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要約

本稿では、舌上の生体内イメージングウィンドウにマイクロ流体を統合することにより 、生体内で の機能性味細胞イメージング用μTongue(マイクロ流体術オン・ア・タン)デバイスを紹介する。

要約

生体内蛍光顕微鏡は、生きた動物の多細胞ダイナミクスを研究するために広く使用されるツールです。しかし、味覚官能器官ではうまく使用されていない。マイクロ流体を生体内舌イメージングウィンドウに統合することにより、μTongueは、複数のタストタントへの制御された暴露の下 で生体内 の味細胞の信頼性の高い機能的画像を提供します。本論文ではμTongueシステムを利用するための詳細なステップバイステップの手順を提示する。タスタントソリューションの準備、マイクロ流体モジュールのセットアップ、サンプル実装、機能画像データの取得、データ分析の5つのサブセクションがあります。μTongueを使用する際に生じる可能性のある実用的な問題を解決するためのヒントとテクニックも紹介しています。

概要

生体内蛍光顕微鏡は、生体組織の時空間的ダイナミクスを研究するために広く使用されています。研究者たちは、生物学的プロセスの特異的かつ敏感な蛍光シグナルへの変換を提供する遺伝的にコードされたセンサーを急速に開発しています - 広く利用可能な蛍光顕微鏡を使用して容易に記録することができます1,2.げっ歯類のほとんどの内臓は顕微鏡を用いて調べられてきたが、舌への応用は成功していない3.

味覚細胞のカルシウムイメージングに関する以前の研究は、舌組織を薄く切り離して、舌組織を薄く切り離して、味覚芽4、5、6を得るか、または味覚上皮を剥離して真菌形態の味覚芽7、8を得ることによって行った。これらのサンプルの調製は必然的に侵襲的であったため、神経の内在性、透水性バリア、血液循環などの自然微小環境は、大部分が摂動された。最初のインビタル舌画像化ウィンドウは2015年にChoiらによって報告されたが、流動性タスタント刺激によって引き起こされる動き及び光学的アーチファクトのために信頼性の高い機能的記録は達成できなかった。

最近、マイクロ流体オンアタン(μTongue)が導入された10.この装置はマウスの舌のイメージ投射窓とマイクロ流体システムを統合する。画像撮影期間を通じてタスタント刺激の準定常状態の流れを達成することによって、流体運動からのアーチファクトを最小限に抑えることができる(図1)。入力ポートは一連のマルチチャンネル圧力コントローラによって供給され、出力ポートは0.3 mL/minを維持するシリンジポンプに接続されます。また、タスタント溶液の屈折率の差に起因する光学的アーチファクトは、カルシウム感受性指標(tdTomato)とカルシウムインジケーター(GCaMP6)11を導入した比分析により最小化された。この設計は、流体チャネル間の急激な切り替えでも、生体内の味細胞の微視的安定性を提供しました。その結果、μTongueは、インビボでマウスの味覚芽に複数のタストタントの信頼性の高い機能的スクリーニングを実施します。

このプロトコルでは、実験手順はμTongueを用いた 生体内 におけるマウス真菌形態味覚芽のカルシウムイメージングについて詳細に説明される。まず、人工唾液およびタスタント溶液の調製について説明する。第2に、準定常状態流を達成するためのマイクロ流体システムの設定が導入される。第三に、画像の取得を可能にするためにμTongueにマウス舌を取り付けるために使用される手順が描かれている。最後に、横運動アーチファクトの補正やレシオメトリーを含む画像解析の各ステップを指定します。このプロトコルはマウスの設備および2光子顕微鏡または同等の装置を用いてあらゆる実験室に容易に合わせることができる。

プロトコル

すべての外科的処置は、成均館大学及びソウル大学校の施設動物の世話及び使用委員会(IACUC)によって承認された。

1. ソリューションの調製: 人工唾液とタストタント

  1. 2 mM NaClを溶解して人工唾液を調製し、 5 mM NaHCO3,3mM KHCO 3,0.25 mM CaCl2,0.25mM MgCl2,0.12mM K2HPO,0.12mM KH2PO4,および1.8 mM HClを蒸留水(>1 L)に調整し、溶液のpHを7(1L)に調整する。
  2. 酸味などのタスタントを準備します: 10 mM クエン酸;塩辛い:400 mM NaCl、必要に応じて50 μMアミロライド。甘い:40 mMアセスルファムK;苦い:5 mMキニン、5 mMデナトニウムおよび20 μMシクロヘキシミドの混合物を、ステップ1.1で調製した人工唾液中に試飲薬を溶解させることによって。

2. マイクロ流体システムの調製

注: タストタントは、加圧マルチチャンネル流体送達システムを使用してマウス舌に送達されました( 図1 および 材料表を参照)。

  1. 加圧流灌流システムの貯留層を人工唾液とタスタントで満たします。
  2. 圧縮空気ラインをレギュレータ入力に接続し、流体送達システムで30~50 psiの間で空気圧を設定します。
  3. レギュレータの出力圧力を0.4 psiに設定し、この圧力の下でチューブから液体が出ているかどうかを確認します。
  4. 貯留層からμTongueの入力ポートにマニホールドを接続します。
  5. μTongueの出力ポートをシリンジポンプに接続し、液体を~300 μL∙min-1で引き出して定常状態を確立します。μTongueの下に吊り下げ液滴の一定の体積を観察します。サンプルの高さに応じて設定パラメータの値を調整します。
  6. 圧縮空気ラインを外し、プロトコルステップ3が完了するまでシリンジポンプを停止します。

3.インビボイメージング用のマウスの準備 (図 2)。

注:すべての動物の製剤は、実験室のワークベンチで無菌条件下で昼間に行われました。

  1. マウス麻酔
    1. どちらかのセックスの7週齢または古いマウスを準備します。味細胞内のカルシウム感知蛍光タンパク質を発現する遺伝子組み換えマウスラインを使用します。
    2. マウスは麻酔のために拘束されています。100 mg/kg ケタミンと 10 mg/kg キシラジンの混合物をマウス13に腹腔内注射する。
  2. 2.5%W/Vリン酸緩衝液生理食塩液中のTRITC-デキストラン(500kDa)は、画像化セッション中に血液循環を観察するために、レトロ軌道経路を介してマウスに静脈内投与される。
  3. マウスの頭蓋骨にヘッドフィクサーを取り付けて、動きのアーティファクトを最小限に抑えます。
    1. マウスヘッドは、マウスが、supineの位置に配置されている間、70%ETOHを噴霧されます。頭の皮を鉗子で軽く持ち上げ、はさみで約7mm2 を切り取ります。
    2. 頭皮の周りの髪をきれいにし、皮膚の下の骨膜を取り除き、頭蓋骨に瞬間的な接着剤を塗布し、カスタマイズされたヘッドフィクサーを取り付けます。
    3. 瞬間接着剤が硬化した後、ヘッドフィクサーの周りに歯科用接着剤を塗布し、歯の接着剤を固めるために青色光で点灯します。
  4. μTongueの底部にマウス舌を置きます。
    1. マウスの下唇を瞬時に接着剤でμTongueの底部に取り付けます。
    2. ボード上にマウスを置き( 図1Bのマウス準備ボード)、μTongueの底部ユニットをポストに置きます( 図1BのμTongueホールドポスト)。下部のユニットの端にある穴が、ポストに揃えられていることを確認します。
    3. ボードのヘッドフィクサーホルダーにマウスヘッドフィクサーを締めます。次に、マウスヘッドとデバイスの間の距離を調整します。ヘッドフィクサーホルダーを使用して、マウスヘッドを約45°スムーズに回転させます。このプロセスは顕微鏡目的とマウスの鼻の物理的接触を防ぐ。
    4. プラスチック製のピンセットを使用してマウスの舌を優しく描き、舌の腹側をμTongueの底部の上側に取り付けます。次に、濡れた綿棒でマウス舌の表面を拭きます。
    5. 人工唾液に紙を浸し、濡れた状態を維持するためにマウス舌の露出した表面に置きます。
    6. μTongueの底部の両端を保持するポストに湾曲したワッシャーを置きます。
  5. 顕微鏡のステージにマウスの準備を置きます。露出したマウス舌を顕微鏡目的領域の近似中心の下に置きます。ステージのダイナミックレンジから逸脱しないように注意してください。次に、ステージ上のマウスボードをねじで締めます。
  6. マウス本体の下に加熱パッドを置き、温度を36.5°C-37.5 °Cに保ちます。 温度センサーでマウスの体温を監視し、温度センサからのフィードバック信号を使用して加熱パッドの温度を制御します。
  7. 薄い紙をひねってマウスの口に置き、液体がマウスの気管に入るのを防ぎます。
  8. マウスの舌から濡れた組織を取り出し、準備したμTongueをマウスの舌の上に置きます。舌にマイクロ流体チャネルを置き、その位置を調整して、画像窓から舌の表面を観察します。
  9. 最小の圧縮圧力で両端を軽くねじ込んでμTongueを固定します。

4. イメージング取得

  1. 920 nmの2光子レーザーと顕微鏡を使用前にオンにします。
  2. 水浸物目的(16x、NA 0.80または25x、NA 1.1)を顕微鏡に取り付けます。μTongueのイメージングウィンドウに蒸留水を落とし、目的を浸します。
  3. カメラモードでは、水銀ランプを使用してライトを点灯し、舌の表面を照らします。
  4. Z軸を調整することで、フィリフォーム乳頭から自己蛍光信号を検索し、近似焦点面を見つけます。次に、XとYの調整ノブを使用して、味覚芽を見つけます。
  5. マルチフォトンモードに切り替えます。次のように画像取得条件を設定します: 励振波長: 920 nm;エミッションフィルタセット:447/60 nm、525/50 nm、および607/70 nm;双方向ラスタースキャンモード、フレームサイズ:512 x 512。
  6. X と Y の位置を調整して、イメージ ウィンドウの中央に味覚芽を配置します。
  7. 味覚芽の約3分の2の高さで味覚芽を囲む血管を検索します。プロトコルステップ3.2からのTRITC-デキストラン(500 kDa)注入によって血液循環を視覚化する。血流が詰まっている場合は、固定ネジを少し緩めて血流を可能にします。
  8. Z軸を調整し、味覚細胞の十分な数を含む味覚芽のZ平面を見つけます。
  9. 80 sの2-6 Hzでカルシウムイメージングを進めます。イメージング開始後に流体システムの貯留槽をオンにして20sの味液を提供する。味覚刺激の20のsの後、人工唾液に戻って貯水池を切り替えます。
  10. シーケンシャルイメージングが終了した後、次のイメージングセッションまで3~4分ほど待ちます。人工唾液をマウス舌に流し、前のイメージングセッションからタスタントのリマントを洗い流します。実験の設計に応じて、必要に応じてセッションを繰り返します。
  11. インビボカルシウムイメージングが完了したら、IACUC手順に従ってマウスを安楽死させる。麻酔下のマウスはCO2チャンバーで屠殺される。
    メモ:つま先ピンチ反射を使用して麻酔の深さを確認してください。イメージングセッション中に、貯留層からの人工唾液を一貫して提供する必要があります。μTongueのイメージングウィンドウに気泡が現れた場合は、強い液体圧力を使用してμTongueの入力または出力を通して泡を取り除きます。

5. 画像解析 (図 3)

  1. 画像変換
    1. フィジー14 または同様の画像解析ソフトウェアを使用して、生の画像ファイルを開きます。
    2. NPL バド アナライザコードを使用するには、イメージ ファイルを RGB スタック ファイルに変換します。
      1. 画像>カラー>分割チャンネル
      2. [イメージ>カラー>[チャンネルをマージ]を クリックし、ステップ 5.2.1 からイメージを選択します。
      3. 画像>カラー > スタックから RGB
  2. 画像登録
    注: データ分析には、カスタム記述されたコードを使用します。https://github.com/neurophotonic/Tastebud-analyzer を参照してください。
    1. Taste_GUI.mという名前のコードを実行します。NPL バド アナライザという名前の GUI ウィンドウがポップアップ表示されます。右上隅の[新規解析]ボタンをクリックし、ステップ5.1から変換された画像をロードします。ロードされたイメージの上のフレーム レートを設定します。
    2. 登録のために、ロードされたイメージの上に関心領域(ROI)を描画します。選択したROIをダブルクリックすると、自動計算された登録が開始されます。
  3. 相対的な蛍光強度変化を求める(ΔF/F)
    1. ステップ 5.2 から登録されたイメージを自動的に表示するには 、NPL バド アナライザ ウィンドウに戻ります。ユーザーがすでに reg ファイルを持っている場合は、[データのロード] ボタンをクリックして 、_reg.tif ファイルを選択します。
    2. CIRCLEまたはポリゴンボタンをクリックし、味覚芽の画像の上に味の細胞のROIを配置します。
    3. これは、味覚芽像の下で自動的に選択された味覚細胞の生蛍光強度とカルシウムトレース(ΔF/F)を示す。
    4. 「トレースを保存」をクリックして、GUI の右側にカルシウムトレース (ΔF/F)を表示し、ROI は味覚芽のイメージの上に表示されます。ROI の選択が完了するまで、ステップ 5.3.2 から 5.3.4 を繰り返します。
      注: ROI が誤って選択されている場合は、[ トレースの削除 ]ボタンをクリックして、最後に選択した ROI およびカルシウム トレースを削除します。
    5. ROI の選択が完了したら、右下隅にファイル名を書き込み、 完了 ボタンをクリックして、ΔF/F カルシウムトレースを.xls形式としてエクスポートし、タセ芽画像と ROI を.bmp形式でエクスポートします。
  4. カルシウムトレースの解析
    1. ステップ5.3から得られたカルシウムトレースを分析する。テイスト細胞は、tastantが送達された後にベースラインの標準偏差が2つ以上上昇したときにテイスト細胞がタスタントに反応し、p−値が0.01未満であると考え、対または非対t-tests10を用いた。
    2. 味細胞は、特定のタスタントに応答する場合、3回の試験のうち2回以上(〜60%)15回を超えると考えてください。
    3. ステップ5.4.1から得られた個々のカルシウムトレースを平均化することによって代表的なカルシウムトレースを得る。

結果

Pirt-GCaMP6f-tdTomatoマウスを使用して、味覚芽画像を得た。マウス舌の表面は、自己蛍光フィリフォーム乳頭で覆われていた。味覚芽は舌の表面上にまばらに広がっている(図4A)。味覚芽とその構造の画像は、3つの異なるフィルタ検出器を使用して取得しました。607/70 nmフィルタセットを用いて、レシオメトリック解析用に味細胞からのtdTomatoシグナルを得た(

ディスカッション

ここで説明する詳細なプロトコルは 、インビボでの味細胞の機能活動の調査にμTongueを適用する。このプロトコルでは、遺伝的にコードされたカルシウム指標を用いて味細胞上で機能的イメージングが行われる。トランスジェニックマウスの使用に加えて、味細胞上のカルシウム染料(または電圧感知色素)の電気泳動負荷は代替オプションであり得る。

この実験で...

開示事項

著者らは、競合する財政的利益を宣言する:J.ハンとM.チェは、この記事で説明されている特許を取得したμTongue技術の発明者であり、μTongueシステムはSciTech Koreaを介して市販されている。

謝辞

この研究は、韓国政府(MSIT)が出資する韓国国立研究財団(NRF)補助金(2019M3A9E2061789)、韓国政府(MSIT)が資金を提供する韓国国立研究財団(NRF)助成金(2019M3552223A11)によって支援されました。キム・ウンスーとユージン・リーの技術支援に感謝しています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
acesulfame KSigma Aldrich04054-25GArtificial saliva / tastant
calcium chloride solutionSigma Aldrich21115-100MLArtificial saliva / tastant
citric acidSigma AldrichC0759-100GArtificial saliva / tastant
cycloheximideSigma Aldrich01810-5GArtificial saliva / tastant
denatoniumSigma AldrichD5765-5GArtificial saliva / tastant
Dental glueDenkistP0000CJT-A2Animal preparation
Image JNIHImageJData analysis
IMPSigma Aldrich57510-5GArtificial saliva / tastant
Instant adhesiveLoctiteLoctite 4161, HenkelAnimal preparation
K2HPO4Sigma AldrichP3786-100GArtificial saliva / tastant
KClSigma AldrichP9541-500GArtificial saliva / tastant
KetamineYuhanKetamine 50Animal preparation
KH2PO4Sigma AldrichP0662-25GArtificial saliva / tastant
KHCO3Sigma Aldrich237205-500GArtificial saliva / tastant
MATLABMathworkMATLABData analysis
MgCl2Sigma AldrichM8266-100GArtificial saliva / tastant
MPGSigma Aldrich49601-100GArtificial saliva / tastant
Mutiphoton microscopeThorlab Bergamo IIMicroscope
NaClSigma AldrichS3014-500GArtificial saliva / tastant
NaHCO3Sigma Aldrich792519-500GArtificial saliva / tastant
ObjectiveNikonN16XLWD-PFMicroscope
OctaflowALA Scientific InstrumentsOCTAFLOW IIFluidic control
PCLGLg15N54Fluidic control
PH meterThermoscientificORION STAR AZ11Artificial saliva / tastant
Phosphate-buffered salineSigma Aldrich806562Artificial saliva / tastant
quinineSigma AldrichQ1125-5GArtificial saliva / tastant
Syringe pumpHavard ApparatusPHD ULTRA 4400Fluidic control
TRITC-dextranSigma Aldrich52194-1GAnimal preparation
Ultrafast fiber laserTopticaFFultra920 01042Microscope
XylazineBayer KoreaRompunAnimal preparation

参考文献

  1. Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators. PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).
  2. Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32 (7), 1277-1309 (2012).
  3. Choi, M., Kwok, S. J. J., Yun, S. H. In vivo fluorescence microscopy: Lessons from observing cell behavior in their native environment. Physiology. 30 (1), 40-49 (2015).
  4. Caicedo, A., Samir Jafri, M., Roper, S. D. In situ Ca2+ imaging reveals neurotransmitter receptors for glutamate in taste receptor cells. Journal of Neuroscience. 20 (21), 7978-7985 (2000).
  5. Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).
  6. Dando, R., Roper, S. D. Cell-to-cell communication in intact taste buds through ATP signalling from pannexin 1 gap junction hemichannels. The Journal of Physiology. 587 (24), 5899-5906 (2009).
  7. Chandrashekar, J., et al. The cells and peripheral representation of sodium taste in mice. Nature. 464 (7286), 297-301 (2010).
  8. Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. High salt recruits aversive taste pathways. Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).
  9. Choi, M., Lee, W. M., Yun, S. H. Intravital microscopic interrogation of peripheral taste sensation. Scientific Reports. 5 (8661), 1-6 (2015).
  10. Han, J., Choi, M. Comprehensive functional screening of taste sensation in vivo. bioRxiv. 16419 (371682), 1-22 (2018).
  11. Thestrup, T., et al. Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes. Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).
  12. Danilova, V. Glossopharyngeal nerves to taste stimuli in C57BL / 6J mice. BME Neuroscience. 15, 1-15 (2003).
  13. Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nature Communications. 6 (8171), 1-11 (2015).
  14. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  15. Tan, H. E., et al. The gut-brain axis mediates sugar preference. Nature. 580 (7804), 511-516 (2020).
  16. Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds. The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).
  17. Kusuhara, Y., et al. Taste responses in mice lacking taste receptor subunit T1R1. Journal of Physiology. 591 (7), 1967-1985 (2013).

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