μTongue: функциональная платформа визуализации на основе микрофлюидики для языка in vivo

Резюме

В статье представлено устройство μTongue (микрофлюидика на языке) для функциональной визуализации вкусовых клеток in vivo путем интеграции микрофлюидики в окно прижизальной визуализации на языке.

Аннотация

Прижизневая флуоресцентная микроскопия является инструментом, широко используемым для изучения многоклеточной динамики у живого животного. Однако он не был успешно использован во вкусовом органе чувств. Интегрируя микрофлюидику в окно визуализации языка прижизностно, μTongue обеспечивает надежные функциональные изображения вкусовых клеток in vivo при контролируемом воздействии нескольких вкусовых гастян. В данной работе представлена подробная пошаговая процедура использования системы μTongue. Существует пять подразделов: подготовка вкусных решений, настройка микрофлюидного модуля, монтаж образца, получение функциональных данных изображения и анализ данных. Также представлены некоторые советы и методики решения практических вопросов, которые могут возникнуть при использовании μTongue.

Введение

Прижизальный флуоресцентный микроскоп широко используется для изучения пространственно-временной динамики на живых тканях. Исследователи быстро разрабатывают генетически закодированные датчики, которые обеспечивают специфические и чувствительные преобразования биологических процессов в флуоресцентные сигналы, которые могут быть легко записаны с помощью флуоресцентных микроскопов, которые широко доступны^1,2. Хотя большинство внутренних органов у грызунов были исследованы с помощью микроскопа, его успешное применение к языку еще не было успешным^3.

Предыдущие исследования по кальциевой визуализации вкусовых клеток проводились ex vivo путем тонкого срезания ткани языка для получения циркумваллятных вкусовых рецепторов^4,5,6 или путем отслаивания вкусового эпителия для получения грибовидных вкусовых рецепторов^7,8. Подготовка этих образцов была неизбежно инвазивной, поэтому естественные микросреды, такие как иннервация нервов, барьеры проницаемости и кровообращение, были в значительной степени возмущены. Первое окно визуализации языка прижизненным путем было зарегистрировано в 2015 году Choi et al., но надежная функциональная запись была недостижима из-за движения и оптических артефактов, вызванных жидкими тастантными стимулами^9.

Недавно была введена микрофлюидика на языке (μTongue)¹⁰. Это устройство объединяет микрофлюидную систему с окном визуализации на языке мыши. Достигая квази-стационарного потока тастантных стимулов в течение всего периода визуализации, артефакты от плавного движения могут быть сведены к минимуму(рисунок 1). Входной порт питается от серии многоканальных регуляторов давления, тогда как выходной порт подключен к шприцевому насосу, который поддерживает 0,3 мл / мин. Кроме того, оптические артефакты, вызванные разницей в показателях преломления растворов вкуса, были сведены к минимуму с помощью ратиометрического анализа с введением индикатора нечувствительности к кальцию (tdTomato), а также индикатора кальция (GCaMP6)^11. Такая конструкция обеспечивала микроскопическую стабильность вкусовых клеток in vivo даже при резком переключении между текучими каналами. Следовательно, μTongue реализуют надежный функциональный скрининг нескольких вкусовых рецепторов мыши in vivo.

В этом протоколе подробно объясняются экспериментальные процедуры для визуализации кальция мышиных грибовидных вкусовых рецепторов in vivo с использованием μTongue. Сначала описано приготовление искусственной слюны и растворов вкусности. Во-вторых, вводится настройка микрофлюидной системы для достижения квазистабитичного потока. В-третьих, процедуры, используемые для установки языка мыши на μTongue для получения изображения, очерчены. Наконец, каждый этап анализа изображения, включая коррекцию артефактов бокового движения и ратиометрию, задается. Этот протокол может быть легко адаптирован к любой исследовательской лаборатории с мышиным оборудованием и двухфотонным микроскопом или эквивалентным оборудованием.

протокол

Все хирургические процедуры были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Сунгюнван и Сеульского национального университета.

1. Приготовление растворов: искусственной слюны и вкусовых постоялых веществ

1. Готовят искусственную слюну путем растворения 2 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 3 мМ NaHCO_3,3 мМ KHCO_3,0,25 мМ CaCl_2,0,25 мМ MgCl_2,0,12 мМ K₂HPO_4,0,12 мМ KH₂PO₄и 1,8 мМ HCl в дистиллированной воде (>1 л) и отрегулировать рН раствора до 7 (см. Таблицу материалов)^12.
2. Приготовьте вкусности, такие как кислый: 10 мМ лимонной кислоты; соленый: 400 мМ NaCl, опционально с 50 мкМ амилорида; сладкий: 40 мМ ацесульфам К; горький: смесь 5 мМ хинина, 5 мМ денатория и 20 мкМ циклогексимида путем растворения дегустационного химического вещества в искусственной слюне, приготовленной на этапе 1.1.

2. Подготовка микрофлюидной системы

ПРИМЕЧАНИЕ: Тастианты доставлялись на язык мыши с использованием многоканальной жидкостной системы доставки под давлением (см. Рисунок 1 и Таблицу материалов).

1. Заполните резервуары перфузионной системы сжатым потоком искусственной слюной и вкуснятными веществами.
2. Подключите линию сжатого воздуха к входу регулятора и установите давление воздуха между 30 и 50 psi в системе подачи жидкости.
3. Установите выходное давление регулятора на 0,4 psi и проверьте, выходит ли жидкость из трубки под этим давлением.
4. Подключите коллектор от резервуаров к входному порту μTongue.
5. Подключите выходной порт μTongue к шприцевым насосом и отводите жидкость с ~300 мкл∙мин^-1 для установления стационарного состояния. Наблюдайте за постоянным объемом висящей капли под μTongue. Настройте значение параметра настройки в зависимости от высоты образца.
6. Отсоедините линию сжатого воздуха и остановите шприцевой насос до тех пор, пока не будет выполнен этап протокола 3.

3. Подготовка мыши к визуализации in vivo (рисунок 2).

ПРИМЕЧАНИЕ: Все препараты животных проводились в дневное время в асептических условиях на лабораторном верстаке.

1. Мышиная анестезия
   1. Подготовьте 7-недельную или старшую мышь любого пола. Используйте генетически модифицированную линию мыши, которая экспрессирует чувствительные к кальцию флуоресцентные белки во вкусовых клетках.
   2. Мышь удерживается для анестезии. Смесь 100 мг/кг кетамина и 10 мг/кг ксилазина вводят внутрибрюшинно мыши^13.
2. TRITC-декстран (500 кДа) в 2,5% мас./V фосфатного буферного физиологического раствора вливается внутривенно в мышь по ретроорбитальному пути для наблюдения за кровообращением во время сеанса визуализации.
3. Прикрепите фиксатор головы к черепу мыши, чтобы свести к минимуму артефакты движения.
   1. Головка мыши опрыскивается 70% ETOH, в то время как мышь помещается в положение лежа. Слегка поднимите кожу головы щипцами и отрежите ножницами примерно^{на 7 мм2.}
   2. Очистите волосы вокруг кожи головы, удалите позубие под кожей, нанесите мгновенный клей на череп и прикрепите индивидуальный фиксатор головы.
   3. После того, как мгновенный клей затвердеет, нанесите зубной клей вокруг головного фиксатора и осветите синим светом, чтобы затвердеть зубной клей.
4. Поместите язык мыши на нижнюю единицу μTongue.
   1. Прикрепите нижнюю губу мыши к нижнему блоку μTongue с помощью мгновенного клея.
   2. Поместите мышь на доску (доска подготовки мыши на рисунке 1B)и поместите нижнюю единицу μTongue на столбы (μTongue hold post на рисунке 1B). Убедитесь, что отверстия по краю нижнего блока выровнены по столбу.
   3. Затяните фиксатор головки мыши к держателю головки на доске. Затем отрегулируйте расстояние между головкой мыши и устройством. Плавно поверните головку мыши примерно на 45° с помощью держателя крепления головки. Этот процесс предотвращает физический контакт носа мыши с целью микроскопа.
   4. Осторожно нарисуйте язык мыши с помощью пластикового пинцета и прикрепите вентральную сторону языка к верхней стороне нижнего блока μTongue. Затем протрите поверхность языка мыши влажным ватным тампоном.
   5. Замочите лист бумаги в искусственной слюне и поместите его на открытую поверхность языка мыши, чтобы поддерживать влажное состояние.
   6. Поместите изогнутые шайбы на стойки, которые удерживают оба конца нижней части μTongue.
5. Поместите подготовку мыши на ступень микроскопа. Расположите открытый язык мыши под приблизительным центром области объектива микроскопа. Следите за тем, чтобы не отклоняться от динамического диапазона сцены. Затем затяните доску мыши на сцене винтами.
6. Поместите грелку под корпус мыши и поддерживайте температуру 36,5 °C-37,5 °C. Контролируйте температуру тела мыши с помощью датчика температуры и контролируйте температуру грелки с помощью сигнала обратной связи от датчика температуры.
7. Скрутите тонкий лист бумаги и поместите его в рот мыши, чтобы предотвратить попадание жидкости в трахею мыши.
8. Удалите влажную ткань с языка мыши и поместите подготовленный μTongue на язык мыши. Поместите микрофлюидный канал на язык и отрегулируйте его положение, чтобы наблюдать за поверхностью языка через окно визуализации.
9. Закрепите μTongue, аккуратно вкрутив оба конца с минимальным давлением сжатия.

4. Получение изображений

1. Включите двухфотонный лазер 920 нм и микроскоп перед использованием.
2. Установите водоиммерный объектив (16x, NA 0.80 или 25x, NA 1.1) на микроскоп. Бросьте дистиллированную воду на окно визуализации μTongue и погрузите объектив.
3. В режиме камеры включите свет с помощью ртутной лампы и осветите поверхность языка.
4. Регулируя ось Z, ищите автофлуоресцентный сигнал от нитевидных сосочков, чтобы найти приблизительную фокальную плоскость. Затем, используя ручку регулировки X и Y, найдите вкусовой рецептор.
5. Переключитесь в многофотонный режим. Установите условия получения изображения следующим образом: длина волны возбуждения: 920 нм; комплект эмиссионных фильтров: 447/60 нм, 525/50 нм и 607/70 нм; двунаправленный режим растрового сканирования, размер кадра: 512 x 512.
6. Отрегулируйте положения X и Y, чтобы поместить вкусовой рецептор в центр окна изображения.
7. Исследуйте кровеносные сосуды, окружающие вкусовую рецептор, примерно на высоте двух третей вкусовой рецептора. Визуализируют кровообращение с помощью инъекции ТРИТК-декстрана (500 кДа) из шага протокола 3.2. Если кровоток засоряется, слегка ослабьте фиксирующие винты, чтобы обеспечить кровоток.
8. Отрегулируйте ось Z и найдите Z-плоскость вкусового рецептора, которая содержит достаточное количество вкусовых клеток.
9. Продолжайте кальциевую визуализацию с частотой 2-6 Гц в течение 80 с. Обеспечьте вкусовое решение в 20 с, включив резервуар жидкостной системы после начала визуализации. После 20 с стимуляции вкуса переключите резервуар обратно на искусственную слюну.
10. После завершения последовательной визуализации подождите около 3-4 минут до следующего сеанса визуализации. Держите искусственную слюну, текущую к языку мыши, чтобы смыть вкусный реманент с предыдущего сеанса визуализации. В зависимости от конструкции эксперимента повторите сеанс по мере необходимости.
11. Когда визуализация кальция in vivo будет завершена, усыплены мышь в соответствии с процедурой IACUC. Мышь под наркозом приносится в жертву в камере_СО2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте глубину анестезии с помощью рефлекса защемления. Во время сеанса визуализации искусственная слюна из резервуаров должна обеспечиваться последовательно. Если пузырьки появляются в окне визуализации μTongue, удалите пузырьки, протолкнув их через вход или выход μTongue, используя сильное давление жидкости.

5. Анализ изображений(рисунок 3)

1. Преобразование изображений
   1. Откройте файлы необработанных изображений с помощью Fiji¹⁴ или аналогичного программного обеспечения для анализа изображений.
   2. Преобразуйте файл изображения в файл стека RGB для использования кода анализатора NPL Bud.
      1. Изображения > цвет > разделенные каналы
      2. Изображение > Цвет > Объединить каналы и выберите изображение из шага 5.2.1.
      3. Стек цветов > изображения > в RGB
2. Регистрация изображений
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте специально написанный код для анализа данных. Пожалуйста, обратитесь к https://github.com/neurophotonic/Tastebud-analyzer.
   1. Запустите кодовоеимя Taste_GUI.m ; появится окно с графическим интерфейсом под названием NPL Bud Analyzer. Нажмите кнопку «Новый анализ» в правом верхнем углу, затем загрузите преобразованное изображение из шага 5.1. Установите частоту кадров выше загруженного изображения.
   2. Нарисуйте интересуемую область (ROI) над загруженным изображением для регистрации. Дважды щелкните по выбранной ROI, и начнется автоматически рассчитанная регистрация.
3. Получение относительных изменений интенсивностифлуоресценции (ΔF/F)
   1. Вернитесь в окно NPL Bud Analyzer, чтобы автоматически отобразить зарегистрированное изображение из шага 5.2. Если у пользователя уже есть reg-файл, нажмите кнопку Загрузить данные и выберите файл _reg.tif.
   2. Нажмите на кнопку CIRCLE или POLYGON и расположите окупаемости вкусовой ячейки над изображением вкусового рецептора.
   3. Это представляет интенсивность флуоресценции в сыром виде и след кальция (ΔF/F)выбранной вкусовой ячейки автоматически под изображением вкусового рецептора.
   4. Нажмите «Сохранить след», чтобы представить след кальция (ΔF/F)в правой части графического интерфейса, в то время как ROI отображается над изображением вкусового рецептора. Повторяйте шаги 5.3.2–5.3.4 до тех пор, пока не будет завершен выбор окупаеморого окупаемого окупаемость инвестиций.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нажмите кнопку «Удалить трассировку», если ROI выбран неправильно, чтобы устранить последнюю выбранную рентабельность инвестиций и след кальция.
   5. После завершения выбора ROI напишите имя файла в правом нижнем углу и нажмите кнопку Finish, чтобы экспортировать кальциевую трассировку ΔF/F в формате .xls и изображение tase bud с ROI в формате .bmp.
4. Анализ кальциевого следа
   1. Анализ следа кальция, полученного из шага 5.3. Учтите, что вкусовые клетки реагировали на вкусовой вкус, когда интенсивность флуоресценции повышается более чем на два стандартных отклонения от исходного уровня после доставки вкусанта^4,а p-значенияменьше 0,01, используя парные или непарные t-тесты^10.
   2. Рассмотрим вкусовую клетку как клетку-ответчика, если она реагирует на определенный вкус чаще, чем в двух случаях из трех испытаний (~60%)^15.
   3. Получение репрезентативных следов кальция путем усреднения отдельных следов кальция, полученных на этапе 5.4.1.

Результаты

Мышь Pirt-GCaMP6f-tdTomato использовалась для получения изображения вкусовых рецепторов. Поверхность мышиного языка была покрыта автофлуоресцентными нитевидными сосочами. Вкусовые рецепторы разложены по поверхности языка(рисунок 4А). Изображения вкусового рецептора и его стр?...

Обсуждение

Здесь описан подробный протокол применения μTongue к исследованию функциональной активности вкусовых клеток in vivo. В этом протоколе выполняется функциональная визуализация на вкусовых клетках с использованием генетически закодированных показателей кальция. В дополнение к использ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
acesulfame K	Sigma Aldrich	04054-25G	Artificial saliva / tastant
calcium chloride solution	Sigma Aldrich	21115-100ML	Artificial saliva / tastant
citric acid	Sigma Aldrich	C0759-100G	Artificial saliva / tastant
cycloheximide	Sigma Aldrich	01810-5G	Artificial saliva / tastant
denatonium	Sigma Aldrich	D5765-5G	Artificial saliva / tastant
Dental glue	Denkist	P0000CJT-A2	Animal preparation
Image J	NIH	ImageJ	Data analysis
IMP	Sigma Aldrich	57510-5G	Artificial saliva / tastant
Instant adhesive	Loctite	Loctite 4161, Henkel	Animal preparation
K2HPO4	Sigma Aldrich	P3786-100G	Artificial saliva / tastant
KCl	Sigma Aldrich	P9541-500G	Artificial saliva / tastant
Ketamine	Yuhan	Ketamine 50	Animal preparation
KH2PO4	Sigma Aldrich	P0662-25G	Artificial saliva / tastant
KHCO3	Sigma Aldrich	237205-500G	Artificial saliva / tastant
MATLAB	Mathwork	MATLAB	Data analysis
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266-100G	Artificial saliva / tastant
MPG	Sigma Aldrich	49601-100G	Artificial saliva / tastant
Mutiphoton microscope	Thorlab	Bergamo II	Microscope
NaCl	Sigma Aldrich	S3014-500G	Artificial saliva / tastant
NaHCO3	Sigma Aldrich	792519-500G	Artificial saliva / tastant
Objective	Nikon	N16XLWD-PF	Microscope
Octaflow	ALA Scientific Instruments	OCTAFLOW II	Fluidic control
PC	LG	Lg15N54	Fluidic control
PH meter	Thermoscientific	ORION STAR AZ11	Artificial saliva / tastant
Phosphate-buffered saline	Sigma Aldrich	806562	Artificial saliva / tastant
quinine	Sigma Aldrich	Q1125-5G	Artificial saliva / tastant
Syringe pump	Havard Apparatus	PHD ULTRA 4400	Fluidic control
TRITC-dextran	Sigma Aldrich	52194-1G	Animal preparation
Ultrafast fiber laser	Toptica	FFultra920 01042	Microscope
Xylazine	Bayer Korea	Rompun	Animal preparation