μTongue: Uma plataforma de imagem funcional baseada em microfluidics para a língua in vivo

Resumo

O artigo introduz o dispositivo μTongue (microfluidos-em-uma-língua) para imagens de células de paladar funcional in vivo, integrando microfluidos em uma janela de imagem intravital na língua.

Resumo

A microscopia de fluorescência intravital é uma ferramenta amplamente utilizada para estudar a dinâmica multicelular em um animal vivo. No entanto, não foi usado com sucesso no órgão sensorial de sabor. Ao integrar microfluidos na janela de imagem intravital da língua, o μTongue fornece imagens funcionais confiáveis de células de paladar in vivo sob exposição controlada a vários tastants. Neste artigo, é apresentado um procedimento passo a passo detalhado para utilizar o sistema μTongue. São cinco subseções: preparação de soluções tastant, criação de um módulo microfluido, montagem de amostras, aquisição de dados de imagem funcionais e análise de dados. Algumas dicas e técnicas para resolver as questões práticas que podem surgir ao usar o μTongue também são apresentadas.

Introdução

O microscópio de fluorescência intravital é amplamente utilizado para estudar a dinâmica espostetemporal em tecidos vivos. Pesquisadores estão desenvolvendo rapidamente sensores geneticamente codificados que fornecem transformações específicas e sensíveis dos processos biológicos em sinais de fluorescência - que podem ser registrados prontamente usando microscópios de fluorescência que estão amplamente disponíveis^1,2. Embora a maioria dos órgãos internos em roedores tenham sido investigados usando o microscópio, sua aplicação bem sucedida na língua ainda não foi bem sucedida³.

Estudos anteriores sobre a imagem de cálcio das células gustativas foram realizados ex vivo por secção fina de um tecido da língua para obter papilas gustativas circunvaloladas^4,5,⁶ ou descascando o epitélio de sabor para obter papilas gustativas fungiformas^7,8. A preparação dessas amostras foi inevitavelmente invasiva, assim, os microambientes naturais, como a inervação dos nervos, as barreiras de permeabilidade e a circulação sanguínea, foram em grande parte perturbados. A primeira janela intravital de imagem da língua foi relatada em 2015 por Choi et al., mas a gravação funcional confiável não foi alcançável devido ao movimento e artefatos ópticos causados pelo estímulo tastante fluido⁹.

Recentemente, microfluidos-em-uma-língua (μTongue) foi introduzido¹⁰. Este dispositivo integra um sistema microfluido com uma janela de imagem na língua do rato. Ao atingir um fluxo de estado quase estável de estímulos tastantes durante todo o período de imagem, artefatos do movimento fluido poderiam ser minimizados(Figura 1). A porta de entrada é alimentada por uma série de controladores de pressão multicanal, enquanto a porta de saída está conectada a uma bomba de seringa, que mantém 0,3 mL/min. Além disso, artefatos ópticos causados pela diferença nos índices de refração das soluções tastant foram minimizados pela análise ratiométrica introduzindo um indicador insensível de cálcio (tdTomato) bem como o indicador de cálcio (GCaMP6)¹¹. Este design proporcionou estabilidade microscópica das células de paladar in vivo mesmo com a troca abrupta entre canais fluidos. Consequentemente, o μTongue implementa uma triagem funcional confiável de vários tastants para as papilas gustativas do mouse in vivo.

Neste protocolo, os procedimentos experimentais são explicados em detalhes para a imagem de cálcio das papilas gustativas fungiformas do camundongo in vivo usando μTongue. Em primeiro lugar, descreve-se a preparação de saliva artificial e soluções saborosas. Em segundo lugar, a configuração do sistema microfluido para alcançar o fluxo de estado quase estável é introduzida. Em terceiro lugar, os procedimentos utilizados para montar a língua do rato no μTongue para permitir a aquisição de imagens são delineados. Por fim, cada passo para análise de imagem, incluindo correção de artefatos de movimento lateral e razãometria, é especificado. Este protocolo pode ser adaptado prontamente para qualquer laboratório de pesquisa com uma instalação de mouse e um microscópio de dois fótons ou equipamento equivalente.

Protocolo

Todos os procedimentos cirúrgicos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Sungkyunkwan e da Universidade Nacional de Seul.

1. Preparação de soluções: saliva artificial e tastants

1. Prepare a saliva artificial dissolvendo 2 mM NaCl, 5 mM KCl, 3 mM NaHCO₃, 3 mM KHCO₃, 0,25 mM CaCl₂, 0,25 mM MgCl₂, 0,12 mM K₂HPO₄, 0,12 mM KH₂PO₄e 1,8 mM HCl em água destilada (>1 L), e ajuste o pH da solução para 7 (ver Tabela de Materiais)¹².
2. Preparar tastants, como azedo: ácido cítrico de 10 mM; salgado: 400 mM NaCl, opcionalmente com 50 μM de amiloride; doce: 40 mM acesulfame K; amargo: uma mistura de 5 mM de quinina, 5 mM de denatonium e cicloheximida de 20 μM, dissolvendo o produto químico degustação na saliva artificial preparada na etapa 1.1.

2. Preparação do sistema microfluido

NOTA: Os tastants foram entregues na língua do rato usando um sistema de entrega de fluidos multicanais pressurizados (consulte Figura 1 e Tabela de Materiais).

1. Encha os reservatórios do sistema de perfusão de fluxo pressurizado com saliva artificial e tastants.
2. Conecte a linha de ar comprimido à entrada do regulador e coloque a pressão de ar entre 30 e 50 psi no sistema de entrega fluida.
3. Defina a pressão de saída do regulador para 0,4 psi e verifique se o líquido sai do tubo sob esta pressão.
4. Conecte o coletor dos reservatórios à porta de entrada de μTongue.
5. Conecte a porta de saída de μTongue a uma bomba de seringa e retire o líquido com ~300 μL∙min^-1 para estabelecer a condição de estado estável. Observe o volume constante de uma gotícula pendurada sob a μTongue. Ajuste o valor do parâmetro de configuração dependendo da altura da amostra.
6. Desconecte a linha de ar comprimido e pare a bomba de seringa até que o protocolo 3 seja concluído.

3. Preparação do mouse para imagens in vivo (Figura 2).

NOTA: Todas as preparações dos animais foram realizadas durante o dia sob condições assépticas em uma bancada de laboratório.

1. Anestesia do rato
   1. Prepare um rato de 7 semanas ou mais velho de ambos os sexos. Use uma linha de camundongos geneticamente modificada que expresse proteínas de fluorescência sensoriais de cálcio nas células de sabor.
   2. O rato é contido para anestesia. Uma mistura de 100 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de xilazina é injetada intraperitonealmente no mouse¹³.
2. TRITC-dextran (500 kDa) em 2,5% W/V tampão de fosfato é administrado por via intravenosa no camundongo através de uma rota retro-orbital para observar a circulação sanguínea durante uma sessão de imagem.
3. Coloque um fixador de cabeça no crânio do mouse para minimizar os artefatos de movimento.
   1. A cabeça do mouse é pulverizada com 70% de ETOH, enquanto o mouse é colocado em uma posição supina. Levante levemente a pele da cabeça com fórceps e corte aproximadamente 7 mm² com uma tesoura.
   2. Limpe o cabelo ao redor do couro cabeludo, remova o periosteum sob a pele, aplique um adesivo instantâneo no crânio e anexe um fixador de cabeça personalizado.
   3. Após o adesivo instantâneo endurecer, aplique cola dentária ao redor do fixador da cabeça e ilumine com uma luz azul para solidificar a cola dentária.
4. Coloque a língua do rato na unidade inferior da μTongue.
   1. Conecte o lábio inferior do mouse à unidade inferior de μTongue com um adesivo instantâneo.
   2. Coloque o mouse na placa (placa de preparação do mouse na Figura 1B) e coloque a unidade inferior do μTongue nos postes (μTongue mantenha o poste na Figura 1B). Certifique-se de que os orifícios na borda da unidade inferior estejam alinhados ao poste.
   3. Aperte o fixador da cabeça do mouse no suporte do fixador de cabeça na placa. Em seguida, ajuste a distância entre a cabeça do mouse e o dispositivo. Gire a cabeça do mouse suavemente aproximadamente 45° usando o suporte do fixador de cabeça. Este processo impede o contato físico do nariz do mouse com o objetivo do microscópio.
   4. Desenhe a língua do rato suavemente usando pinças de plástico e conecte o lado ventral da língua ao lado superior da unidade inferior da μTongue. Em seguida, limpe a superfície da língua do rato com um cotonete molhado.
   5. Mergulhe um pedaço de papel na saliva artificial e coloque-o sobre a superfície exposta da língua do rato para manter uma condição úmida.
   6. Coloque as arruelas curvas nos postes que seguram as duas extremidades da parte inferior do μTongue.
5. Coloque a preparação do mouse no estágio do microscópio. Posicione a língua do rato exposta sob o centro aproximado da área objetiva do microscópio. Certifique-se de não se desviar do alcance dinâmico do palco. Em seguida, aperte a placa do mouse no palco com parafusos.
6. Coloque a almofada de aquecimento sob o corpo do mouse e mantenha a temperatura em 36,5 °C-37,5 °C. Monitore a temperatura do corpo do mouse com um sensor de temperatura e controle a temperatura da almofada de aquecimento usando um sinal de feedback do sensor de temperatura.
7. Torça um pedaço fino de papel e coloque-o na boca do mouse para evitar que o líquido entre na traqueia do rato.
8. Retire o tecido molhado da língua do rato e coloque o μTongue preparado na língua do rato. Coloque um canal microfluido na língua e ajuste sua posição para observar a superfície da língua através da janela de imagem.
9. Fixar o μTongue aparafusando suavemente em ambas as extremidades com pressão compressiva mínima.

4. Aquisição de imagens

1. Ligue o laser de 920 nm de dois fótons e o microscópio antes do uso.
2. Monte o objetivo de imersão em água (16x, NA 0,80 ou 25x, NA 1.1) no microscópio. Solte a água destilada na janela de imagem do μTongue e mergulhe o objetivo.
3. No modo câmera, acenda a luz usando lâmpada de mercúrio e ilumine a superfície da língua.
4. Ajustando o eixo Z, procure o sinal autofluorescente a partir das papilas filiformes para encontrar o plano focal aproximado. Em seguida, usando o botão de ajuste X e Y, localize uma papila gustativa.
5. Mude para o modo multifotônio. Definir as condições de aquisição de imagem da seguinte forma: comprimento de onda de excitação: 920 nm; conjunto de filtro de emissão: 447/60 nm, 525/50 nm e 607/70 nm; modo de varredura rasteral bidirecional, tamanho do quadro: 512 x 512.
6. Ajuste as posições X e Y para colocar a papila gustativa no centro da janela da imagem.
7. Procure nos vasos sanguíneos ao redor da papila gustativa a cerca de dois terços da altura da papila gustativa. Visualize a circulação sanguínea pela injeção TRITC-dextran (500 kDa) a partir da etapa 3.2 do protocolo. Se o fluxo sanguíneo obstruír, solte ligeiramente os parafusos de fixação para permitir o fluxo sanguíneo.
8. Ajuste o eixo Z e encontre o plano Z da papila gustativa que contém um número adequado de células de sabor.
9. Proceda a imagem de cálcio com 2-6 Hz para 80 s. Forneça uma solução de sabor de 20 s ligando o reservatório do sistema fluido após o início da imagem. Depois de 20 s de estimulação de sabor, mude o reservatório de volta para saliva artificial.
10. Depois que a imagem sequencial estiver concluída, aguarde cerca de 3-4 minutos de antecedência para a próxima sessão de imagem. Mantenha a saliva artificial fluindo para a língua do rato para lavar o remanente tastant da sessão de imagem anterior. Dependendo do desenho do experimento, repita a sessão conforme necessário.
11. Quando a imagem in vivo de cálcio estiver completa, eutanize o mouse de acordo com o procedimento iACUC. O rato sob anestesia é sacrificado na câmara de CO_2.
    NOTA: Verifique a profundidade da anestesia usando um reflexo de dedo do dedo do dedo do sol. Durante uma sessão de imagem, a saliva artificial dos reservatórios deve ser fornecida de forma consistente. Se aparecerem bolhas na janela de imagem do μTongue, remova as bolhas empurrando-as através da entrada ou da saída do μTongue usando forte pressão líquida.

5. Análise de imagem(Figura 3)

1. Conversão de imagem
   1. Abra os arquivos de imagem bruta usando Fiji¹⁴ ou um software de análise de imagem semelhante.
   2. Converta o arquivo de imagem em um arquivo de pilha RGB para usar o código NPL Bud Analyzer.
      1. Imagem > cores > canais divididos
      2. Imagem > Color > Mesclar canais e selecione a imagem a partir da etapa 5.2.1.
      3. Imagem > Color > Stack para RGB
2. Registro de imagem
   NOTA: Use o código personalizado para análise de dados. Por favor, consulte https://github.com/neurophotonic/Tastebud-analyzer.
   1. Execute o código chamado Taste_GUI.m; uma janela GUI chamada NPL Bud Analyzer aparecerá. Clique no botão Nova Análise no canto superior direito e, em seguida, carregue a imagem convertida a partir da etapa 5.1. Defina a taxa de quadros acima da imagem carregada.
   2. Desenhe a região de interesse (ROI) sobre a imagem carregada para registro. Clique duas vezes no ROI selecionado e um registro calculado automaticamente será inicial.
3. Obtenha as alterações relativas da intensidade da fluorescência (ΔF/F)
   1. Volte para a janela NPL Bud Analyzer para mostrar a imagem registrada da etapa 5.2 automaticamente. Se o usuário já tiver um arquivo reg, clique no botão Dados de carga e selecione o arquivo _reg.tif.
   2. Clique no botão CIRCLE ou POLYGON e posicione o ROI da célula de paladar sobre a imagem da papila gustativa.
   3. Isso apresenta a intensidade da fluorescência bruta e o traço de cálcio (ΔF/F) da célula de paladar selecionada automaticamente sob a imagem da papila gustativa.
   4. Clique em Salvar traço para apresentar o traço de cálcio (ΔF/F) no lado direito da GUI, enquanto o ROI é mostrado sobre a imagem da papila gustativa. Repetição de passos 5.3.2-5.3.4 até que a seleção do ROI seja concluída.
      NOTA: Clique no botão Excluir traço se o ROI for selecionado erroneamente para eliminar o último traço de ROI e cálcio selecionados.
   5. Após a seleção do ROI terminar, escreva o nome do arquivo no canto inferior direito e clique no botão Terminar para exportar o traço de cálcio ΔF/Fcomo um formato de .xls e a imagem do botão tase com ROIs em um formato .bmp.
4. Análise do traço de cálcio
   1. Analise o traço de cálcio obtido a partir da etapa 5.3. Considere que as células de paladar reagiram ao sabor quando a intensidade da fluorescência aumenta mais de dois desvios padrão da linha de base após a entrega do tastant⁴, e p-valores são inferiores a 0,01, usando testes t-10emparelhados ou não não pagos .
   2. Considere a célula de paladar como uma célula de resposta, se ela responder a um certo tastant mais de duas vezes em três ensaios (~60%)¹⁵.
   3. Obtenha os traços representativos de cálcio, obtendo traços de cálcio individuais adquiridos a partir da etapa 5.4.1.

Resultados

O mouse Pirt-GCaMP6f-tdTomato foi usado para obter uma imagem de paladar. A superfície da língua do rato estava coberta com papilas filiformes filiformes autofluorescentes. As papilas gustativas são espalhadas esparsamente sobre a superfície da língua(Figura 4A). As imagens da papila gustativa e sua estrutura foram adquiridas utilizando três detectores de filtros diferentes. Utilizando o conjunto de filtros de 607/70 nm, o sinal tdTomato das células gustares foi obtido para análise r...

Discussão

Descrito aqui é um protocolo detalhado para aplicar μTongue à investigação de atividades funcionais de células de paladar in vivo. Neste protocolo, é realizada a imagem funcional nas células gusticuladas utilizando indicadores de cálcio geneticamente codificados. Além do uso de camundongos transgênicos, o carregamento eletroforético de corantes de cálcio (ou corantes de sensoriamento de tensão) nas células gustativas pode ser uma opção alternativa.

Todas as soluções...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
acesulfame K	Sigma Aldrich	04054-25G	Artificial saliva / tastant
calcium chloride solution	Sigma Aldrich	21115-100ML	Artificial saliva / tastant
citric acid	Sigma Aldrich	C0759-100G	Artificial saliva / tastant
cycloheximide	Sigma Aldrich	01810-5G	Artificial saliva / tastant
denatonium	Sigma Aldrich	D5765-5G	Artificial saliva / tastant
Dental glue	Denkist	P0000CJT-A2	Animal preparation
Image J	NIH	ImageJ	Data analysis
IMP	Sigma Aldrich	57510-5G	Artificial saliva / tastant
Instant adhesive	Loctite	Loctite 4161, Henkel	Animal preparation
K2HPO4	Sigma Aldrich	P3786-100G	Artificial saliva / tastant
KCl	Sigma Aldrich	P9541-500G	Artificial saliva / tastant
Ketamine	Yuhan	Ketamine 50	Animal preparation
KH2PO4	Sigma Aldrich	P0662-25G	Artificial saliva / tastant
KHCO3	Sigma Aldrich	237205-500G	Artificial saliva / tastant
MATLAB	Mathwork	MATLAB	Data analysis
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266-100G	Artificial saliva / tastant
MPG	Sigma Aldrich	49601-100G	Artificial saliva / tastant
Mutiphoton microscope	Thorlab	Bergamo II	Microscope
NaCl	Sigma Aldrich	S3014-500G	Artificial saliva / tastant
NaHCO3	Sigma Aldrich	792519-500G	Artificial saliva / tastant
Objective	Nikon	N16XLWD-PF	Microscope
Octaflow	ALA Scientific Instruments	OCTAFLOW II	Fluidic control
PC	LG	Lg15N54	Fluidic control
PH meter	Thermoscientific	ORION STAR AZ11	Artificial saliva / tastant
Phosphate-buffered saline	Sigma Aldrich	806562	Artificial saliva / tastant
quinine	Sigma Aldrich	Q1125-5G	Artificial saliva / tastant
Syringe pump	Havard Apparatus	PHD ULTRA 4400	Fluidic control
TRITC-dextran	Sigma Aldrich	52194-1G	Animal preparation
Ultrafast fiber laser	Toptica	FFultra920 01042	Microscope
Xylazine	Bayer Korea	Rompun	Animal preparation