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요약

이 기사는 미세 유체를 혀의 인포탈 이미징 창에 통합하여 생체 내 기능적인 맛 세포 이미징을 위한 μTongue(미세 유체액액)을 도입합니다.

초록

인트라바이탈 형광 현미경 검사는 살아있는 동물에서 다세포 역학을 연구하기 위해 널리 사용되는 도구입니다. 그러나, 그것은 성공적으로 맛 감각 기관에서 사용 되지 않았습니다. μTongue은 미세 유체액을 중요한 혀 이미징 창에 통합함으로써 여러 술관에 대한 제어된 노출 하에 생체 내 의 맛 세포의 신뢰할 수 있는 기능적 이미지를 제공합니다. 이 논문에서는 μTongue 시스템을 활용하는 상세한 단계별 절차가 제시됩니다. 미적 솔루션 준비, 미세 유체 모듈 설정, 샘플 장착, 기능적 이미지 데이터 수집 및 데이터 분석의 다섯 가지 하위 섹션이 있습니다. μTongue을 사용할 때 발생할 수 있는 실용적인 문제를 해결하기 위한 몇 가지 팁과 기술도 제시된다.

서문

인탈 형광 현미경은 살아있는 조직에 있는 현면 역학을 공부하기 위하여 넓게 이용됩니다. 연구원은 생물학적 과정의 특이적이고 민감한 변환을 형광 신호로 제공하는 유전자 인코딩 된 센서를 빠르게 개발하고 있으며, 이는 널리 이용 가능한 형광 현미경을사용하여 쉽게 기록 할 수 있습니다1,2. 설치류에 있는 대부분의 내부 기관은 현미경을 사용하여 조사되었지만, 혀에 그것의 성공적인 신청은 아직 성공하지 못했습니다3.

미각 세포의 칼슘 이미징에 대한 이전 연구는 외향성 미각4,5,6 또는 곰팡이 형태의 미각을 얻기 위해 미각을 벗겨서 혀 조직을 얇게 단면화하여 전 생체을 실시하였다7,8. 이 견본의 준비는 필연적으로 침략적이었습니다, 그러므로 신경 내성 장벽 및 혈액 순환과 같은 자연적인 미세환경은, 크게 혼란스러웠습니다. 2015년 최등서에 의해 최초로 관전된 혀 영상 창이 보고되었지만, 유체적 술 자극9로인한 움직임과 광학적 아티팩트로 인해 신뢰할 수 있는 기능적 레코딩을 달성할 수 없었다.

최근에는 미세유체-온-어-혀(μTongue)가10개도입되었다. 이 장치는 미세 유체 시스템을 마우스 혀의 이미징 창과 통합합니다. 이미징 기간 동안 술자극의 준-정상 상태 흐름을 달성함으로써 유체 운동으로부터의 유물을 최소화할 수있다(도 1). 입력 포트는 일련의 멀티채널 압력 컨트롤러에 의해 공급되는 반면 출력 포트는 0.3mL/min을 유지하는 주사기 펌프에 연결됩니다. 또한, 술액의 굴절지수의 차이에 의한 광학유물은 칼슘 민감성 지표(tdTomato)와 칼슘 표시기(GCaMP6)11을도입하는 비율 분석으로 최소화되었다. 이 디자인은 유체 채널 간의 갑작스러운 전환에도 불구하고 생체 내에서 맛 세포의 미세한 안정성을 제공했습니다. 따라서, μTongue은 생체 내에서마우스 미각에 여러 태탄의 신뢰할 수있는 기능 적 스크리닝을 구현한다.

이 프로토콜에서, 실험 절차는 μTongue을 사용하여 생체 내에서 마우스 균류 성 미각의 칼슘 이미징에 대해 자세히 설명된다. 첫째, 인공 타액 및 타액의 제조가 설명된다. 둘째, 준-정상 상태 흐름을 달성하기 위해 미세 유체 시스템의 설정이 도입된다. 셋째, 이미지 수집을 허용하기 위해 μTongue에 마우스 혀를 장착하는 데 사용되는 절차가 묘사됩니다. 마지막으로 측면 모션 아티팩트 및 비율 측정을 포함한 이미지 분석을 위한 각 단계가 지정됩니다. 이 프로토콜은 마우스 시설과 2광자 현미경 또는 동등한 장비를 갖춘 모든 연구 실험실에 쉽게 적응할 수 있습니다.

프로토콜

모든 외과적 수술은 성균관대학교와 서울대학교의 기관동물관리활용위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다.

1. 솔루션 준비: 인공 타액 및 태액

  1. 2m NaCl을 용해시켜 인공 타액을 준비하고, 5mM KCl, 3mM NaHCO3,3mM KHCO3,0.25 mM CaCl2,0.25 mM MgCl2,0.12 mM K2HPO4,0.12 mM KH2PO4,및증류수(>1 L)에서 1.8 m HCl을 조정하고 72 표의 용액의pH를 조정합니다..
  2. 신맛과 같은 탈산제를 준비: 10 mMM 구연산; 짠 : 400 mM NaCl, 선택적으로 50 μM 아밀로 라이드; 달콤함: 40mM 아세술파임 K; 쓴 맛: 5m 퀴닌, 5mM 데나토늄 및 20 μM 사이클로헤시미드의 혼합물은 1.1 단계에서 제조된 인공 타액에서 시음 화학 물질을 용해시킴으로써.

2. 미세 유체 시스템의 준비

참고: 태스트는 가압 된 다중 채널 유체 전달 시스템 (참조 도 1 및 재료의 표)를사용하여 마우스 혀로 전달되었다.

  1. 인공 타액과 술탄으로 가압 된 흐름 관류 시스템의 저장소를 채웁니다.
  2. 압축 공기 라인을 레귤레이터 입력에 연결하고 유체 전달 시스템에서 30~50psi 사이의 공기 압력을 설정합니다.
  3. 레귤레이터의 출력 압력을 0.4 psi로 설정하고 액체가이 압력하에서 튜브에서 나오는지 확인하십시오.
  4. 저장소에서 매니폴드를 μTongue의 입력 포트에 연결합니다.
  5. μTongue의 출력 포트를 주사기 펌프에 연결하고 액체를 ~300μL+min-1로 인출하여 정상 상태를 설정합니다. μTongue 아래에 매달려 있는 액적의 일정한 부피를 관찰한다. 샘플 높이에 따라 설정 매개 변수의 값을 조정합니다.
  6. 압축 공기 라인을 분리하고 프로토콜 단계 3이 완료 될 때까지 주사기 펌프를 중지합니다.

3. 생체 내 이미징을 위한 마우스 준비(도2).

참고: 모든 동물 제제는 실험실 작업대에서 무균 조건하에서 낮 동안 수행되었습니다.

  1. 마우스 마취
    1. 7주 또는 더 오래된 마우스를 어느 성별중 하나를 준비합니다. 미각 세포에서 칼슘 감지 형광 단백질을 표현하는 유전자 변형 마우스 라인을 사용하십시오.
    2. 마우스는 마취를 위해 억제됩니다. 100 mg/kg 케타민과 10 mg/kg 자일라진의 혼합물은 마우스13에회중적으로 주입된다.
  2. TRITC-dextran (500 kDa)에서 2.5% W/V 인산염 완충식 식염수는 화상 진찰 세션 동안 혈액 순환을 관찰하기 위해 복고풍 궤도 경로를 통해 마우스내로 정맥내로 부각된다.
  3. 마우스 두개골에 머리 해결사를 부착하여 이동 아티팩트를 최소화합니다.
    1. 마우스 헤드는 70% ETOH로 분사되고 마우스는 척추 위치에 놓입니다. 집게로 머리 피부를 가볍게 들어 올리고 가위로 약 7mm2를 잘라내세요.
    2. 두피 주위의 모발을 청소하고, 피부 아래의 골막을 제거하고, 두개골에 즉시 접착제를 바르고, 맞춤형 헤드 픽서를 부착합니다.
    3. 즉각적인 접착제가 경화된 후, 머리 해결사 주위에 치과 접착제를 바르고 청색 광으로 조명하여 치과 접착제를 고화시하십시오.
  4. 마우스 혀를 μTongue의 하단 단위에 놓습니다.
    1. 마우스의 아래쪽 입술을 μTongue의 하단 부에 즉시 접착제로 부착합니다.
    2. 마우스를 보드에 놓고(도 1B의마우스 준비 보드) 및 μ혀의 하단 유닛을 기둥에 놓습니다(μ혀는 도 1B에서포스트를 홀드). 아래쪽 단위의 모서리에 있는 구멍이 게시물에 정렬되어 있는지 확인합니다.
    3. 마우스 헤드 픽서를 보드의 헤드 픽서 홀더에 조입니다. 그런 다음 마우스 헤드와 장치 사이의 거리를 조정합니다. 헤드 픽서 홀더를 사용하여 마우스 헤드를 약 45° 부드럽게 회전합니다. 이 과정은 현미경 목표를 가진 마우스 코의 물리적 접촉을 방지합니다.
    4. 플라스틱 핀셋을 사용하여 마우스 혀를 부드럽게 그리고 혀의 복부면을 μTongue의 하단 에 부착합니다. 그런 다음 젖은 면봉으로 마우스 혀의 표면을 닦아냅니다.
    5. 인공 타액에 종이 를 담그고 젖은 상태를 유지하기 위해 마우스 혀의 노출 된 표면에 놓습니다.
    6. μTongue의 하단 부분의 양쪽 끝을 고정하는 게시물에 곡선 된 와셔를 놓습니다.
  5. 현미경 단계에 마우스 준비를 배치합니다. 현미경 목표 영역의 대략적인 중앙 아래에 노출된 마우스 혀를 배치한다. 스테이지의 동적 범위에서 벗어나지 않도록 하십시오. 그런 다음 나사로 스테이지의 마우스 보드를 조입니다.
  6. 가열 패드를 마우스 본체 아래에 놓고 온도를 36.5 °C -37.5 °C로 유지합니다. 온도 센서로 마우스 체온을 모니터링하고 온도 센서의 피드백 신호를 사용하여 가열 패드의 온도를 제어합니다.
  7. 얇은 종이 조각을 비틀고 액체가 마우스 기관지에 유입되는 것을 방지하기 위해 마우스의 입에 놓습니다.
  8. 마우스 혀에서 젖은 조직을 제거하고 마우스 혀에 준비 된 μTongue을 놓습니다. 혀에 미세 유체 채널을 넣고 이미징 창을 통해 혀의 표면을 관찰하는 위치를 조정합니다.
  9. 최소한의 압축 압력으로 양 끝을 부드럽게 나사로 고정하여 μTongue을 고정하십시오.

4. 이미징 인수

  1. 사용하기 전에 920 nm 2 광자 레이저와 현미경을 켭니다.
  2. 현미경에 물 침지 목표 (16x, NA 0.80 또는 25x, NA 1.1)를 마운트합니다. μTongue의 이미징 창에 증류수를 떨어뜨리고 목표를 담급합니다.
  3. 카메라 모드에서는 수은 램프를 사용하여 빛을 켜고 혀 표면을 비춥니다.
  4. Z축을 조정하여, 대략적인 초점 평면을 찾아서 filiform 유두에서 자동 형광 신호를 검색합니다. 그런 다음 X 및 Y 조정 노브를 사용하여 미각을 찾습니다.
  5. 다광자 모드로 전환합니다. 다음과 같이 이미지 수집 조건을 설정 : 여기 파장 : 920 nm; 배출 필터 세트: 447/60 nm, 525/50 nm 및 607/70 nm; 양방향 래스터 스캔 모드, 프레임 크기: 512 x 512.
  6. X 및 Y 위치를 조정하여 이미지 창 중앙에 미각을 배치합니다.
  7. 미각의 약 3분의 2 높이에서 미각을 둘러싼 혈관을 검색합니다. 프로토콜 단계 3.2로부터 TRITC-dextran(500 kDa) 주입에 의한 혈액 순환을 시각화한다. 혈류 나막신이 나막히면 고정 나사를 약간 풀어 혈액 흐름을 허용하십시오.
  8. Z축을 조정하고 충분한 수의 미각 세포를 포함하는 미각의 Z 평면을 찾습니다.
  9. 80s에 대한 2-6 Hz로 칼슘 이미징을 진행합니다. 이미징이 시작된 후 유체 시스템의 저장소를 전환하여 20초의 맛 용액을 제공합니다. 20의 맛 자극 후, 저수지를 인공 타액으로 다시 전환합니다.
  10. 순차적인 이미징이 끝나면 다음 이미징 세션까지 약 3-4분 정도 기다립니다. 인공 타액이 마우스 혀로 흐르는 것을 유지하여 이전 이미징 세션에서 타질 리맨런트를 씻어내십시오. 실험의 설계에 따라 필요에 따라 세션을 반복합니다.
  11. 생체 내 칼슘 이미징이 완료되면 IACUC 절차에 따라 마우스를 안락사시하십시오. 마취 하에 마우스는 CO2 챔버에서 희생됩니다.
    참고: 발가락 핀치 반사를 사용하여 마취의 깊이를 확인합니다. 이미징 세션 동안 저수지의 인공 타액을 일관되게 제공해야 합니다. μTongue의 이미징 창에 거품이 나타나는 경우 강한 액체 압력을 사용하여 μTongue의 입력 또는 출력을 통해 기포를 제거합니다.

5. 이미지 분석(그림 3)

  1. 이미지 변환
    1. 피지14 또는 유사한 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 원시 이미지 파일을 엽니 다.
    2. 이미지 파일을 RGB 스택 파일로 변환하여 NPL 버드 분석기 코드를 사용합니다.
      1. 이미지 > 색상 > 분할 채널
      2. 이미지 > 색상 > 채널을 병합하고 5.2.1 단계에서 이미지를 선택합니다.
      3. RGB에 이미지 > 색상 > 스택
  2. 이미지 등록
    참고: 데이터 분석을 위해 사용자 지정 작성 코드를 사용합니다. https://github.com/neurophotonic/Tastebud-analyzer 참조하십시오.
    1. Taste_GUI.m라는 코드를 실행합니다. NPL 버드 분석기라는 GUI 창이 나타납니다. 오른쪽 상단 모서리에 있는 새 분석 버튼을 클릭한 다음 5.1 단계에서 변환된 이미지를 로드합니다. 로드된 이미지 위에 프레임 속도를 설정합니다.
    2. 등록을 위해 로드된 이미지 위에 관심 영역(ROI)을 그립니다. 선택한 ROI를 두 번 클릭하면 자동 계산된 등록이 시작됩니다.
  3. 상대형광 강도 변화(ΔF/F)
    1. NPL 버드 분석기 창으로 돌아가서 5.2 단계에서 등록된 이미지를 자동으로 표시합니다. 사용자가 이미 reg 파일이 있는 경우 데이터 로드 버튼을 클릭하고 _reg.tif 파일을 선택합니다.
    2. CIRCLE 또는 폴리곤 버튼을 클릭하고 미각 이미지 위에 미각 세포의 ROI를 배치합니다.
    3. 이것은 미각 이미지하에서 선택된 미각 세포의원시 형광 강도 및 칼슘 트레이스(ΔF/F)를자동으로 제시한다.
    4. 저장 추적을 클릭하여 GUI의 오른쪽에 칼슘 흔적(ΔF/F)을표시하고 ROI는 미각 이미지 위에 표시됩니다. ROI 선택이 완료될 때까지 5.3.2-5.3.4 단계를 반복합니다.
      참고: ROI가 잘못 선택되어 마지막으로 선택한 ROI 및 칼슘 흔적을 제거하려면 추적 삭제 버튼을 클릭합니다.
    5. ROI 선택이 완료되면 오른쪽 하단 모서리에 파일 이름을 작성하고 완료 버튼을 클릭하여 δF/F칼슘 흔적을 .xls 형식으로 내보내고 roI를 .bmp 형식으로 사용하여 태즈 버드 이미지를 내보냅니다.
  4. 칼슘 흔적 분석
    1. 5.3 단계에서 얻은 칼슘 흔적을 분석합니다. 맛 세포가 태탈제가전달된후 기준선의 두 개 이상의 표준 편차가 상승할 때 맛 세포가 타당에 반응하고, p-값은짝 또는 페어링되지 않은 t-test10을사용하여 0.01 미만인 것을 고려한다.
    2. 맛 세포를 응답자 세포로 고려하면, 3개의 시험 중 2회 이상 특정 맛에 반응하는 경우(~60%)15.
    3. 5.4.1 단계에서 획득한 개별 칼슘 흔적을 평균화하여 대표적인 칼슘 흔적을 얻을 수 있습니다.

결과

Pirt-GCaMP6f-tdTomato 마우스는 미각 이미지를 얻기 위해 사용되었습니다. 마우스 혀의 표면은 자동 형광 성 포피 폼 유두로 덮여 있었다. 미각은 혀의 표면에 드물게 퍼져 있습니다(도4A). 미각과 그 구조의 이미지는 세 가지 필터 검출기를 사용하여 획득되었다. 607/70 nm 필터 세트를 사용하여, 맛 세포로부터의 tdTomato신호(도 4B)를얻었다. 525/50 nm 필터 세트를 ...

토론

여기에 설명된 상세한 프로토콜은 생체 내의 미각 세포의 기능적 활동의 조사에 μTongue을 적용하는 상세한 프로토콜이다. 이 프로토콜에서, 유전자 로 인코딩 된 칼슘 지표를 사용하여 맛 세포에 대한 기능적 이미징이 수행됩니다. 형질전환마우스의 사용 외에도, 맛 세포에 칼슘 염료(또는 전압 감지 염료)의 전기전광 적재는 대안이 될 수 있다.

굴절률의 1.336 미만의 모...

공개

저자는 경쟁 금융 이익을 선언: J. 한과 M. 최는이 문서에 설명 된 특허 μTongue 기술의 발명자이며, μTongue 시스템은 SciTech 코리아를 통해 상용화된다.

감사의 말

이 작품은 기초과학연구소(IBS-R015-D1), 한국정부(MSIT) 국가연구재단(MsIT) (2019M3A9E2061789호), 한국정부(MSIT)가 지원한 국가연구재단(NRF)의 지원을 받았다. 김은수와 이유진의 기술지원에 감사드립니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
acesulfame KSigma Aldrich04054-25GArtificial saliva / tastant
calcium chloride solutionSigma Aldrich21115-100MLArtificial saliva / tastant
citric acidSigma AldrichC0759-100GArtificial saliva / tastant
cycloheximideSigma Aldrich01810-5GArtificial saliva / tastant
denatoniumSigma AldrichD5765-5GArtificial saliva / tastant
Dental glueDenkistP0000CJT-A2Animal preparation
Image JNIHImageJData analysis
IMPSigma Aldrich57510-5GArtificial saliva / tastant
Instant adhesiveLoctiteLoctite 4161, HenkelAnimal preparation
K2HPO4Sigma AldrichP3786-100GArtificial saliva / tastant
KClSigma AldrichP9541-500GArtificial saliva / tastant
KetamineYuhanKetamine 50Animal preparation
KH2PO4Sigma AldrichP0662-25GArtificial saliva / tastant
KHCO3Sigma Aldrich237205-500GArtificial saliva / tastant
MATLABMathworkMATLABData analysis
MgCl2Sigma AldrichM8266-100GArtificial saliva / tastant
MPGSigma Aldrich49601-100GArtificial saliva / tastant
Mutiphoton microscopeThorlab Bergamo IIMicroscope
NaClSigma AldrichS3014-500GArtificial saliva / tastant
NaHCO3Sigma Aldrich792519-500GArtificial saliva / tastant
ObjectiveNikonN16XLWD-PFMicroscope
OctaflowALA Scientific InstrumentsOCTAFLOW IIFluidic control
PCLGLg15N54Fluidic control
PH meterThermoscientificORION STAR AZ11Artificial saliva / tastant
Phosphate-buffered salineSigma Aldrich806562Artificial saliva / tastant
quinineSigma AldrichQ1125-5GArtificial saliva / tastant
Syringe pumpHavard ApparatusPHD ULTRA 4400Fluidic control
TRITC-dextranSigma Aldrich52194-1GAnimal preparation
Ultrafast fiber laserTopticaFFultra920 01042Microscope
XylazineBayer KoreaRompunAnimal preparation

참고문헌

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