μTongue: una piattaforma di imaging funzionale basata sulla microfluidica per la lingua in vivo

Riepilogo

L'articolo introduce il dispositivo μTongue (microfluidica su una lingua) per l'imaging funzionale delle cellule gustative in vivo integrando la microfluidica in una finestra di imaging intravitale sulla lingua.

Abstract

La microscopia a fluorescenza intravitale è uno strumento ampiamente utilizzato per studiare la dinamica multicellulare in un animale vivo. Tuttavia, non è stato utilizzato con successo nell'organo sensoriale del gusto. Integrando la microfluidica nella finestra di imaging della lingua intravitale, μTongue fornisce immagini funzionali affidabili delle cellule del gusto in vivo sotto esposizione controllata a più detastanti. In questo documento, viene presentata una procedura dettagliata passo-passo per utilizzare il sistema μTongue. Ci sono cinque sottosezioni: preparazione di soluzioni tastant, creazione di un modulo microfluidico, montaggio del campione, acquisizione di dati di immagine funzionali e analisi dei dati. Vengono inoltre presentati alcuni suggerimenti e tecniche per risolvere i problemi pratici che possono sorgere quando si utilizza la μTongue.

Introduzione

Il microscopio a fluorescenza intravitale è ampiamente utilizzato per studiare le dinamiche spaziotemporali sui tessuti viventi. I ricercatori stanno rapidamente sviluppando sensori geneticamente codificati che forniscono trasformazioni specifiche e sensibili dei processi biologici in segnali di fluorescenza - che possono essere registrati facilmente utilizzando microscopi a fluorescenza che sono ampiamente disponibili^1,2. Sebbene la maggior parte degli organi interni nei roditori siano stati studiati utilizzando il microscopio, la sua applicazione di successo alla lingua non ha ancora avuto successo³.

Precedenti studi sull'imaging del calcio delle cellule del gusto sono stati condotti ex vivo sezionando un tessuto della lingua per ottenere papille gustative circumvallate^4,5,⁶ o staccando l'epitelio gustatico per ottenere papille gustative fungiformi^7,8. La preparazione di questi campioni era inevitabilmente invasiva, quindi i microambienti naturali come l'innervazione dei nervi, le barriere di permeabilità e la circolazione sanguigna erano in gran parte perturbati. La prima finestra di imaging della lingua intravitale è stata segnalata nel 2015 da Choi et al., ma una registrazione funzionale affidabile non era raggiungibile a causa del movimento e degli artefatti ottici causati dagli stimoli tastanti fluidici⁹.

Recentemente, la microfluidica su una lingua (μTongue) è stata introdotta¹⁰. Questo dispositivo integra un sistema microfluidico con una finestra di imaging sulla lingua del mouse. Raggiungendo un flusso quasi stazionario di stimoli tastanti per tutto il periodo di imaging, gli artefatti del movimento fluidico potrebbero essere ridotti al minimo (Figura 1). La porta di ingresso è alimentata da una serie di regolatori di pressione multicanale, mentre la porta di uscita è collegata a una pompa a siringa, che mantiene 0,3 ml / min. Inoltre, gli artefatti ottici causati dalla differenza negli indici di rifrazione delle soluzioni tastant sono stati ridotti al minimo dall'analisi quantoometrica introducendo un indicatore insensibile al calcio (tdTomato) e l'indicatore del calcio (GCaMP6)¹¹. Questo design ha fornito la stabilità microscopica delle cellule del gusto in vivo anche con bruschi passaggi tra canali fluidici. Di conseguenza, la μTongue implementa uno screening funzionale affidabile di più degustanti alle papille gustative del topo in vivo.

In questo protocollo, le procedure sperimentali sono spiegate in dettaglio per l'imaging del calcio delle papille gustative fungiformi del topo in vivo usando μTongue. In primo luogo, viene descritta la preparazione di saliva artificiale e soluzioni tastant. In secondo luogo, viene introdotta la creazione del sistema microfluidico per raggiungere il flusso quasi stazionario. In terzo luogo, vengono delineate le procedure utilizzate per montare la linguetta del mouse sulla μTongue per consentire l'acquisizione dell'immagine. Infine, viene specificato ogni passaggio per l'analisi delle immagini, compresa la correzione degli artefatti di movimento laterale e la ratiometria. Questo protocollo può essere adattato facilmente a qualsiasi laboratorio di ricerca con una struttura per topi e un microscopio a due fotoni o apparecchiature equivalenti.

Protocollo

Tutte le procedure chirurgiche sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Sungkyunkwan University e della Seoul National University.

1. Preparazione di soluzioni: saliva artificiale e detastanti

1. Preparare la saliva artificiale sciogliendo 2 mM NaCl, 5 mM KCl, 3 mM NaHCO₃, 3 mM KHCO₃, 0,25 mM CaCl₂, 0,25 mM MgCl₂, 0,12 mM K₂HPO₄, 0,12 mM KH₂PO₄e 1,8 mM HCl in acqua distillata (>1 L), e regolare il pH della soluzione a 7 (vedi Tabella dei materiali)¹².
2. Preparare i tastants, come l'acido acido: 10 mM di acido citrico; salato: 400 mM NaCl, opzionalmente con amiloride da 50 μM; dolce: 40 mM acesulfame K; amaro: una miscela di 5 mM chinino, 5 mM di denatonio e 20 μM di cicloeximide, sciogliendo la sostanza chimica di degustazione nella saliva artificiale preparata nella fase 1.1.

2. Preparazione del sistema microfluidico

NOTA: i tastants sono stati consegnati alla lingua del topo utilizzando un sistema di erogazione fluidica multicanale pressurizzato (fare riferimento alla Figura 1 e alla Tabella dei materiali).

1. Riempire i serbatoi del sistema di perfusione a flusso pressurizzato con la saliva artificiale e i detastanti.
2. Collegare la linea dell'aria compressa all'ingresso del regolatore e impostare la pressione dell'aria tra 30 e 50 psi nel sistema di erogazione fluidica.
3. Impostare la pressione di uscita del regolatore a 0,4 psi e verificare se il liquido esce dal tubo sotto questa pressione.
4. Collegare il collettore dai serbatoi alla porta di ingresso di μTongue.
5. Collegare la porta di uscita di μTongue a una pompa a siringa e prelevare il liquido con ~300 μL∙min^-1 per stabilire la condizione di stato stazionario. Osservare il volume costante di una goccia appesa sotto la μTongue. Regolare il valore del parametro di impostazione in base all'altezza del campione.
6. Scollegare la linea dell'aria compressa e arrestare la pompa della siringa fino al completamento della fase 3 del protocollo.

3. Preparazione del mouse per l'imaging in vivo (Figura 2).

NOTA: Tutti i preparati animali sono stati effettuati durante il giorno in condizioni asettiche su un banco di lavoro di laboratorio.

1. Anestesia del topo
   1. Prepara un topo di 7 settimane o più vecchio di entrambi i sessi. Utilizzare una linea di topo geneticamente modificata che esprima proteine di fluorescenza sensibili al calcio nelle cellule del gusto.
   2. Il topo è trattenuto per l'anestesia. Una miscela di 100 mg/kg di ketamina e 10 mg/kg di xilazina viene iniettata per via intraperitoneale nel topo¹³.
2. TRITC-destrano (500 kDa) in 2,5% W/V fosfato tampone soluzione salina viene somministrato per via endovenosa nel topo attraverso una via retro-orbitale per osservare la circolazione sanguigna durante una sessione di imaging.
3. Attaccare un fissatore di testa sul cranio del mouse per ridurre al minimo gli artefatti di movimento.
   1. La testa del mouse viene spruzzata con il 70% di ETOH mentre il mouse viene posto in posizione supina. Sollevare leggermente la pelle della testa con una pinza e tagliare circa 7 mm² con le forbici.
   2. Pulire i capelli intorno al cuoio capelluto, rimuovere il periosteo sotto la pelle, applicare un adesivo istantaneo sul cranio e attaccare un fissatore per la testa personalizzato.
   3. Dopo che l'adesivo istantaneo è indurito, applicare la colla dentale attorno al fissatore della testa e illuminare con una luce blu per solidificare la colla dentale.
4. Posizionare la linguetta del mouse sull'unità inferiore di μTongue.
   1. Fissare il labbro inferiore del mouse all'unità inferiore di μTongue con un adesivo istantaneo.
   2. Posizionare il mouse sulla scheda (scheda di preparazione del mouse nella Figura 1B) e posizionare l'unità inferiore della μTongue ai montanti (μTongue hold post in Figura 1B). Assicurarsi che i fori sul bordo dell'unità inferiore siano allineati al palo.
   3. Stringere il fissatore della testa del mouse al supporto del fissatore della testa sulla scheda. Quindi, regolare la distanza tra la testa del mouse e il dispositivo. Ruotare la testa del mouse senza intoppi di circa 45° utilizzando il supporto del fissatore della testa. Questo processo impedisce il contatto fisico del naso del topo con l'obiettivo del microscopio.
   4. Disegnare delicatamente la linguetta del mouse usando una pinzetta di plastica e attaccare il lato ventrale della lingua al lato superiore dell'unità inferiore della μTongue. Quindi, pulire la superficie della lingua del topo con un batuffolo di cotone bagnato.
   5. Immergere un pezzo di carta nella saliva artificiale e posizionarlo sulla superficie esposta della lingua del topo per mantenere una condizione umida.
   6. Posizionare le rondelle curve sui montanti che contengono entrambe le estremità della parte inferiore di μTongue.
5. Posizionare la preparazione del mouse sul palco del microscopio. Posizionare la lingua del topo esposta sotto il centro approssimativo dell'area dell'obiettivo del microscopio. Assicurati di non deviare dalla gamma dinamica dello stage. Quindi, stringere la scheda del mouse sul palco con le viti.
6. Posizionare la piastra riscaldante sotto il corpo del mouse e mantenere la temperatura a 36,5 °C-37,5 °C. Monitorare la temperatura corporea del mouse con un sensore di temperatura e controllare la temperatura della piastra riscaldante utilizzando un segnale di feedback dal sensore di temperatura.
7. Ruotare un sottile pezzo di carta e posizionarlo alla bocca del mouse per evitare che il liquido penetri nella trachea del mouse.
8. Rimuovere il tessuto bagnato dalla lingua del topo e posizionare la μTongue preparata sulla lingua del topo. Metti un canale microfluidico sulla lingua e regola la sua posizione per osservare la superficie della lingua attraverso la finestra di imaging.
9. Fissare la μTongue avvitando delicatamente entrambe le estremità con una pressione di compressione minima.

4. Acquisizione di immagini

1. Accendere il laser a due fotone da 920 nm e il microscopio prima dell'uso.
2. Montare l'obiettivo di immersione in acqua (16x, NA 0,80 o 25x, NA 1,1) sul microscopio. Lascia cadere l'acqua distillata sulla finestra di imaging della μTongue e immergi l'obiettivo.
3. In modalità fotocamera, accendi la luce usando la lampada al mercurio e illumina la superficie della lingua.
4. Regolando l'asse Z, cerca il segnale autofluorescente dalle papille filiformi per trovare il piano focale approssimativo. Quindi, utilizzando la manopola di regolazione X e Y, individuare una papille gusta mobile.
5. Passare alla modalità multifotone. Impostare le condizioni di acquisizione dell'immagine come segue: lunghezza d'onda di eccitazione: 920 nm; set di filtri di emissione: 447/60 nm, 525/50 nm e 607/70 nm; modalità di scansione raster bidirezionale, dimensioni del fotogramma: 512 x 512.
6. Regola le posizioni X e Y per posizionare la papille gustaá al centro della finestra dell'immagine.
7. Cerca i vasi sanguigni che circondano la papille gusta tra le papille gustative a circa due terzi delle papille gustative. Visualizza la circolazione sanguigna mediante iniezione di TRITC-destrano (500 kDa) dal passo di protocollo 3.2. Se il flusso sanguigno si intasa, allentare leggermente le viti di fissaggio per consentire il flusso sanguigno.
8. Regola l'asse Z e trova il piano Z della papille gustativa che contiene un numero adeguato di cellule gustative.
9. Procedere con l'imaging del calcio con 2-6 Hz per 80 s. Fornire una soluzione di gusto di 20 s accendendo il serbatoio del sistema fluidico dopo l'avvio dell'imaging. Dopo 20 s di stimolazione del gusto, riportare il serbatoio alla saliva artificiale.
10. Al termine dell'imaging sequenziale, attendere circa 3-4 minuti in anticipo fino alla sessione di imaging successiva. Mantenere la saliva artificiale che scorre alla lingua del topo per lavare via il tastant remanent dalla precedente sessione di imaging. A seconda della progettazione dell'esperimento, ripetere la sessione come richiesto.
11. Quando l'imaging del calcio in vivo è completo, eutanasizzare il topo secondo la procedura IACUC. Il topo in anestesia viene sacrificato nella camera CO_2.
    NOTA: Controllare la profondità dell'anestesia utilizzando un riflesso di pizzicamento della dita. Durante una sessione di imaging, la saliva artificiale dai serbatoi deve essere fornita in modo coerente. Se le bolle appaiono nella finestra di imaging della μTongue, rimuovere le bolle spingendole attraverso l'ingresso o l'uscita della μTongue usando una forte pressione del liquido.

5. Analisi delle immagini (Figura 3)

1. Conversione di immagini
   1. Apri i file di immagine raw utilizzando Fiji¹⁴ o un software di analisi delle immagini simile.
   2. Convertire il file di immagine in un file stack RGB per utilizzare il codice NPL Bud Analyzer.
      1. Immagine > colore > canali divisi
      2. Image > Color > Merge Channels e selezionare l'immagine dal passaggio 5.2.1.
      3. Immagine > > a colori in RGB
2. Registrazione immagine
   NOTA: utilizzare il codice personalizzato per l'analisi dei dati. Si prega di fare riferimento a https://github.com/neurophotonic/Tastebud-analyzer.
   1. Eseguire il nome in codice Taste_GUI.m; verrà visualizzata una finestra GUI denominata NPL Bud Analyzer. Fare clic sul pulsante Nuova analisi nell'angolo in alto a destra, quindi caricare l'immagine convertita dal passaggio 5.1. Impostare la frequenza fotogrammi sopra l'immagine caricata.
   2. Disegna la regione di interesse (ROI) sull'immagine caricata per la registrazione. Fai doppio clic sul ROI selezionato e inizierà una registrazione calcolata automaticamente.
3. Ottenere le relative variazioni diintensità di fluorescenza (ΔF/F)
   1. Torna alla finestra NPL Bud Analyzer per mostrare automaticamente l'immagine registrata dal passaggio 5.2. Se l'utente dispone già di un file reg, fare clic sul pulsante Carica dati e selezionare il file _reg.tif.
   2. Fare clic sul pulsante CIRCLE o POLYGON e posizionare il ROI della cella del gusto sull'immagine della pappa gustatica.
   3. Questo presenta l'intensità di fluorescenza grezza e la traccia di calcio (ΔF/F) della cellula gustatica selezionata automaticamente sotto l'immagine della papille gustatica.
   4. Clicca su Salva traccia per presentare la traccia di calcio (ΔF/F) sul lato destro della GUI, mentre il ROI viene mostrato sopra l'immagine della papille gustazia. Ripetere i passaggi 5.3.2-5.3.4 fino al termine della selezione del ROI.
      NOTA: fare clic sul pulsante Elimina traccia se il ROI è selezionato in modo errate per eliminare l'ultimo ROI selezionato e la traccia di calcio.
   5. Al termine della selezione del ROI, scrivi il nome del file nell'angolo in basso a destra e fai clic sul pulsante Fine per esportare la traccia di calcio ΔF/F come formato .xls e l'immagine del tase bud con ROI in un formato .bmp.
4. Analisi della traccia di calcio
   1. Analizzare la traccia di calcio ottenuta dal passaggio 5.3. Si consideri che le cellule del gusto hanno reagito al tastant quando l'intensità della fluorescenza aumenta di più di due deviazioni standard del basale dopo che il tastant è stato consegnato⁴e ivalori p sono inferiori a 0,01, utilizzando t-test accoppiati o spaiati¹⁰.
   2. Considera la cellula del gusto come una cellula di risposta, se risponde a un certo tastant più di due volte su tre studi (~ 60%)¹⁵.
   3. Ottenere le tracce di calcio rappresentative facendo la media delle singole tracce di calcio acquisite dal punto 5.4.1.

Risultati

Il topo Pirt-GCaMP6f-tdTomato è stato utilizzato per ottenere un'immagine delle papille gustative. La superficie della lingua del topo era ricoperta di papille filiformi autofluorescenti. Le papille gustative sono sparse sulla superficie della lingua (Figura 4A). Le immagini della papille gusta e della sua struttura sono state acquisite utilizzando tre diversi rilevatori di filtri. Utilizzando il set di filtri 607/70 nm, è stato ottenuto il segnale tdTomato dalle cellule del gusto per l'an...

Discussione

Qui è descritto un protocollo dettagliato per applicare μTongue allo studio delle attività funzionali delle cellule del gusto in vivo. In questo protocollo, viene eseguita l'imaging funzionale sulle cellule del gusto utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati. Oltre all'uso di topi transgenici, il carico elettroforetico di coloranti di calcio (o coloranti sensibili alla tensione) sulle cellule del gusto può essere un'opzione alternativa.

In questo esperimento sono s...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
acesulfame K	Sigma Aldrich	04054-25G	Artificial saliva / tastant
calcium chloride solution	Sigma Aldrich	21115-100ML	Artificial saliva / tastant
citric acid	Sigma Aldrich	C0759-100G	Artificial saliva / tastant
cycloheximide	Sigma Aldrich	01810-5G	Artificial saliva / tastant
denatonium	Sigma Aldrich	D5765-5G	Artificial saliva / tastant
Dental glue	Denkist	P0000CJT-A2	Animal preparation
Image J	NIH	ImageJ	Data analysis
IMP	Sigma Aldrich	57510-5G	Artificial saliva / tastant
Instant adhesive	Loctite	Loctite 4161, Henkel	Animal preparation
K2HPO4	Sigma Aldrich	P3786-100G	Artificial saliva / tastant
KCl	Sigma Aldrich	P9541-500G	Artificial saliva / tastant
Ketamine	Yuhan	Ketamine 50	Animal preparation
KH2PO4	Sigma Aldrich	P0662-25G	Artificial saliva / tastant
KHCO3	Sigma Aldrich	237205-500G	Artificial saliva / tastant
MATLAB	Mathwork	MATLAB	Data analysis
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266-100G	Artificial saliva / tastant
MPG	Sigma Aldrich	49601-100G	Artificial saliva / tastant
Mutiphoton microscope	Thorlab	Bergamo II	Microscope
NaCl	Sigma Aldrich	S3014-500G	Artificial saliva / tastant
NaHCO3	Sigma Aldrich	792519-500G	Artificial saliva / tastant
Objective	Nikon	N16XLWD-PF	Microscope
Octaflow	ALA Scientific Instruments	OCTAFLOW II	Fluidic control
PC	LG	Lg15N54	Fluidic control
PH meter	Thermoscientific	ORION STAR AZ11	Artificial saliva / tastant
Phosphate-buffered saline	Sigma Aldrich	806562	Artificial saliva / tastant
quinine	Sigma Aldrich	Q1125-5G	Artificial saliva / tastant
Syringe pump	Havard Apparatus	PHD ULTRA 4400	Fluidic control
TRITC-dextran	Sigma Aldrich	52194-1G	Animal preparation
Ultrafast fiber laser	Toptica	FFultra920 01042	Microscope
Xylazine	Bayer Korea	Rompun	Animal preparation