Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ארגינין חלבון (R)-מתילציה הוא שינוי פוסט-תרגומי נרחב המווסת מסלולים ביולוגיים מרובים. ספקטרומטריית מסות היא הטכנולוגיה הטובה ביותר ליצירת פרופיל עולמי של R-מתיל-פרוטאום, כאשר היא משולבת לגישות ביוכימיות להעשרת פפטידים מותאמים. תהליך העבודה המיועד לזיהוי בביטחון גבוה של מתילציה גלובלית של R בתאים אנושיים מתואר כאן.

Abstract

ארגינין חלבון (R)-מתילציה הוא שינוי חלבוני נפוץ לאחר תרגום (PTM) המעורב בוויסות של מספר מסלולים תאיים, כולל עיבוד RNA, התמרת אותות, תגובת נזק לדנ"א, ביוגנזה של miRNA ותרגום.

בשנים האחרונות, הודות להתפתחויות ביוכימיות ואנליטיות, פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות (MS) התגלתה כאסטרטגיה היעילה ביותר לאפיון מתיל פרוטאום תאי ברזולוציה של אתר יחיד. עם זאת, זיהוי ויצירת פרופיל של חלבון in vivo R-methylation על ידי טרשת נפוצה נותר מאתגר ומועד לטעויות, בעיקר בשל האופי הסובסטואיכיומטרי של שינוי זה ונוכחותם של תחליפי חומצות אמינו שונים ומתיל-אסטריפיקציה כימית של שאריות חומציות שהן איזובריות למתילציה. לפיכך, נדרשות שיטות העשרה לשיפור הזיהוי של R-מתיל-פפטידים ואסטרטגיות אימות אורתוגונליות להפחתת שיעורי גילוי כוזב (FDR) במחקרי מתיל-פרוטאומיקה.

כאן מתואר פרוטוקול שתוכנן במיוחד לזיהוי וכמות של R-מתיל-פפטידים בביטחון גבוה מדגימות תאים, אשר משלב תיוג מטבולי של תאים עם מתיונין בקידוד איזוטופים כבד (hmSILAC) ועיכול כפול של פרוטאז בתמיסה של תמצית תאים שלמים, ולאחר מכן פיצול כרומטוגרפיה לא מקוונת של שלב הפוך ב-pH גבוה (HpH-RP) והעשרת זיקה של R-מתיל-פפטידים באמצעות נוגדנים נגד פאן-R-מתיל. לאחר ניתוח טרשת נפוצה ברזולוציה גבוהה, נתונים גולמיים מעובדים תחילה עם חבילת התוכנה MaxQuant והתוצאות מנותחות לאחר מכן על ידי hmSEEKER, תוכנה המיועדת לחיפוש מעמיק של זוגות שיא MS המתאימים למתיל-פפטיד קל וכבד בתוך קבצי הפלט MaxQuant.

Introduction

ארגינין (R)-מתילציה הוא שינוי פוסט-תרגומי (PTM) המעטר כ-1% מהפרוטאום של היונקים1. חלבון ארגינין מתיל-טרנספראזות (PRMTs) הם האנזימים המזרזים את תגובת המתילציה של R על ידי תצהיר של קבוצת מתיל אחת או שתיים לאטומי החנקן (N) של חבורת הגואנידינו בשרשרת הצדדית של R באופן סימטרי או אסימטרי. ביונקים, ניתן לקבץ PRMTs לשלוש מחלקות - סוג I, סוג II וסוג III - בהתאם ליכולתם להפקיד הן מונו-מתילציה (MMA) והן די-מתילציה אסימטרית (ADMA), MMA ודי-מתילציה סימטרית (SDMA) או רק MMA,בהתאמה 2,3. PRMT מתמקדים בעיקר בשאריות R הממוקמות באזורים עשירים בגליצין וארגינין, הידועים כמוטיבים של GAR, אך PRMTs מסוימים, כגון PRMT5 ו-CARM1, יכולים לבצע מתיל-מאט של מוטיבים עשירים בפרולין-גליצין-מתיונין (PGM)4. R-מתילציה התגלתה כמודולטור חלבונים של מספר תהליכים ביולוגיים, כגון שחבור RNA5, תיקון DNA6, ביוגנזה של miRNA7 ותרגום2, מה שמעודד את המחקר על PTM זה.

ספקטרומטריית מסה (MS) מוכרת כטכנולוגיה היעילה ביותר לחקור באופן שיטתי R-מתילציה גלובלית ברזולוציית חלבון, פפטיד ואתר. עם זאת, PTM זה דורש כמה אמצעי זהירות מיוחדים עבור זיהוי הביטחון הגבוה שלה על ידי טרשת נפוצה. ראשית, מתילציה של R היא תת-קרקעית, כאשר הצורה הלא-משתנה של הפפטידים שופעת הרבה יותר מזו ששונתה, כך שספקטרומטרים של מסה הפועלים במצב רכישה תלוית נתונים (DDA) יחלקו פפטידים בעוצמה גבוהה ללא שינוי לעתים קרובות יותר מאשר עמיתיהם בעלי המתילציה בעוצמה נמוכה יותר8. יתר על כן, רוב תהליכי העבודה מבוססי MS לזיהוי אתרים עם מתילציה R סובלים ממגבלות ברמת הניתוח הביואינפורמטי. ואכן, הזיהוי החישובי של מתיל-פפטידים נוטה לשיעורי גילוי שווא גבוהים (FDR), מכיוון ש-PTM זה הוא איזוברי לתחליפי חומצות אמינו שונים (למשל, גליצין לאלנין) ולשינויים כימיים, כגון מתיל-אסטריפיקציה של אספרטט וגלוטמט9. לפיכך, שיטות המבוססות על תיוג איזוטופים של קבוצות מתיל, כגון תיוג איזוטופים כבדים של מתיל יציב עם חומצות אמינו בתרבית תאים (hmSILAC), יושמו כאסטרטגיות אורתוגונליות לזיהוי בטוח של MS של מתילציות in vivo , והפחיתו באופן משמעותי את שיעור הביאורים החיוביים השגויים10.

לאחרונה, פרוטוקולים שונים של פרוטאום לחקר חלבונים שעברו מתילציה של R עברו אופטימיזציה. פיתוח אסטרטגיות מבוססות נוגדנים להעשרת זיקה חיסונית של R-מתיל-פפטידים הוביל לביאור של כמה מאות אתרי R-מתילציה בתאים אנושיים11,12. יתר על כן, מחקרים רבים 3,13 דיווחו כי צימוד העשרה מבוססת נוגדנים עם טכניקות הפרדת פפטידים כגון פיצול כרומטוגרפיה של HpH-RP יכול להגביר את המספר הכולל של מתיל פפטידים שזוהו.

מאמר זה מתאר אסטרטגיה ניסיונית המיועדת לזיהוי שיטתי ובטוח של אתרי R-מתילציה בתאים אנושיים, המבוססת על שלבים ביוכימיים ואנליטיים שונים: מיצוי חלבונים מתאים המסומנים ב- hmSILAC, עיכול אנזימטי כפול מקביל עם פרוטאזות טריפסין ו- LysargiNase, ולאחר מכן פיצול כרומטוגרפי של HpH-RP של פפטידים מעוכלים, יחד עם העשרת זיקה חיסונית מבוססת נוגדנים של MMA-, SDMA-, ופפטידים המכילים ADMA. לאחר מכן, כל הפפטידים המועשרים באהדה מנותחים על-ידי כרומטוגרפיה נוזלית ברזולוציה גבוהה (LC)-MS/MS במצב DDA, ונתוני MS גולמיים מעובדים על-ידי אלגוריתם MaxQuant לזיהוי פפטידים מסוג R-מתיל-פפטידים. לבסוף, תוצאות הפלט של MaxQuant מעובדות באמצעות hmSEEKER, כלי ביואינפורמטיקה שפותח על ידי החברה לחיפוש זוגות של מתיל-פפטידים כבדים וקלים. בקצרה, hmSEEKER קורא ומסנן זיהויי מתיל-פפטידים מקובץ ה-MSMS, לאחר מכן מתאים כל מתיל-פפטיד לשיא MS1 המתאים לו בקובץ allPeptides, ולבסוף, מחפש את השיא של מקבילו הפפטיד הכבד/קל. עבור כל זוג פוטטיבי כבד-קל, מחושבים הפרמטרים Log2 H/L (LogRatio), הפרש זמן השמירה (dRT) ו- Mass Error (ME), וכפילים הממוקמים בתוך חתכים המוגדרים על-ידי המשתמש מסומנים כחיוביים אמיתיים. זרימת העבודה של הפרוטוקול הביוכימי מתוארת באיור 1.

Protocol

1. גידול תאים ומיצוי חלבונים (זמן: 3 - 4 שבועות נדרשים)

  1. לגדל תאי HeLa במקביל במדיה המסופקת עם מתיונין קל (L) או כבד (H), בהתאמה ( ראה טבלה 1 להרכב מדיה). לאחר לפחות שמונה חלוקות תאים, לאסוף aliquot של תאים מכל ערוץ SILAC ולבצע את בדיקת השילוב.
    הערה: כדי לבדוק את יעילות השילוב, בדוק על-ידי ניתוח LC-MS/MS שאחוז המתיונין הכבד (Met-4) בערוץ הכבד קרוב ככל האפשר ל-100%. נתח אליקוט של תאים בעלי תווית כבדה על-ידי LC-MS/MS (לקבלת הגדרות, ראה טבלה 2), ולאחר מכן עבד את נתוני MS באמצעות MaxQuant באמצעות הפרמטרים המצוינים בטבלה 3. כדי לבדוק את שילוב Met-4 סקריפט מפותח פנימי זמין ב- https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/.
  2. חשבו על התאגדות כבדה של מתיונין כמושלמת כאשר היא מגיעה ל->97%. כאשר כל ערוץ מגיע למספר כולל של כ-60 x 106 תאים (המתאימים לכ-40 מנות של 15 ס"מ כל אחת במפגש של 85% עבור תאי HeLa, עם וריאציות בהתאם לסוג התא) קוצרים אותם. סופרים אותם בקפידה, מערבבים ביחס של 1:1 וכדור על ידי צנטריפוגה ב 335 x g במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: כדי להעריך ערבוב נכון של 1:1 ליטר/שעה, יש לשמור על אליקוט ולהריץ אותו על פרוסת ג'ל שידועה כמכילה שפע גבוה וחלבון R-מתילציה בכבדות (למשל, פיברילרין). אם התיוג היה מוצלח והושג ערבוב של 1:1, אמור להיות יחס של 1:1 של גרסאות קלות וכבדות של פפטידים R-מתילציה שנמצאים בדגימה. לחלופין, שמור על אליקוט של דגימה מעורבת לניתוח על ידי LC-MS/MS, ולאחר מכן עבד את נתוני MS עם MaxQuant באמצעות הפרמטרים המצוינים בטבלה 3 והתווה את התפלגות יחס Log2 H/L כפי שמתואר באיור 2C. ניתן לעצור את הפרוטוקול כאן על ידי הקפאת ההצמדה של הכדור ואחסונו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  3. השהה מחדש את גלולת התא בארבעה כרכים של Lysis Buffer (ראה טבלה 1 להרכב Lysis Buffer) ביחס לנפח גלולת התא. לדוגמה, השתמש 6 מ"ל של Lysis Buffer עבור גלולה מ 120 x 10 6תאי הלה (60 x 106 קל + 60 x 10 6 כבד) המתאים נפח 1.5 מ"ל.
    הערה: מיצוי חלבון חייב להתבצע בטמפרטורת החדר (RT) מכיוון שמאגר Lysis מכיל את החומר הכאוטרופי 9 M אוריאה המזרז בטמפרטורת הקרח; לכן, תוספת של ספקטרום רחב של מעכבי פרוטאז סרין וציסטאין חשובה, כמו גם מעכבי פוספטאזות, כדי להגן בו זמנית על חלבונים מפני פירוק פרוטאוליטי ודה-פוספורילציה, קוקטייל של מעכבי פרוטאז ופוספטאז זמינים מסחרית כטבליות קטנות, ראה טבלה 1 וטבלת חומרים.
  4. סוניקו את הדגימה עם סוניקטור משבש תאי מיקרוטיפ למשך חמישה מחזורים לפחות של 15 שניות ON ו-30 שניות כבויים, כדי להבטיח שבירה יעילה של קרומי התא ושחרור וגזירה של DNA. בדוק את צמיגות התמצית על ידי צינורית התמיסה למעלה ולמטה. אם הוא צמיג מדי עקב גזירת דנ"א לא שלמה וסולוביזציה של הממברנה, חזור על מחזורי הסוניקציה.
    הערה: ודא שהדגימה אינה מתחממת יתר על המידה במהלך סוניקציה, מכיוון שטמפרטורה גבוהה עלולה להזיק לחלבונים. עם זאת, לא ניתן לשים את הדגימה על קרח בין מחזורי סוניקציה, בגלל נוכחות של 9M אוריאה; לפיכך, מומלץ להשהות למשך 60 שניות כבוי בין מחזורי סוניקציה שונים. יתר על כן, למנוע היווצרות של בועות אוויר במהלך סוניקציה כי הם מפחיתים את יעילות סוניקציה.
  5. צנטריפוגה של התמצית ב 3,000 x גרם במשך 10 דקות ב RT כדי לזרוק את הפסולת ולהעביר את supernatant בצינור חדש 15 מ"ל.
  6. מדוד את תכולת החלבון של התמצית באמצעות בדיקה colorimetric, כגון ברדפורד או חומצה ביסינצ'ונינית (BCA)14,15. כמות התחלתית אופטימלית של תמצית חלבון עבור פרוטוקול זה היא בין 20-30 מ"ג.
    הערה: מאגרי Lysis המכילים אוריאה בריכוז גבוה תואמים הן לבדיקת כימות ברדפורד והן לבדיקת כימות BCA; סוגים אחרים של חיץ ליזה, כגון אלה הכוללים ריכוז גבוה של נתרן דודציל סולפט (SDS), אינם תואמים לברדפורד.

2.  עיכול ליזאט (זמן אינדיקטיבי נדרש שעתיים)

  1. בצע הפחתה של קבוצת תיול (-SH) של חלבונים באמצעות תמיסת מלאי של dithiothreitol (DTT) מומס במים אולטרה-פוריים בריכוז סופי של 4.5 mM ושחרר את התגובה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 55 °C.
    הערה: ניתן להכין תמיסת DTT של 1 M ולאחסן אותה בטמפרטורה של -20°C למשך עד חודש אחד, תוך הפשרת רק את האליקוטים הדרושים לכל ניסוי. לחלופין, ניתן להשתמש בסולפהידריל רדוקטנט טריס-(2-קרבוקסיאתיל)-פוספין (TCEP) כדי לבצע הפחתה של קבוצות -SH; במיוחד עבור אחסון ארוך טווח של חלבונים, TCEP יציב יותר באופן משמעותי מ- DTT ללא כלאטים מתכתיים כגון EGTA במאגר, בעוד ש- DTT יציב יותר אם תצביות מתכת נמצאות16.
  2. בצע אלקילציה של קבוצת תיול (-SH) של חלבונים על ידי הוספת יודואצטמיד (IAA) בריכוז של 10 mM ודגרה במשך 15 דקות ב- RT בחושך. בצע את הדגירה של חלבונים מופקים עם תמיסת IAA בחושך מכיוון ש- IAA רגיש לאור.
    הערה: יש להכין את תמיסת המלאי של IAA ב-100 mM טרייה לפני כל ניסוי. לחלופין, ניתן להשתמש בכלורואצטמיד לביצוע אלקילציה של קבוצות -SH, במיוחד אם מטרת הניסוי היא לנתח שיחות צולבות בין מתילציה לאוביקוויטינציה מכיוון שחפצים המושרים על ידי IAA מחקים יוביקוויטינציה17.
  3. לפני שתמשיך עם שלב עיכול החלבון, שמור אליקוט של תמצית חלבון (1/1,000 של התחלת ליזאט לא מעוכל) לניתוח מאוחר יותר על ג'ל מוכתם ב- SDS-PAGE Coomassie והשוואה עם כמות מקבילה של דגימה בעת העיכול; בדיקה זו משמשת לאימות יעילות הפרוטאוליזה (ראה נקודה 4).
  4. דלל את תמצית החלבון הנותרת עם ארבעה נפחים של 20 mM HEPES pH 8.0, כדי להגיע לריכוז אוריאה סופי של 2 M (שהוא הריכוז התואם את הפעילות האנזימטית של פרוטאזות). פצלו את הדגימה לשני חלקים: בראשון הוסיפו טריפסין מותאם כיתה רצף ובשני הוסיפו פרוטאז LysargiNase (ראו טבלת חומרים) ביחס של 1:100 (w/w) ביחס למ"ג של חומר המוצא. יש להשאיר למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C בתרמומיקסר ב-600 סל"ד, כדי לאפשר עיכול אנזימטי.
    הערה: טריפסין, אנזים העיכול הנפוץ ביותר בפרוטאומיקה, מתבקע במסוף C של R וליזין (K), ויוצר פפטידים עם התפלגות מטען שמביאה לספקטרום פיצול הנשלט על ידי יונים מסוג y בעת דיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות (CID). LysargiNase מתבקע בסוף ה-N של R ו-K, אם כן, משקף את ספציפיות המחשוף של טריפסין ומייצר פפטידים המשחררים בעיקר יונים מסוג b עם פיצול CID. ניתוח משולב זה מוביל לכיסוי מוגבר בהרבה של רצף פפטידים ולביטחון גבוה יותר בזיהוי ספציפי לאתר של R-מתילציות18.

3. טיהור פפטידים (זמן אינדיקציה נדרש 1 שעה)

  1. יש לשמור על אליקוט של פפטידים מעוכלים משתי התגובות, ולאסוף את אותם נפחים כמו בנקודה 2.3 לצורך ההשוואה בג'ל מוכתם ב-SDS-PAGE Coomassie כדי להעריך את יעילות העיכול של פרוטאזות (ראו נקודה 4).
  2. לעצור את העיכול על ידי החמצה של דגימות עם תוספת של חומצה trifluoroacetic (TFA) לריכוז סופי של 5%. מערבבים היטב ומודדים את ה-pH של הדגימות עם נייר ליטמוס (ה-pH צריך להיות בסביבות 3). מערבולות לזמן קצר ומסובבות את הדגימות החומציות לפני העברתן לצינורות חדשים של 15 מ"ל.
  3. נקה את הדגימות באמצעות שתי מחסניות C18 vac (משקל סורבנט 1 גרם, ראה טבלת חומרים), אחת עבור הדגימה המעוכלת עם טריפסין והשנייה עבור הדגימה המעוכלת עם LysargiNase. הכן ממס A, ממס B ומאגר שטיפה (ראה טבלה 1 להרכב הממס).
  4. באמצעות פיפטות זכוכית, ייבוש מחדש של כל מחסנית עם 6 מ"ל של ACN 100% למשך 3 פעמים. לאחר מכן, שיווי משקל כל מחסנית ברצף עם 3-9-18 מ"ל של ממס A. טען את הדגימות (שרפים צריך להיות צהוב). יש לשטוף שוב ברצף עם 3-9-18 מ"ל של ממס A ולאחר מכן להוסיף 6 מ"ל של מאגר Wash. העבירו כל עמודה לצינורות נקיים של 15 מ"ל והעבירו את הדגימות עם 7 מ"ל של ממס B. חזרו על שלב האלוציה עם 7 מ"ל של ממס B, לנפח סופי של 14 מ"ל.
    הערה: בצע את כל השלבים הללו על-ידי מתן אפשרות למאגרים ולתמיסה לעבור דרך העמודות בכוח הכבידה. כדי להעדיף את זרימת המאגרים דרך העמוד, לדחוף כל פתרון לאט עם מזרק, כדי לחקות ואקום.
  5. שמור 50 μL של פפטידים eluted, 50 μL של זרימה דרך (FT), 50 μL של הכביסה עם ממס A, ו 50 μL של הכביסה האחרונה עבור הערכת פפטיד לאחר מכן על ידי SDS-PAGE (ראה נקודה 4).

4. ג'ל SDS-PAGE מוכתם קומאסי (זמן מציין הנדרש שעתיים)

  1. הפעל את האליקוטים שנאספו על ג'ל וכתם SDS-PAGE של 17.5% עם צביעת Instant-Blu Coomassie (ראה טבלת חומרים). התוצאה הצפויה מיוצגת באיור 2A.

5. ליאופיליזציה פפטידית (זמן מציין 2 ימים)

  1. מכסים את צינורות 15 מ"ל המכילים את הפפטידים האלוטים בסרט פרפין, אשר לאחר מכן מנוקב עם מחט 20 G כדי ליצור 3-5 חורים. שים את הצינורות בקרח יבש לפחות 30 דקות, עד שהדגימות קפואות לחלוטין.
  2. ליופיליזציה של השברים הקפואים למשך 48 שעות, מרווח זמן שבדרך כלל מספיק כדי להבטיח ליאופיליזציה מלאה של הדגימות, גם אם תיתכן שונות מסוימת, עקב ביצועי מייבש ההקפאה.
    הערה: ניתן להשהות את הניסוי כאן, לאחסן את הדגימות הליופיליות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

6. פיצול כרומטוגרפי לא מקוון של HpH-RP של פפטידים (זמן מציין 4 ימים)

  1. כדי לחלק את הפפטידים ל-60 שברים, השתמש בכרומטוגרפיה נוזלית של HpH-RP, באמצעות מערכת HPLC המצוידת בעמודת C12-RP HPLC (250 x 4.6 מ"מ, 4 מיקרומטר פרוטאו 90A).
  2. לפני הריצה, הכינו חיץ A וחיץ B טריים (הרכב המאגרים מתואר בטבלה 1).
  3. סנן את כל התמיסה עם מסנן 0.22 מיקרומטר ודגה אותם באמבט סוניקטור למשך 30 דקות לפחות.
  4. ממיסים את הפפטידים הליופיליים ב-1 מ"ל של חיץ A. מסננים את הפפטידים דרך מסנן פוליטטרפלואורואתילן (PTFE) 0.45 מיקרומטר, באמצעות מזרק.
  5. הגדר את קצב הפיצול בזרימה של 1 מ"ל/דקה ואסוף 1 מ"ל של שברים, באמצעות השיפוע הכרומטוגרפי הבא: 5% B עד 30% B תוך 60 דקות; 30% B עד 60% תוך 2 דקות; 70% B למשך 3 דקות.
  6. הגדר את ה- HPLC כך שבשלב זה, איסוף השברים נעצר, והשיפוע מוחזק ב- 70% Buffer B למשך 5 דקות לפני שטיפה נרחבת של העמודה עם שיפוע מהיר עד 100% Buffer B, ולאחר מכן שטיפה סופית (100% Buffer B למשך 10 דקות).
    הערה: בסוף כל ריצה כרומטוגרפית, יש לאזן תמיד את העמודה עם 100% Buffer A למשך 20 דקות.
  7. חלק את שתי הדגימות לעיכול בנפרד עם טריפסין ו- LysargiNase על ידי מעברי צבע כרומטוגרפיים Off-Line HpH RP, כמתואר בנקודה 6.5.
  8. עבור כל שיפוע כרומטוגרפי, לאסוף את כל השברים לתוך צלחת עמוקה 96 באר.
  9. איחד את השברים שנאספו לפני ההדרגה לשבר יחיד אחד בשם PRE. שרשר את 60 השברים מהשיפוע הכרומטוגרפי הנוזלי (LC) של HpH-RP על-ידי איגומם בצורה לא רציפה ל-14 שברים סופיים. כדי להשיג שרשור לא רציף כזה, אחסן את שברי HpH-RP בהתאם לתוכנית הבאה.
    1. שבר 1 (נפח סופי 5 מ"ל): בריכה 1-15-29-43-57
    2. שבר 2 (נפח סופי 5 מ"ל): בריכה 2-16-30-44-58
    3. חלק 3 (נפח סופי 5 מ"ל): בריכה 3-17-31-45-59
    4. שבר 4 (נפח סופי 5 מ"ל): בריכה 4-18-32-46-60
    5. שבר 5 (נפח סופי 4 מ"ל): בריכה 5-19-33-47
    6. שבר 6 (נפח סופי 4 מ"ל): בריכה 6-20-34-48
    7. שבר 7 (נפח סופי 4 מ"ל): בריכה 7-21-35-49
    8. שבר 8 (נפח סופי 4 מ"ל): בריכה 8-22-36-50
    9. שבר 9 (נפח סופי 4 מ"ל): בריכה 9-23-37-51
    10. שבר 10 (נפח סופי 4 מ"ל): בריכה 10-24-38-52
    11. שבר 11 (נפח סופי 4 מ"ל): בריכה 11-25-39-53
    12. שבר 12 (נפח סופי 4 מ"ל): בריכה 12-26-40-54
    13. שבר 13 (נפח סופי 4 מ"ל): בריכה 13-27-41-55
    14. שבר 14 (נפח סופי 4 מ"ל): בריכה 14-28-42-56
      הערה: השרשור הלא רציף מורכב משילוב של שברים מוקדמים, בינוניים ומאוחרים, מה שמאפשר להגדיל את ההטרוגניות בהרכב הפפטידים בתוך השברים המאוגדים. כתוצאה מכך, תערובת הפפטידים של כל שבר מאוגד מופרדת ביעילות, עם קו-אלוקציה מוגבלת, בכרומטוגרפיית ה-pH-RP-LC הנמוכה בעלת זרימת הננו-זרימה שלאחר מכן, המצומדת ישירות לספקטרומטר המסה.
  10. איחד את השברים שנאספו לאחר ההדרגה לשבר ייחודי, בשם POST.
    הערה: על-ידי הכללת השברים PRE ו-POST הדרגתיים, מתקבלים בסך הכל 16 שברים בצינורות של 15 מ"ל (ראו איור 3A).
  11. מכסים את צינורות 15 מ"ל עם סרט פרפין ומנקבים אותו עם מחט 20 G כדי ליצור 3-5 חורים. הקפיאו אותם על ידי דגירה של צינורות הצנטריפוגות בקרח יבש עד שכל שבר קפוא לחלוטין.
  12. ליופיליזציה של השברים למשך כ-48 שעות. ודאו שכל דגימה מיובשת לחלוטין לפני שתפסיקו את מייבש ההקפאה.
    הערה: ניתן להשהות את הניסוי כאן, לאחסן את הדגימות הליופיליות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

7. העשרת זיקה חיסונית של פפטיד R-מתילציה (זמן מציין 2 ימים)

  1. בצע את העשרת הזיקה החיסונית הרציפה של פפטיד שונה עם נוגדנים נגד מתילציה של Pan-R במקביל, אך בנפרד עבור שתי הדגימות מעיכול טריפסין ו- LysargiNase, בהתאמה. מאגר טיהור הזיקה האימונולוגית (IAP) מסופק על ידי החברה הרוכשת את הנוגדנים נגד פאן-R-מתיל להעשרת זיקה פפטידית מותאמת (הפרטים נמצאים בחומר טבלה וריאגנטים). מאגר ה-IAP מרוכז פי 10 ויש לדלל אותו 10 פעמים לפני השימוש.
    הערה: ניתן לאחסן את IAP Buffer 1x בטמפרטורה של -20°C עד שנה אחת.
  2. צנטריפוגה של פפטידים lyophilized ב 2,000 x גרם במשך 5 דקות ב RT כדי לסובב את הפפטידים לתחתית של צינור 15 מ"ל. השהה מחדש את הפפטידים הליופיליים עם 250 μL של 1x IAP Buffer לכל צינור 15 מ"ל והעבר בצינור קשירה נמוך של 1.5 מ"ל. בדוק באמצעות נייר litmus אם ה- pH הוא >6.
  3. שמור על אליקוט קטן (כ -5% מהנפח) של כל שבר כקלט לניתוח MS הבא.
  4. פצלו כל שבר לשני אליקוטים, על מנת לבצע העשרה חיסונית של פפטידים אסימטריים-די-מתילטים (ADMA) וסימטריים-די-מתילטים (SDMA) במקביל.
  5. השתמש בשלושה בקבוקונים של הנוגדנים הנבחרים נגד פאן-R-מתילציה המצומדים לחלבון A חרוזי אגרוז לכל 10 מ"ג של תמצית החלבון הראשונית.
  6. הכינו את הכמות הנכונה של נוגדנים המצומדים לחרוזי אגרוז על ידי צנטריפוגה של כל בקבוקון בגודל 2,000 x גרם למשך 30 שניות והסרת החיץ מהחרוזים. לשטוף את החרוזים שלוש פעמים עם 1 מ"ל של 1x PBS תמיד על ידי צנטריפוגה אותם ב 2,000 x גרם במשך 30 שניות.
  7. לאחר הכביסה האחרונה, להשעות מחדש את החרוזים ב 40 μL 1x PBS עבור כל בקבוקון; לאסוף אותם ולבסוף לחלק אותם באופן שווה ל 16 שברים (כך 2.5 μL של חרוזי נוגדנים מתווסף לכל שבר).
  8. הוסיפו 250 μL של 1x IAP Buffer לכל צינור, ערבבו על ידי היפוך ותנו לו לדגור על גלגל מסתובב במשך שעתיים ב-4 מעלות צלזיוס.
    הערה: ערבבו את הדגימות על ידי היפוך צינורות של 1.5 מ"ל ולא על ידי ניקוף שלהם עם מיקרוטיפים, מה שעלול להזיק לחרוזים או לגרום לאובדן שלהם.
  9. לאחר דגירה של שעתיים, צנטריפוגה של צינורות 1.5 מ"ל המכילים פפטידים וחרוזים מצומדים של פאן-R-מתיל-נוגדנים ב-2,000 x גרם למשך 30 שניות כדי לזרוק את החרוזים; העבר את ה- FT מכל שבר לצינורות נקיים של 1.5 מ"ל קשירה נמוכה.
  10. הוסף את החרוזים המצומדים לנוגדנים נגד R-מונו-מתילציה (MMA) ל- FTs וחזור על השלבים 7.7 עד 7.9.
  11. במהלך הדגירה של דגימות הפפטידים עם חרוזי ה-MMA, יש לשטוף פי שניים מהשברים שבעבר היו בעלי חיסונית עם אנטי-ADMA ו-SDMA עם 250 μL IAP Buffer (היפוך ולא פיפטציה), ולהשליך את הסופר-נטנט בכל שטיפה.
  12. יש לחזור על הכביסה עם LC-MS דרגהH 2O שלוש פעמים.
  13. אלוט את הפפטידים המועשרים באהדה באופן סימטרי ואסימטרי R-di-methylated מחרוזי האגרוז על ידי הוספת 50 μL של 0.15% TFA לכל צינור (תנאים חומציים חזקים, למעשה, דנטורציה של האפיטופ המוביל לשחרור האנטיגנים מהנוגדנים). השאירו את הפתרון הזה 10 דקות ב- RT, היפוך הצינורות כל 2-3 דקות.
  14. להעביר את elution הראשון לתוך צינורות נקיים 1.5 מ"ל מחייב נמוך ולחזור על elution עם 50 μL 0.15% TFA; לאגד את 2 השברים בצינור אחד.
  15. חזור על שלבים מ-7.11 עד 7.14 עבור פפטידים R-מונו-מתילציה שהודגרו עם חרוזי הנוגדנים נגד MMA.

8. התפלה וריכוז של מתיל-פפטידים מועשרים בזיקה על ידי מיקרוקולומים C18 (זמן אינדיקציה נדרש 30 דקות)

  1. שיווי משקל עם מתנול המיקרוקולומים C18-RP המיוצרים עם מחסניות מיצוי 3M Solid Phase להתפלה וריכוז פפטידים לפני ניתוח MS19.
  2. טען את הדגימות (המתאימות לשברים מועשרים ושברים מועשרים בזיקה חיסונית נפרדת) על המיקרו-עמודים C18 בשני שלבים (50 μL + 50 μL על כל מיקרו-עמוד C18) על ידי צנטריפוגה ב-600 x g למשך 6 דקות.
  3. שטפו את המיקרוקולומים עם 55 μL Buffer A (ראו טבלה 1 להרכב המאגר), תמיד על ידי צנטריפוגה בגודל של כ-900 x גרם למשך 5 דקות.
    הערה: ניתן להשהות את הניסוי כאן, ולהשאיר את המיקרוקולומים C18-RP בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, שם ניתן לאחסן אותם עד שבועיים.

9. עיכול אנזימטי שני (זמן אינדיקציה נדרש 3 שעות)

  1. שטפו את המיקרו-עמודים C18-RP ב-55 μL של Buffer A (ראו טבלה 1 להרכב המאגר) במשך פעמיים, על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של כ-850 x גרם למשך 5 דקות.
  2. איחד את הפפטידים פעמיים עם 20 μL של Buffer B (ראה טבלה 1 להרכב המאגר) ואגד את שני השברים.
  3. ייבשו את הפפטידים המלוטשים ברכז ואקום (ראו חומר טבלה וריאגנטים לפרטים). בינתיים, הכינו את תמיסת העיכול המורכבת מאמוניום ביקרבונט של 50 mM המדולל מתמיסת מלאי טרייה של 1 M (ראו טבלה 1).
  4. הוסף טריפסין או LysargiNase לדגימות המתאימות, לריכוז סופי של 25 ng/μL. דגירה של כל דגימה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
  5. להוסיף 1 μL של 5% TFA כדי להפסיק את העיכול; מערבלים ומסובבים את הדגימות.
    הערה: ביקוע אנזימטי על ידי טריפסין יכול להיות מעוכב ב-C-terminus של R ו-K שעברו מתילציה, מה שגורם להחמצה של ביקועים המגדילים את האורך והמטען של הפפטידים, אשר בתורם מייצרים ספקטרום פיצול מורכב ולא שלם המעכב זיהוי פפטידים וייחוס ספציפי לאתר של אתרי מתילציה. הוכח כי עיכול אנזימטי שני עשוי להפחית את התדירות של ביקועים שהוחמצו כאלה, עם כיסוי רצף משופר וייחוס אתר20.

10. התפלת פפטידים (זמן אינדיקציה נדרש 30 דקות)

  1. טען את תמיסות הפפטידים החומציות למיקרו-עמודים חדשים מסוג C18-RP שהיו שיווי משקל בעבר בעקבות אותם שלבים המתוארים בנקודה 8.
  2. ניתן לאחסן את הפפטיד הנטען על המיקרוקולומים C18-RP בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לאיסוף לצורך ניתוח LC-MS/MS.

11. כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם (LC-MS/MS) ניתוח (זמן מציין 5 ימים)

  1. שדרגו את הפפטידים מהמיקרוקולומים C18-RP על ידי מעבר של 10μL של Buffer B, צנטריפוגה ב-615 x g למשך 5 דקות ב-RT. חזרו על שלב זה פעמיים ושלבו את האלואטים.
  2. הפחיתו את נפח ה-eluates ברכז ואקום עד שהם כמעט יבשים, והימנעו מייבוש יתר.
  3. השהה מחדש את הפפטידים ב-10 μL של Buffer A לניתוח LC-MS/MS.
  4. נתח כל חלק של R-מתיל-פפטידים על ידי ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS/MS) בספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה (ראו טבלת חומרים), בשילוב עם מערכת כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד (UHPLC) בעלת זרימת ננו. הגדר את הפרמטרים של המכשיר כמתואר בטבלה 2.
  5. טען 2 μL מכל דגימה על עמודה ננו-אנליטית (עמוד ריסוס קל בקוטר פנימי של 75 מיקרומטר, אורך 25 ס"מ), עמוס בשרף C18-RP (גודל חלקיקים של 2 מיקרומטר).
  6. דגימות מועברות דרך עמודת הננו C18 RP בקצב זרימה של 300 nL/min, עם השיפוע הליניארי הבא: 3%-30% B למשך 89 דקות, 30%-60% B למשך 5 דקות, 60%-95% B למשך דקה אחת ו- 95% B למשך 5 דקות.
  7. ספקטרומטר המסה פועל במצב רכישה תלוית נתונים (DDA) כדי לעבור באופן אוטומטי בין MS סריקה מלאה לבין רכישת MS/MS. הגדר את סריקת MS המלאה של הסקר לניתוח בגלאי הספקטרומטר ברזולוציה R = 70,000. חמישה עשר יוני הפפטיד העזים ביותר מבודדים ברצף לערך יעד של 3 x 106 ומקוטעים על ידי אנרגיית התנגשות יחסית של 28%. הגדר את זמני הצטברות היונים המרביים המותרים ל- 20 אלפיות השנייה עבור סריקות מלאות ו- 50 אלפיות השנייה עבור MS/MS ותקן את ערך היעד עבור MSMS ל- 1 x 106. זמן ההדרה הדינמי מוגדר ל- 20 שניות.

12. הפעלת ניתוח נתונים MaxQuant ו- hmSEEKER

  1. עם השלמת ריצות LC-MS/MS, יבא את הנתונים הגולמיים של MS למנוע חיפוש פפטידי כדי לזהות את המתיל פפטידים על ידי גישה מבוססת הסתברות מול מסד הנתונים הייחוס. בפרוטוקול זה, MaxQuant גרסה 1.6.2.10 שימש לניתוח שלנו. MaxQuant דורש מינימום של 2 GB RAM כדי לפעול, כמו גם מספיק שטח דיסק כדי לאחסן את כל הנתונים הגולמיים ואת כל קבצי הפלט.
    הערה: עיין בתיעוד הרשמי https://www.maxquant.org לקבלת כל הפרטים אודות ההתקנה ודרישות החומרה והתוכנה.
  2. שכפלו כל קובץ נתונים גולמיים. שנה את שמות העותקים המקוריים על-ידי הוספת "_light" לשמם, ולאחר מכן שנה את שמות העותקים על-ידי הוספת "_heavy".
    הערה: hmSEEKER, התסריט לניתוח במורד הזרם, הוא תלוי רישיות.
  3. הפעל את MaxQuant/Andromeda בחיפוש אחר זיהוי פפטידים עם ההגדרות המצוינות בטבלה 3. מבין מספר נתוני פלט המיוצרים על ידי MaxQuant, רק הקבצים allPeptides.txt ו- msms.txt (הממוקמים בתיקיית המשנה המשולבת/txt) נדרשים לשלב העיבוד שלאחר מכן.
  4. עיבוד הפוסט של נתוני פלט MaxQuant מתבצע על ידי האלגוריתם hmSEEKER. הורד את hmSEEKER מ: https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/. הסקריפט זמין כמחברת Jupyter שנכתבה בפייתון 3.7 ומגיעה עם ערכת נתונים לדוגמה למטרות בדיקה. עבור משתמשים חדשים, מומלץ להוריד ולהתקין את פלטפורמת אנקונדה (https://www.anaconda.com/products/individual). המהדורה האחרונה כוללת כברירת מחדל את Python 3.8, Jupyter ואת כל החבילות הנדרשות להפעלת hmSEEKER (למשל, Scikit-learn 0.23.1).
  5. צור תיקיה ואחסן את הקבצים allPeptides.txt ו- msms.txt מפלט MaxQuant לתוכה.
  6. הפעל את Jupyter (משורת הפקודה או מהנווט של אנקונדה).
  7. נווט אל התיקייה hmSEEKER ופתח את hmSEEKER.ipynb.
  8. במקטע פרמטרי קלט של המחברת, ציין את הנתיבים למסד הנתונים של FASTA ולתיקיות המכילות את קבצי הטקסט MaxQuant.
  9. הפעל את הקוד בתוך כל תא על ידי בחירת התא ולחיצה על לשחק כפתור על גבי ממשק Jupyter.
  10. הסקריפט מפיק קובץ פלט המופרד באמצעות פסיקים עבור כל ערכת נתונים שנותחה, בתוספת קובץ משולב. ניתן למצוא את רשימת הכפילים הסופית בקובץ בשם "[תאריך]-[שעה]-combined_hmSILAC_doublets_HxL_summary.csv"
    (טבלה 4 כוללת תיאור קצר של העמודות בטבלת הפלט).

תוצאות

המאמר מתאר תהליך עבודה לזיהוי בביטחון גבוה של חלבון R-מתילציה גלובלי, המבוססת על שילוב של העיכול האנזימטי של תמצית החלבון עם שני פרוטאזות נפרדות במקביל, ולאחר מכן פיצול כרומטוגרפיה נוזלית של HpH-RP של פפטידים פרוטאוליטיים והעשרת זיקה חיסונית של פפטידים R-מתיל עם נוגדנים נגד פאן-R-מתיל (

Discussion

הזיהוי בביטחון גבוה של מתילציה של חלבון in vivo /פפטיד על ידי פרוטאומיקה גלובלית מבוססת MS הוא מאתגר, בשל הסיכון ל-FDR גבוה, כאשר מספר תחליפי חומצות אמינו ומתיל-אסטריפיקציה מתרחשים במהלך הכנת הדגימה שהם איזובריים למתילציה ועלולים לגרום להקצאות שגויות בהיעדר אסטרטגיות אימות MS אורתוגונליות...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

MM ו- EM הם תלמידי דוקטורט בבית הספר האירופי לרפואה מולקולרית (SEMM). EM הוא הזוכה של 3 שנים FIRC-AIRC bursary (קוד הפרויקט: 22506). ניתוחים גלובליים של R-מתיל-פרוטאומים בקבוצת השחפת נתמכים על ידי מענק AIRC IG (קוד הפרויקט: 21834).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Ammonium Bicarbonate (AMBIC)Sigma-Aldrich09830
Ammonium Persulfate (APS)Sigma-Aldrich497363
C18 Sep-Pak columns vacc 6cc (1g)WatersWAT036905
Colloidal Coomassie staining InstantSigma-AldrichISB1L-1L
cOmplete Mini, EDTA-freeRoche-Sigma Aldrich11836170001Protease Inhibitor
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS)GIBCO ThermoFisher26400-044
DL-Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich3483-12-3
DMEM MediumGIBCO ThermoFisherrequested with stabile glutamine and without methionine
EASY-nano LC 1200 chromatography systemThermoFisher
EASY-Spray HPLC ColumnsThermoFisherES907
GlyceroloSigma-AldrichG5516
HeLa cellsATCCATCC CCL-2
HEPESSigma-AldrichH3375
Iodoacetamide (IAA)Sigma-Aldrich144-48-9
Jupiter C12-RP columnPhenomenex00G-4396-E0
L-MethionineSigma-AldrichM5308Light (L) Methionine
L-Methionine-(methyl-13C,d3)Sigma-Aldrich299154Heavy (H) Methionine
LysargiNaseMerck MilliporeEMS0008
Microtip Cell Disruptor Sonifier 250Branson
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED)Sigma-AldrichT9281
Penicillin-StreptomycinGIBCO ThermoFisher15140122
PhosSTOPRoche-Sigma Aldrich4906837001Phosphatase Inhibitor
Pierce C18 TipsThermoFisher87782
Pierce  0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS GradeThermoFisher85175LC-MS Solvent B
Pierce  0.1% Formic Acid (v/v) in Water, LC-MS GradeThermoFisher85170LC-MS Solvent A
Pierce  Acetonitrile (ACN), LC-MS GradeThermoFisher51101
Pierce  Water, LC-MS GradeThermoFisher51140
PolyacrylamideSigma-Aldrich92560
Precision Plus Protein  All Blue Prestained Protein StandardsBio-Rad1610373
PTMScan antibodies α-ADMACell Signaling Technology13474
PTMScan antibodies α-MMACell Signaling Technology12235
PTMScan antibodies α-SDMACell Signaling Technology13563
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass SpectrometerThermoFisher
Sequencing Grade Modified TrypsinPromegaV5113
Trifluoroacetic acidSigma-AldrichT6508
Ultimate 3000 HPLCDionex
UreaSigma-AldrichU5378
Vacuum Concentrator 5301EppendorfSpeed vac

References

  1. Bulau, P., et al. Quantitative assessment of arginine methylation in free versus protein-incorporated amino acids in vitro and in vivo using protein hydrolysis and high-performance liquid chromatography. Biotechniques. 40 (3), 305-310 (2006).
  2. Blanc, R. S., Richard, S. Arginine methylation: the coming of age. Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).
  3. Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).
  4. Yang, Y., Bedford, M. T. Protein arginine methyltransferases and cancer. Nature Reviews Cancer. 13 (1), 37-50 (2013).
  5. Bezzi, M., et al. Regulation of constitutive and alternative splicing by PRMT5 reveals a role for Mdm4 pre-mRNA in sensing defects in the spliceosomal machinery. Genes & Development. 27 (17), 1903-1916 (2013).
  6. Auclair, Y., Richard, S. The role of arginine methylation in the DNA damage response. DNA Repair. 12 (7), 459-465 (2013).
  7. Spadotto, V., et al. PRMT1-mediated methylation of the microprocessor-associated proteins regulates microRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. 48 (1), 96-115 (2020).
  8. Musiani, D., Massignani, E., Cuomo, A., Yadav, A., Bonaldi, T. Biochemical and computational approaches for the large-scale analysis of protein arginine methylation by mass spectrometry. Current Protein and Peptide Science. 21 (7), 725-739 (2020).
  9. Ong, S. -. E., Mittler, G., Mann, M. Identifying and quantifying in vivo methylation sites by heavy methyl SILAC. Nature Methods. 1 (2), 119-126 (2004).
  10. Hart-Smith, G., Yagoub, D., Tay, A. P., Pickford, R., Wilkins, M. R. Large scale mass spectrometry-based identifications of enzyme-mediated protein methylation are subject to high false discovery rates. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (3), 989-1006 (2016).
  11. Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).
  12. Larsen, S. C., et al. Proteome-wide analysis of arginine monomethylation reveals widespread occurrence in human cells. Science Signaling. 9 (443), (2016).
  13. Massignani, E., et al. hmSEEKER: Identification of hmSILAC doublets in MaxQuant output data. Proteomics. 19 (5), 1800300 (2019).
  14. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  15. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  16. Getz, E. B., Xiao, M., Chakrabarty, T., Cooke, R., Selvin, P. R. A comparison between the sulfhydryl reductants tris(2-carboxyethyl)phosphine and dithiothreitol for use in protein biochemistry. Analytical Biochemistry. 273 (1), 73-80 (1999).
  17. Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
  18. Huesgen, P. F., et al. LysargiNase mirrors trypsin for protein C-terminal and methylation-site identification. Nature Methods. 12 (1), 55-58 (2015).
  19. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896 (2007).
  20. Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).
  21. Bremang, M., et al. Mass spectrometry-based identification and characterisation of lysine and arginine methylation in the human proteome. Molecular bioSystems. 9 (9), 2231-2247 (2013).
  22. Geoghegan, V., Guo, A., Trudgian, D., Thomas, B., Acuto, O. Comprehensive identification of arginine methylation in primary T cells reveals regulatory roles in cell signalling. Nature Communications. 6 (1), 1-8 (2015).
  23. Tabb, D. L., Huang, Y., Wysocki, V. H., Yates, J. R. Influence of basic residue content on fragment ion peak intensities in low-energy collision-induced dissociation spectra of peptides. Analytical Chemistry. 76 (5), 1243-1248 (2004).
  24. Guthals, A., Bandeira, N. Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (9), 550-557 (2012).
  25. Swaney, D. L., et al. Supplemental activation method for high-efficiency electron-transfer dissociation of doubly protonated peptide precursors. Analytical Chemistry. 79 (2), 477-485 (2007).
  26. Kundinger, S. R., Bishof, I., Dammer, E. B., Duong, D. M., Seyfried, N. T. Middle-down proteomics reveals dense sites of methylation and phosphorylation in arginine-rich RNA-binding proteins. Journal of Proteome Research. 19 (4), 1574-1591 (2020).
  27. Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6176-6186 (2014).
  28. Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Review of Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
  29. Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).
  30. Uhlmann, T., et al. A method for large-scale identification of protein arginine methylation. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (11), 1489-1499 (2012).
  31. Wang, K., et al. Antibody-free approach for the global analysis of protein methylation. Analytical chemistry. 88 (23), 11319-11327 (2016).
  32. Moore, K. E., et al. A general molecular affinity strategy for global detection and proteomic analysis of lysine methylation. Molecular cell. 50 (3), 444-456 (2013).
  33. Wu, Z., et al. A chemical proteomics approach for global analysis of lysine monomethylome profiling. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (2), 329-339 (2015).
  34. Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).
  35. Tay, A. P., Geoghegan, V., Yagoub, D., Wilkins, M. R., Hart-Smith, G. MethylQuant: A Tool for Sensitive Validation of Enzyme-Mediated Protein Methylation Sites from Heavy-Methyl SILAC Data. Journal of Proteome Research. 17 (1), 359-373 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

182RhmSILACHpH RP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved