg, לחץ על לחצן טען נתונים ובחר את הקובץ _reg.tif.
   2. לחץ על כפתור המעגל או המצולע והצב את ה- ROI של תא הטעם מעל תמונת בלוטות הטעם.
   3. זה מציג את עוצמת הפלואורסצנטיות הגולמית ואת עקבות הסידן (ΔF/F) של תא הטעם שנבחר באופן אוטומטי מתחת לתמונת בלוטות הטעם.
   4. לחץ על שמור מעקב כדי להציג את עקבות הסידן (ΔF/F) בצד ימין של GUI, בעוד ROI מוצג על תמונת בלוטות הטעם. חזור על שלבים 5.3.2-5.3.4 עד לסיום בחירת החזר על החזר על ההחזרה.
      הערה: לחץ על לחצן מחק מעקב אם ה- ROI נבחר בטעות כדי למנוע את עקבות ה- ROI והסידן שנבחרו לאחרונה.
   5. לאחר סיום בחירת ROI, כתוב את שם הקובץ בפינה השמאלית התחתונה ולחץ על לחצן סיום כדי לייצא את מעקב הסידן ΔF/F כתבנית .xls, ואת תמונת ניצן הבורסה עם ROIs בתבנית .bmp.
4. ניתוח עקבות הסידן
   1. לנתח את עקבות הסידן המתקבלים בשלב 5.3. קחו בחשבון שתאי הטעם הגיבו לטעים כאשר עוצמת הפלואורסצנטיות עולה ביותר משתי סטיות תקן של קו הבסיס לאחר מסירת הטעם⁴, וערכי pהם פחות מ- 0.01, באמצעות t-testsמזווגים או לא משולמים¹⁰.
   2. שקול את תא הטעם כתא מגיב, אם הוא מגיב לטעם מסוים יותר מפי שניים מתוך שלושה ניסויים (~ 60%)¹⁵.
   3. השג את עקבות הסידן הייצוגיות על ידי ממוצע עקבות סידן בודדות שנרכשו בשלב 5.4.1.

תוצאות

עכבר Pirt-GCaMP6f-tdTomato שימש להשגת תמונת בלוטות טעם. פני השטח של לשון העכבר היו מכוסים בפפילה פילפורמית אוטופלואורסצנטית. בלוטות הטעם מפוזרות בדלילות על פני הלשון(איור 4A). התמונות של בלוטות הטעם והמבנה שלה נרכשו באמצעות שלושה גלאי מסננים שונים. באמצעות ערכת המסננים 607/70 ננומטר, או...

Discussion

מתואר כאן פרוטוקול מפורט כדי להחיל μTongue על החקירה של פעילויות פונקציונליות של תאי טעם ב vivo. בפרוטוקול זה, מתבצעת ההדמיה התפקודית על תאי הטעם באמצעות אינדיקטורים לסידן מקודדים גנטית. בנוסף לשימוש בעכברים מהונדסים, טעינה אלקטרופורטית של צבעי סידן (או צבעי חישת מתח) על תאי הטעם יכולה להי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
acesulfame K	Sigma Aldrich	04054-25G	Artificial saliva / tastant
calcium chloride solution	Sigma Aldrich	21115-100ML	Artificial saliva / tastant
citric acid	Sigma Aldrich	C0759-100G	Artificial saliva / tastant
cycloheximide	Sigma Aldrich	01810-5G	Artificial saliva / tastant
denatonium	Sigma Aldrich	D5765-5G	Artificial saliva / tastant
Dental glue	Denkist	P0000CJT-A2	Animal preparation
Image J	NIH	ImageJ	Data analysis
IMP	Sigma Aldrich	57510-5G	Artificial saliva / tastant
Instant adhesive	Loctite	Loctite 4161, Henkel	Animal preparation
K2HPO4	Sigma Aldrich	P3786-100G	Artificial saliva / tastant
KCl	Sigma Aldrich	P9541-500G	Artificial saliva / tastant
Ketamine	Yuhan	Ketamine 50	Animal preparation
KH2PO4	Sigma Aldrich	P0662-25G	Artificial saliva / tastant
KHCO3	Sigma Aldrich	237205-500G	Artificial saliva / tastant
MATLAB	Mathwork	MATLAB	Data analysis
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266-100G	Artificial saliva / tastant
MPG	Sigma Aldrich	49601-100G	Artificial saliva / tastant
Mutiphoton microscope	Thorlab	Bergamo II	Microscope
NaCl	Sigma Aldrich	S3014-500G	Artificial saliva / tastant
NaHCO3	Sigma Aldrich	792519-500G	Artificial saliva / tastant
Objective	Nikon	N16XLWD-PF	Microscope
Octaflow	ALA Scientific Instruments	OCTAFLOW II	Fluidic control
PC	LG	Lg15N54	Fluidic control
PH meter	Thermoscientific	ORION STAR AZ11	Artificial saliva / tastant
Phosphate-buffered saline	Sigma Aldrich	806562	Artificial saliva / tastant
quinine	Sigma Aldrich	Q1125-5G	Artificial saliva / tastant
Syringe pump	Havard Apparatus	PHD ULTRA 4400	Fluidic control
TRITC-dextran	Sigma Aldrich	52194-1G	Animal preparation
Ultrafast fiber laser	Toptica	FFultra920 01042	Microscope
Xylazine	Bayer Korea	Rompun	Animal preparation