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Resumen

La proteína arginina (R)-metilación es una modificación postraduccional muy extendida que regula múltiples vías biológicas. La espectrometría de masas es la mejor tecnología para perfilar globalmente el R-metil-proteoma, cuando se combina con enfoques bioquímicos para el enriquecimiento peptídico modificado. El flujo de trabajo diseñado para la identificación de alta confianza de la R-metilación global en células humanas se describe aquí.

Resumen

La proteína arginina (R)-metilación es una modificación post-traduccional de proteínas (PTM) generalizada involucrada en la regulación de varias vías celulares, incluyendo el procesamiento de ARN, la transducción de señales, la respuesta al daño del ADN, la biogénesis de miARN y la traducción.

En los últimos años, gracias a los avances bioquímicos y analíticos, la proteómica basada en la espectrometría de masas (MS) se ha convertido en la estrategia más efectiva para caracterizar el metilproteoma celular con resolución de sitio único. Sin embargo, la identificación y el perfil in vivo de la proteína R-metilación por EM sigue siendo difícil y propenso a errores, principalmente debido a la naturaleza subestequiométrica de esta modificación y la presencia de varias sustituciones de aminoácidos y metilesterificación química de residuos ácidos que son isobáricos a la metilación. Por lo tanto, se requieren métodos de enriquecimiento para mejorar la identificación de R-metilpéptidos y estrategias de validación ortogonal para reducir las tasas de descubrimiento falso (FDR) en estudios de proteómica de metilo.

Aquí, se describe un protocolo diseñado específicamente para la identificación y cuantificación de péptidos R-metilo de alta confianza a partir de muestras celulares, que combina el etiquetado metabólico de las células con metionina codificada en isótopos pesados (hmSILAC) y la digestión dual de proteasa en solución del extracto de células enteras, seguido del fraccionamiento por cromatografía de fase inversa de alto pH (HpH-RP) fuera de línea y el enriquecimiento de afinidad de R-metilpéptidos utilizando anticuerpos anti-pan-R-metilo. Tras el análisis de MS de alta resolución, los datos sin procesar se procesan primero con el paquete de software MaxQuant y los resultados son analizados por hmSEEKER, un software diseñado para la búsqueda en profundidad de pares de picos de MS correspondientes a péptidos de metilo ligeros y pesados dentro de los archivos de salida de MaxQuant.

Introducción

La arginina (R)-metilación es una modificación postraduccional (PTM) que decora alrededor del 1% del proteoma de mamíferos1. Las proteínas arginina metiltransferasas (PRMT) son las enzimas que catalizan la reacción de R-metilación por la deposición de uno o dos grupos metilo a los átomos de nitrógeno (N) del grupo guanidino de la cadena lateral de R de manera simétrica o asimétrica. En los mamíferos, los PRMT pueden agruparse en tres clases: tipo I, tipo II y tipo III, dependiendo de su capacidad para depositar tanto monometilación (MMA) como dimetilación asimétrica (ADMA), MMA y dimetilación simétrica (SDMA) o solo MMA, respectivamente 2,3. Los PRMT se dirigen principalmente a residuos R localizados dentro de regiones ricas en glicina y arginina, conocidos como motivos GAR, pero algunos PRMT, como PRMT5 y CARM1, pueden metilar motivos ricos en prolina-glicina-metionina (PGM)4. La R-metilación ha surgido como un modulador de proteínas de varios procesos biológicos, como el empalme de ARN5, la reparación del ADN6, la biogénesis de miARN7 y la traducción2, fomentando la investigación sobre este PTM.

La espectrometría de masas (MS) es reconocida como la tecnología más efectiva para estudiar sistemáticamente la R-metilación global en resolución de proteínas, péptidos y sitios. Sin embargo, este PTM requiere algunas precauciones particulares para su identificación de alta confianza por parte del EM. En primer lugar, la R-metilación es subestequiométrica, siendo la forma no modificada de los péptidos mucho más abundante que los modificados, de modo que los espectrómetros de masas que operan en el modo de adquisición dependiente de datos (DDA) fragmentarán péptidos no modificados de alta intensidad con más frecuencia que sus contrapartes metiladas de menor intensidad8. Además, la mayoría de los flujos de trabajo basados en EM para la identificación de sitios R-metilados sufren limitaciones a nivel de análisis bioinformático. De hecho, la identificación computacional de péptidos metilo es propensa a altas tasas de descubrimiento falso (FDR), porque este PTM es isobárico a varias sustituciones de aminoácidos (por ejemplo, glicina en alanina) y modificación química, como la metilesterificación de aspartato y glutamato9. Por lo tanto, los métodos basados en el etiquetado de isótopos de grupos metilo, como el etiquetado de isótopos estables de metilo pesado con aminoácidos en cultivo celular (hmSILAC), se han implementado como estrategias ortogonales para la identificación segura de metilaciones in vivo con EM, reduciendo significativamente la tasa de anotaciones falsas positivas10.

Recientemente, se han optimizado varios protocolos de todo el proteoma para estudiar las proteínas R-metiladas. El desarrollo de estrategias basadas en anticuerpos para el enriquecimiento por inmunoafinidad de R-metilpéptidos ha llevado a la anotación de varios cientos de sitios R-metilados en células humanas11,12. Además, muchos estudios 3,13 informaron que el acoplamiento del enriquecimiento basado en anticuerpos con técnicas de separación peptídica como el fraccionamiento por cromatografía HpH-RP puede aumentar el número total de metilpéptidos identificados.

Este artículo describe una estrategia experimental diseñada para la identificación sistemática y de alta confianza de sitios R-metilados en células humanas, basada en varios pasos bioquímicos y analíticos: extracción de proteínas de células marcadas con hmSILAC, digestión enzimática doble paralela con proteasas Trypsin y LysargiNase, seguida de fraccionamiento cromatográfico HpH-RP de péptidos digeridos, junto con enriquecimiento de inmunoafinidad basado en anticuerpos de MMA-, SDMA-, y péptidos que contienen ADMA. Todos los péptidos enriquecidos con afinidad se analizan mediante cromatografía líquida (LC)-MS/MS de alta resolución en modo DDA, y los datos brutos de MS son procesados por el algoritmo MaxQuant para la identificación de péptidos R-metilo. Finalmente, los resultados de salida de MaxQuant se procesan con hmSEEKER, una herramienta bioinformática desarrollada internamente para buscar pares de péptidos metilo pesados y ligeros. Brevemente, hmSEEKER lee y filtra las identificaciones de péptidos metilo del archivo msms, luego compara cada péptido metilo con su pico MS1 correspondiente en el archivo allPeptides y, finalmente, busca el pico de la contraparte del péptido pesado / ligero. Para cada par pesado-ligero putativo, se calculan los parámetros Log2 H/L ratio (LogRatio), Retention Time difference (dRT) y Mass Error (ME), y los dobletes que se encuentran dentro de los puntos de corte definidos por el usuario se etiquetan como verdaderos positivos. El flujo de trabajo del protocolo bioquímico se describe en la Figura 1.

Protocolo

1. Cultivo celular y extracción de proteínas (tiempo: 3 - 4 semanas requeridas)

  1. Cultivar células HeLa en paralelo en medios suministrados con metionina ligera (L) o pesada (H), respectivamente (ver Tabla 1 para la composición de los medios). Tras al menos ocho divisiones celulares, recoger una alícuota de células de cada canal SILAC y realizar la prueba de incorporación.
    NOTA: Para verificar la eficiencia de incorporación, pruebe mediante el análisis LC-MS / MS que el porcentaje de metionina pesada (Met-4) en el canal pesado es lo más cercano posible al 100%. Analice una alícuota de celdas marcadas pesadamente por LC-MS/MS (para la configuración, consulte la Tabla 2), luego procese los datos de MS con MaxQuant utilizando los parámetros indicados en la Tabla 3. Para verificar la incorporación de Met-4, un script desarrollado internamente está disponible en https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/.
  2. Considere la incorporación de metionina pesada como completa cuando alcanza el >97%. Cuando cada canal alcanza un número total de aproximadamente 60 x 106 de células (correspondientes a unas 40 placas de 15 cm cada una al 85% de confluencia para las células HeLa, con variaciones según el tipo de célula) cosecharlas. Contar cuidadosamente, mezclar en proporción 1:1 y granular por centrifugación a 335 x g durante 5 min a 4 °C.
    NOTA: Para evaluar la mezcla adecuada de 1:1 L/H, mantenga una alícuota y ejecútela en una rebanada de un gel que se sabe que contiene una proteína R-metilada de alta abundancia y muy R-metilada (por ejemplo, fibrilarina). Si el etiquetado ha sido exitoso y se ha logrado una mezcla 1: 1, debe haber una proporción de 1: 1 de versiones ligeras y pesadas de los péptidos R-metilados presentes en la muestra. Alternativamente, mantenga una alícuota de muestra mixta para ser analizada por LC-MS / MS, luego procese los datos de MS con MaxQuant utilizando los parámetros indicados en la Tabla 3 y trace la distribución de la relación Log2 H / L como se muestra en la Figura 2C. El protocolo se puede detener aquí congelando rápidamente el pellet y almacenándolo a -80 ° C.
  3. Vuelva a suspender el pellet celular en cuatro volúmenes de tampón de lisis (consulte la Tabla 1 para la composición del tampón de lisis) con respecto al volumen de pellets celulares. Por ejemplo, use 6 ml de tampón de lisis para un pellet de 120 x 10 6 células Hela (60 x 106 Light + 60 x 106 Heavy) correspondientes a un volumen de 1.5 mL.
    NOTA: La extracción de proteínas debe realizarse a temperatura ambiente (RT) porque el tampón de lisis contiene el agente caotrópico 9 M urea que precipita a temperatura del hielo; por lo tanto, la adición de un amplio espectro de inhibidores de la proteasa de serina y cisteína es importante, así como el inhibidor de fosfatasas, para proteger simultáneamente las proteínas contra la degradación proteolítica y la desfosforilación, el cóctel de inhibidores de la proteasa y la fosfatasa están disponibles comercialmente como tabletas pequeñas, ver Tabla 1 y Tabla de materiales.
  4. Sonicar la muestra con un sonicador disruptor de células micropunta durante al menos cinco ciclos de 15 s ON y 30 s OFF, para garantizar la rotura eficiente de las membranas celulares y la liberación y cizallamiento del ADN. Compruebe la viscosidad del extracto pipeteando la solución hacia arriba y hacia abajo. Si es demasiado viscoso debido al cizallamiento incompleto del ADN y la solubilización de la membrana, repita los ciclos de sonicación.
    NOTA: Asegúrese de que la muestra no se sobrecaliente durante la sonicación, ya que la alta temperatura puede dañar las proteínas. Sin embargo, no es posible poner la muestra en hielo entre ciclos de sonicación, debido a la presencia de 9M Urea; por lo tanto, es aconsejable hacer una pausa durante 60 s OFF entre diferentes ciclos de sonicación. Además, evite la formación de burbujas de aire durante la sonicación porque reducen la eficacia de la sonicación.
  5. Centrifugar el extracto a 3.000 x g durante 10 min a RT para granular los residuos y transferir el sobrenadante en un nuevo tubo de 15 ml.
  6. Mida el contenido proteico del extracto con un ensayo colorimétrico, como Bradford o ácido bicinchonínico (BCA)14,15. Una cantidad inicial óptima de extracto de proteína para este protocolo es entre 20-30 mg.
    NOTA: Los tampones de lisis que contienen urea de alta concentración son compatibles con el ensayo de cuantificación de Bradford y BCA; otros tipos de tampón de lisis, como los que incluyen una alta concentración de dodecil sulfato de sodio (SDS), no son compatibles con Bradford.

2.  Digestión de lisado (tiempo indicativo requerido 2 horas)

  1. Realizar la reducción del grupo tiol (-SH) de las proteínas utilizando una solución madre de ditiothreitol (DTT) disuelta en agua ultrapura a una concentración final de 4,5 mM y dejar ir la reacción durante 30 min a 55 °C.
    NOTA: Es posible preparar 1 M de solución de TDT madre y almacenarla a -20 °C durante un máximo de 1 mes, descongelando solo las alícuotas necesarias para cada experimento. Alternativamente, el reductor de sulfhidrilo tris-(2-carboxietil)-fosfina (TCEP) se puede utilizar para realizar la reducción de los grupos -SH; especialmente para el almacenamiento a largo plazo de proteínas, el TCEP es significativamente más estable que el TDT sin quelatos metálicos como el EGTA en el tampón, mientras que la TDT es más estable si los quelatos metálicos están presentes16.
  2. Realizar la alquilación del grupo tiol (-SH) de las proteínas mediante la adición de yodoacetamida (IAA) a una concentración de 10 mM e incubar durante 15 min a RT en la oscuridad. Realizar la incubación de proteínas extraídas con solución de IAA en la oscuridad porque IAA es fotosensible.
    NOTA: La solución madre IAA a 100 mM debe prepararse fresca antes de cada experimento. Alternativamente, la cloroacetamida podría usarse para realizar la alquilación de grupos -SH, especialmente si el objetivo del experimento es analizar la diafonía entre metilación y ubiquitinación porque el artefacto inducido por IAA imita la ubiquitinación17.
  3. Antes de continuar con la etapa de digestión de proteínas, guardar una alícuota de extracto de proteína (1/1.000 de lisado inicial no digerido) para su posterior análisis en gel teñido con SDS-PAGE Coomassie y compararla con una cantidad correspondiente de muestra tras la digestión; Esta prueba sirve para verificar la eficacia de la proteólisis (ver punto 4).
  4. Diluir el extracto proteico restante con cuatro volúmenes de 20 mM HEPES pH 8.0, para alcanzar una concentración final de urea de 2 M (que es la concentración compatible con la actividad enzimática de las proteasas). Dividir la muestra en dos partes: en la primera añadir tripsina modificada de grado de secuenciación y en la segunda añadir proteasa lisarginasa (ver tabla de materiales) en proporción 1:100 (p/p) en relación con el mg de material de partida. Dejar toda la noche a 37 °C en un termomezclador a 600 rpm, para permitir la digestión enzimática.
    NOTA: La tripsina, la enzima de digestión más común en proteómica, se escinde en el extremo C de R y lisina (K), generando péptidos con una distribución de carga que resulta en espectros de fragmentación dominados por iones de tipo y en la disociación inducida por colisión (CID). LysargiNase se escinde en el extremo N de R y K, por lo tanto, reflejando la especificidad de la escisión de tripsina y generando péptidos que liberan principalmente iones de tipo b tras la fragmentación CID. Este análisis combinado conduce a una cobertura de secuencia peptídica mucho mayor y a una mayor confianza en la identificación específica del sitio de R-metilaciones18.

3. Purificación de péptidos (tiempo indicativo requerido 1 hora)

  1. Conservar una alícuota de péptidos digeridos de ambas reacciones, recogiendo los mismos volúmenes que en el punto 2.3 para la comparación en SDS-PAGE Gel teñido con Coomassie para evaluar la eficacia de la digestión de la proteasa (véase el punto 4).
  2. Detener la digestión acidificando las muestras con la adición de ácido trifluoroacético (TFA) a una concentración final del 5%. Mezclar bien y medir el pH de las muestras con un papel tornasol (el pH debe estar alrededor de 3). Vortex brevemente y girar las muestras acidificadas antes de transferirlas a nuevos tubos de 15 ml.
  3. Limpie las muestras a través de dos cartuchos C18 vac (peso del sorbente 1 g, ver Tabla de materiales), uno para la muestra digerida con tripsina y el otro para la muestra digerida con LysargiNase. Prepare el disolvente A, el disolvente B y el tampón de lavado (consulte la Tabla 1 para la composición del tampón).
  4. Usando pipetas de vidrio, rehidratar cada cartucho con 6 ml de ACN 100% durante 3 veces. Después de eso, equilibre cada cartucho secuencialmente con 3-9-18 ml de solvente A. Cargue las muestras (las resinas deben volverse amarillas). Lavar de nuevo secuencialmente con 3-9-18 ml de disolvente A y luego añadir 6 ml de tampón de lavado. Transfiera cada columna a tubos limpios de 15 ml y eluya las muestras con 7 ml de disolvente B. Repita el paso de elución con 7 ml de disolvente B, para obtener un volumen final de 14 ml.
    NOTA: Realice todos estos pasos dejando que los tampones y la solución pasen a través de las columnas por gravedad. Para favorecer el flujo de los tampones a través de la columna, empuje cada solución lentamente con una jeringa, para imitar el vacío.
  5. Guardar 50 μL de péptidos eluidos, 50 μL de flujo continuo (FT), 50 μL del lavado con disolvente A y 50 μL del último lavado para la posterior evaluación de péptidos mediante SDS-PAGE (véase el punto 4).

4. Gel SDS-PAGE teñido con Coomassie (tiempo indicativo requerido 2 horas)

  1. Ejecute las alícuotas recogidas en un gel SDS-PAGE al 17,5% y tinción con tinción Instant-Blu Coomassie (consulte la Tabla de materiales). El resultado esperado se representa en la Figura 2A.

5. Liofilización peptídica (tiempo indicativo 2 días)

  1. Cubra los tubos de 15 ml que contienen los péptidos eluidos con una película de parafina, que luego se perfora con una aguja de 20 G para crear 3-5 agujeros. Ponga los tubos en hielo seco durante al menos 30 minutos, hasta que las muestras estén completamente congeladas.
  2. Liofilizar las fracciones congeladas durante 48 h, un intervalo de tiempo típicamente suficiente para asegurar una liofilización completa de las muestras, incluso si puede ocurrir alguna variabilidad, debido al rendimiento del liofilizador.
    NOTA: El experimento se puede pausar aquí, almacenando las muestras liofilizadas a -80 °C.

6. Fraccionamiento cromatográfico HpH-RP fuera de línea de péptidos (tiempo indicativo 4 días)

  1. Para fraccionar los péptidos en 60 fracciones, utilice cromatografía líquida HpH-RP, utilizando un sistema HPLC equipado con columna HPLC C12-RP (250 x 4,6 mm, 4 μm Proteo 90A).
  2. Antes de la ejecución, prepare nuevos Buffer A y Buffer B (la composición de los Buffers se describe en la Tabla 1).
  3. Filtrar toda la solución con un filtro de 0,22 μm y desgasificarla en un baño sonicador durante al menos 30 min.
  4. Disuelva los péptidos liofilizados en 1 ml de tampón A. Filtre los péptidos a través de un filtro de politetrafluoroetileno (PTFE) de 0,45 μm, utilizando una jeringa.
  5. Ajuste la velocidad de fraccionamiento a 1 mL/min de flujo y recoja 1 mL de fracciones, utilizando el siguiente gradiente cromatográfico: 5% B a 30% B en 60 min; 30% B a 60% en 2 min; 70% B durante 3 min.
  6. Configure la HPLC de modo que, en este punto, se detenga la recolección de fracciones y el gradiente se mantenga en un tampón B al 70% durante 5 minutos antes de un lavado extenso de la columna con un gradiente rápido de hasta el 100% del tampón B, seguido de un lavado final (100% tampón B durante 10 min).
    NOTA: Al final de cada ejecución cromatográfica, equilibre siempre la columna con el 100% del búfer A durante 20 min.
  7. Fraccionar ambas muestras digeridas por separado con tripsina y lisarginasa mediante gradientes cromatográficos Off-Line HpH RP, como se describe en el punto 6.5.
  8. Para cada gradiente cromatográfico, reúna todas las fracciones en una placa profunda de 96 pocillos.
  9. Agrupe las fracciones recogidas antes del gradiente en una sola fracción denominada PRE. Concatenar las 60 fracciones del gradiente cromatográfico líquido (LC) HpH-RP agrupándolas de forma no contigua en 14 fracciones finales. Para obtener dicha concatenación no contigua, agrupe las fracciones de HpH-RP de acuerdo con el siguiente esquema.
    1. Fracción 1 (volumen final 5 mL): Grupo 1-15-29-43-57
    2. Fracción 2 (volumen final 5 mL): Grupo 2-16-30-44-58
    3. Fracción 3 (volumen final 5 mL): Grupo 3-17-31-45-59
    4. Fracción 4 (volumen final 5 mL): Grupo 4-18-32-46-60
    5. Fracción 5 (volumen final 4 mL): Grupo 5-19-33-47
    6. Fracción 6 (volumen final 4 mL): Grupo 6-20-34-48
    7. Fracción 7 (volumen final 4 mL): Grupo 7-21-35-49
    8. Fracción 8 (volumen final 4 mL): Grupo 8-22-36-50
    9. Fracción 9 (volumen final 4 mL): Grupo 9-23-37-51
    10. Fracción 10 (volumen final 4 mL): Grupo 10-24-38-52
    11. Fracción 11 (volumen final 4 mL): Grupo 11-25-39-53
    12. Fracción 12 (volumen final 4 mL): Grupo 12-26-40-54
    13. Fracción 13 (volumen final 4 mL): Grupo 13-27-41-55
    14. Fracción 14 (volumen final 4 mL): Grupo 14-28-42-56
      NOTA: La concatenación no contigua consiste en combinar fracciones de elución temprana, media y tardía, lo que permite aumentar la heterogeneidad en la composición peptídica dentro de las fracciones agrupadas. En consecuencia, la mezcla peptídica de cada fracción agrupada se separa eficientemente, con coelución limitada, en la cromatografía posterior de nanoflujo de bajo pH-RP-LC directamente acoplada al espectrómetro de masas.
  10. Agrupe las fracciones recogidas después del gradiente en una fracción única, denominada POST.
    NOTA: Al incluir las fracciones PRE y POST gradiente se obtienen un total de 16 fracciones, en tubos de 15 mL (ver Figura 3A).
  11. Cubra los tubos de 15 ml con película de parafina y perfore con una aguja de 20 G para generar 3-5 agujeros. Congelarlos incubando los tubos de centrífuga en hielo seco hasta que cada fracción esté completamente congelada.
  12. Liofilizar las fracciones durante unas 48 h. Asegúrese de que cada muestra esté completamente seca antes de detener el liofilizador.
    NOTA: El experimento se puede pausar aquí, almacenando las muestras liofilizadas a -80 °C.

7. Enriquecimiento de inmunoafinidad del péptido R-metilado (tiempo indicativo 2 días)

  1. Realizar el enriquecimiento secuencial de inmunoafinidad del péptido modificado con anticuerpos anti-pan-R-metilación en paralelo, pero por separado para las dos muestras de las digestiones de tripsina y lisarginasa, respectivamente. El tampón de purificación de inmunoafinidad (IAP) es proporcionado por la compañía que compra los anticuerpos anti-pan-R-metilo para el enriquecimiento de afinidad peptídica modificada (los detalles están en Material de tabla y reactivos). El tampón IAP se concentra 10 veces y debe diluirse 10 veces antes de su uso.
    NOTA: El búfer IAP 1x se puede almacenar a -20 °C hasta 1 año.
  2. Centrifugar los péptidos liofilizados a 2.000 x g durante 5 minutos a RT para hacer girar los péptidos hasta el fondo del tubo de 15 ml. Volver a suspender los péptidos liofilizados con 250 μL de 1x tampón IAP por tubo de 15 ml y transferir en un tubo de baja unión de 1,5 ml. Verifique con un papel tornasol si el pH es >6.
  3. Mantenga una pequeña alícuota (aproximadamente el 5% del volumen) de cada fracción como entrada para el posterior análisis de EM.
  4. Dividir cada fracción en dos alícuotas, con el fin de realizar el inmunoenriquecimiento de péptidos asimétricamente dimetilados (ADMA) y simétricamente dimetilados (SDMA) en paralelo.
  5. Use tres viales de los anticuerpos anti-pan-R-metilados seleccionados conjugados con perlas de agarosa de la proteína A por 10 mg del extracto de proteína inicial.
  6. Preparar la cantidad correcta de anticuerpo conjugado con perlas de agarosa centrifugando cada vial a 2.000 x g durante 30 s y retirando el tampón de las perlas. Lave las perlas tres veces con 1 ml de 1x PBS siempre centrifugando a 2.000 x g durante 30 s.
  7. Después del último lavado, vuelva a suspender las perlas en 40 μL 1x PBS para cada vial; agruparlos y finalmente dividirlos equitativamente en 16 fracciones (de modo que se agreguen 2,5 μL de perlas de anticuerpos a cada fracción).
  8. Añadir 250 μL de 1x IAP Buffer a cada tubo, mezclar invirtiendo y dejar incubar en una rueda giratoria durante 2 h a 4 °C.
    NOTA: Mezcle las muestras invirtiendo los tubos de 1,5 ml en lugar de pipetearlos con micropuntas, lo que podría dañar las perlas o perderlas.
  9. Tras la incubación de 2 h, centrifugar los tubos de 1,5 ml que contienen péptidos y perlas conjugadas con pan-R-metil-anticuerpo a 2.000 x g durante 30 s para granular las perlas; transfiera el FT de cada fracción a tubos limpios de 1,5 ml de baja unión.
  10. Agregue las perlas conjugadas a anticuerpos contra R-monometilación (MMA) a los FT y repita los pasos 7.7 a 7.9.
  11. Durante la incubación de las muestras de péptidos con las perlas MMA, lavar el doble de las fracciones que fueron previamente inmunoprecipitadas con anti-ADMA y SDMA con 250 μL de tampón IAP (invertido y no pipeteado), y desechar el sobrenadante en cada lavado.
  12. Repita el lavado con LC-MS grado H2O tres veces.
  13. Eluya los péptidos R-dimetilados enriquecidos simétrica y asimétricamente de las perlas de agarosa agregando 50 μL de 0.15% TFA a cada tubo (condiciones ácidas fuertes, de hecho, desnaturalizan el epítopo que conduce a la liberación de los antígenos de los anticuerpos). Deje esta solución 10 min en RT, invirtiendo los tubos cada 2-3 min.
  14. Transfiera la primera elución a tubos limpios de 1,5 ml de baja unión y repita la elución con 50 μL 0,15% TFA; Agrupe las 2 fracciones en un solo tubo.
  15. Repita los pasos de 7.11 a 7.14 para los péptidos R-monometilados que se incubaron con las perlas de anticuerpos anti-MMA.

8. Dealación y concentración de péptidos metílicos enriquecidos con afinidad mediante microcolumnas C18 (tiempo indicativo requerido 30 minutos)

  1. Equilibrar con metanol las microcolumnas C18-RP fabricadas con cartuchos de extracción en fase sólida 3M para la desalinización y concentración de péptidos antes del análisis MS19.
  2. Cargue las muestras (correspondientes a las fracciones enriquecidas por inmunoafinidad y las fracciones de entrada separadas) en las microcolumnas C18 en dos pasos (50 μL + 50 μL en cada microcolumna C18) centrifugando a 600 x g durante 6 min.
  3. Lavar las microcolumnas con tampón A de 55 μL (véase la tabla 1 para la composición del tampón), siempre por centrifugación a unos 900 x g durante 5 min.
    NOTA: El experimento se puede pausar aquí, dejando las microcolumnas C18-RP a 4 °C, donde se pueden almacenar hasta 2 semanas.

9. Segunda digestión enzimática (tiempo indicativo requerido 3 horas)

  1. Lavar las microcolumnas C18-RP con 55 μL de tampón A (véase la tabla 1 para la composición del tampón) dos veces, por centrifugación a unos 850 x g durante 5 min.
  2. Eluya los péptidos dos veces con 20 μL de tampón B (ver Tabla 1 para la composición del tampón) y agrupe las dos fracciones.
  3. Seque los péptidos eluyentes en un concentrador de vacío (consulte la Tabla Material y reactivos para obtener más detalles). Mientras tanto, prepare la solución de digestión que consiste en 50 mM de bicarbonato de amonio que se diluye a partir de una solución madre de 1 M recién hecha (ver Tabla 1).
  4. Añadir tripsina o lisarginasa a las muestras respectivas, hasta una concentración final de 25 ng/μL. Incubar cada muestra a 37 °C durante 2 h.
  5. Añadir 1 μL de TFA al 5% para detener la digestión; vórtice y gire hacia abajo las muestras.
    NOTA: La escisión enzimática por tripsina puede inhibirse en el extremo C de R y K metilados, causando escisiones perdidas que aumentan la longitud y la carga del péptido, que a su vez producen espectros de fragmentación complejos e incompletos que dificultan la identificación de péptidos y la atribución específica del sitio de los sitios de metilación. Se ha demostrado que una segunda digestión enzimática puede reducir la frecuencia de tales escisiones perdidas, con una mejor cobertura de secuencia y atribución de sitio20.

10. Péptidos desalinizantes (tiempo indicativo requerido 30 minutos)

  1. Cargar las soluciones peptídicas acidificadas en nuevas microcolumnas C18-RP que hayan sido previamente equilibradas siguiendo los mismos pasos descritos en el punto 8.
  2. El péptido cargado en las microcolumnas C18-RP puede almacenarse a 4 °C hasta la elución para el análisis LC-MS/MS.

11. Análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) (tiempo indicativo 5 días)

  1. Eluya los péptidos de las microcolumnas C18-RP pasando 10 μL de tampón B, centrifugando a 615 x g durante 5 minutos a RT. Repita este paso dos veces y combine los eluidos.
  2. Reducir el volumen de los eluidos en un concentrador de vacío hasta que estén casi secos, evitando el secado excesivo.
  3. Vuelva a suspender los péptidos en 10 μL de tampón A para el análisis LC-MS/MS.
  4. Analice cada fracción de péptidos R-metilo por cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) en un espectrómetro de masas de alta resolución (consulte la Tabla de materiales), acoplado a un sistema de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento (UHPLC) de nanoflujo. Establezca los parámetros del instrumento como se describe en la Tabla 2.
  5. Cargue 2 μL de cada muestra en una columna nanoanalítica (columna de pulverización fácil de 75 μm de diámetro interior, 25 cm de longitud), embalada con resina C18-RP (tamaño de partícula de 2 μm).
  6. Las muestras se pasan a través de la nanocolumna C18 RP a un caudal de 300 nL/min, con el siguiente gradiente lineal: 3% -30% B durante 89 min, 30% -60% B durante 5 min, 60% -95% B durante 1 min y 95% B durante 5 min.
  7. El espectrómetro de masas funciona en modo de adquisición dependiente de datos (DDA) para cambiar automáticamente entre la adquisición MS de escaneo completo y la adquisición de MS / MS. Configure el MS de escaneo completo de la encuesta para que se analice en el detector del espectrómetro con resolución R = 70,000. Los quince iones peptídicos más intensos se aíslan secuencialmente a un valor objetivo de 3 x 106 y se fragmentan por una energía de colisión relativa del 28%. Establezca los tiempos máximos permitidos de acumulación de iones en 20 ms para escaneos completos y 50 ms para MS / MS y fije el valor objetivo para MSMS en 1 x 106. El tiempo de exclusión dinámico se establece en 20 s.

12. Ejecución del análisis de datos MaxQuant y hmSEEKER

  1. Una vez completadas las ejecuciones de LC-MS/MS, importe los datos brutos de MS a un motor de búsqueda de péptidos para identificar los péptidos metílicos mediante un enfoque basado en la probabilidad contra la base de datos de referencia. En este protocolo, se utilizó MaxQuant versión 1.6.2.10 para nuestro análisis. MaxQuant requiere un mínimo de 2 GB de RAM para ejecutarse, así como suficiente espacio en disco para almacenar todos los datos sin procesar y todos los archivos de salida.
    NOTA: Consulte la documentación oficial en https://www.maxquant.org para obtener todos los detalles sobre la instalación y los requisitos de hardware y software.
  2. Duplique cada archivo de datos sin procesar. Cambie el nombre de los originales añadiendo "_light" a su nombre, luego cambie el nombre de las copias añadiendo "_heavy".
    NOTA: hmSEEKER, el script para el análisis posterior, distingue entre mayúsculas y minúsculas.
  3. Inicie la búsqueda MaxQuant/Andromeda para la identificación de péptidos con la configuración indicada en la Tabla 3. De los varios datos de salida producidos por MaxQuant, solo los archivos allPeptides.txt y msms.txt (ubicados en la subcarpeta combinada/txt) son necesarios para el paso de procesamiento posterior.
  4. El procesamiento posterior de los datos de salida de MaxQuant se lleva a cabo mediante el algoritmo hmSEEKER. Descargue hmSEEKER desde: https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/. El script está disponible como un cuaderno de Jupyter escrito en Python 3.7 y viene con un conjunto de datos de muestra para fines de prueba. Para los nuevos usuarios, es recomendable descargar e instalar la plataforma Anaconda (https://www.anaconda.com/products/individual). La última versión incluye por defecto Python 3.8, Jupyter y todos los paquetes necesarios para ejecutar hmSEEKER (por ejemplo, Scikit-learn 0.23.1).
  5. Cree una carpeta y almacene los archivos allPeptides.txt y msms.txt de la salida de MaxQuant en ella.
  6. Inicie Jupyter (desde la línea de comandos o desde el navegador Anaconda).
  7. Vaya a la carpeta hmSEEKER y abra hmSEEKER.ipynb.
  8. En la sección Parámetros de entrada del bloc de notas, indique las rutas a la base de datos FASTA y a las carpetas que contienen los archivos de texto MaxQuant.
  9. Ejecute el código dentro de cada celda seleccionando la celda y haciendo clic en el botón Reproducir en la parte superior de la interfaz de Jupyter.
  10. El script genera un archivo de salida separado por comas para cada conjunto de datos analizado, además de un archivo combinado. La lista final de dobletes se puede encontrar en el archivo llamado "[fecha]-[hora]-combined_hmSILAC_doublets_HxL_summary.csv"
    (La Tabla 4 incluye una breve descripción de las columnas de la tabla de salida).

Resultados

El artículo describe un flujo de trabajo para la identificación de alta confianza de la proteína R-metilación global, que se basa en la combinación de la digestión enzimática del extracto de proteína con dos proteasas distintas en paralelo, seguido del fraccionamiento por cromatografía líquida HpH-RP de péptidos proteolíticos y el enriquecimiento por inmunoafinidad de R-metilpéptidos con anticuerpos anti-pan-R-metilo (Figura 1).

Las células se cultiv...

Discusión

La identificación de alta confianza de la metilación in vivo de proteínas/péptidos mediante proteómica global basada en EM es un desafío, debido al riesgo de FDR alta, con varias sustituciones de aminoácidos y metilesterificación que ocurren durante la preparación de la muestra que son isobáricas a la metilación y pueden causar asignaciones incorrectas en ausencia de estrategias ortogonales de validación de EM. La naturaleza subestequiométrica de este PTM complica aún más la tarea de la metilprote...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

MM y EM son estudiantes de doctorado dentro de la Escuela Europea de Medicina Molecular (SEMM). EM recibe una beca FIRC-AIRC de 3 años (Código del proyecto: 22506). Los análisis globales de R-metil-proteomas en el grupo de TB están respaldados por la subvención AIRC IG (Código del proyecto: 21834).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Ammonium Bicarbonate (AMBIC)Sigma-Aldrich09830
Ammonium Persulfate (APS)Sigma-Aldrich497363
C18 Sep-Pak columns vacc 6cc (1g)WatersWAT036905
Colloidal Coomassie staining InstantSigma-AldrichISB1L-1L
cOmplete Mini, EDTA-freeRoche-Sigma Aldrich11836170001Protease Inhibitor
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS)GIBCO ThermoFisher26400-044
DL-Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich3483-12-3
DMEM MediumGIBCO ThermoFisherrequested with stabile glutamine and without methionine
EASY-nano LC 1200 chromatography systemThermoFisher
EASY-Spray HPLC ColumnsThermoFisherES907
GlyceroloSigma-AldrichG5516
HeLa cellsATCCATCC CCL-2
HEPESSigma-AldrichH3375
Iodoacetamide (IAA)Sigma-Aldrich144-48-9
Jupiter C12-RP columnPhenomenex00G-4396-E0
L-MethionineSigma-AldrichM5308Light (L) Methionine
L-Methionine-(methyl-13C,d3)Sigma-Aldrich299154Heavy (H) Methionine
LysargiNaseMerck MilliporeEMS0008
Microtip Cell Disruptor Sonifier 250Branson
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED)Sigma-AldrichT9281
Penicillin-StreptomycinGIBCO ThermoFisher15140122
PhosSTOPRoche-Sigma Aldrich4906837001Phosphatase Inhibitor
Pierce C18 TipsThermoFisher87782
Pierce  0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS GradeThermoFisher85175LC-MS Solvent B
Pierce  0.1% Formic Acid (v/v) in Water, LC-MS GradeThermoFisher85170LC-MS Solvent A
Pierce  Acetonitrile (ACN), LC-MS GradeThermoFisher51101
Pierce  Water, LC-MS GradeThermoFisher51140
PolyacrylamideSigma-Aldrich92560
Precision Plus Protein  All Blue Prestained Protein StandardsBio-Rad1610373
PTMScan antibodies α-ADMACell Signaling Technology13474
PTMScan antibodies α-MMACell Signaling Technology12235
PTMScan antibodies α-SDMACell Signaling Technology13563
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass SpectrometerThermoFisher
Sequencing Grade Modified TrypsinPromegaV5113
Trifluoroacetic acidSigma-AldrichT6508
Ultimate 3000 HPLCDionex
UreaSigma-AldrichU5378
Vacuum Concentrator 5301EppendorfSpeed vac

Referencias

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