Global ve Yüksek Güvenilirlikli Protein R-Metilasyon Analizi için Kütle Spektrometrisine Dayalı Proteomik Yaklaşım

Özet

Protein Arginin ( R ) -metilasyonu, çoklu biyolojik yolları düzenleyen geniş çaplı bir translasyonel sonrası modifikasyondur. Kütle spektrometresi, modifiye peptid zenginleştirme için biyokimyasal yaklaşımlarla birleştirildiğinde, R-metil-proteomun küresel profilini çıkarmak için en iyi teknolojidir. İnsan hücrelerinde küresel R-metilasyonun yüksek güvenilirlikle tanımlanması için tasarlanan iş akışı burada açıklanmaktadır.

Özet

Protein Arginin ( R ) -metilasyonu, RNA işleme, sinyal iletimi, DNA hasar yanıtı, miRNA biyogenezi ve translasyon dahil olmak üzere çeşitli hücresel yolakların düzenlenmesinde rol oynayan yaygın bir protein post-translasyonel modifikasyonudur (PTM).

Son yıllarda, biyokimyasal ve analitik gelişmeler sayesinde, kütle spektrometresi (MS) bazlı proteomikler, hücresel metil-proteomu tek bölge çözünürlüğü ile karakterize etmek için en etkili strateji olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, MS tarafından in vivo protein R-metilasyonunun tanımlanması ve profillenmesi, esas olarak bu modifikasyonun substokiyometrik doğası ve çeşitli amino asit ikamelerinin varlığı ve metilasyona izobarik olan asidik kalıntıların kimyasal metil-esterifikasyonu nedeniyle zor ve hataya açık olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, R-metil-peptitlerin tanımlanmasını arttırmak için zenginleştirme yöntemleri ve metil-proteomik çalışmalarda Yanlış Keşif Oranlarını (FDR) azaltmak için ortogonal doğrulama stratejileri gereklidir.

Burada, hücresel örneklerden yüksek güvenilirliğe sahip R-metil-peptitlerin tanımlanması ve kantitasyonu için özel olarak tasarlanmış bir protokol tanımlanmıştır; bu, hücrelerin metabolik etiketlemesini, ağır izotop kodlu Metiyonin (hmSILAC) ve tüm hücre ekstraktının çift proteaz çözelti içi sindirimi ile birleştiren, ardından anti-pan-R-metil antikorları kullanılarak R-metil-peptitlerin çevrimdışı Yüksek pH Ters Faz (HpH-RP) kromatografi fraksiyonasyonu ve afinite zenginleştirmesi ile eşleştirilmiştir. Yüksek çözünürlüklü MS analizi üzerine, ham veriler önce MaxQuant yazılım paketi ile işlenir ve sonuçlar daha sonra MaxQuant çıktı dosyalarındaki hafif ve ağır metil-peptide karşılık gelen MS tepe çiftlerinin derinlemesine araştırılması için tasarlanmış bir yazılım olan hmSEEKER tarafından analiz edilir.

Giriş

Arginin ( R ) -metilasyon, memeli proteomunun yaklaşık% 1'ini süsleyen bir translasyonel modifikasyondur (PTM)¹. Protein Arginin Metiltransferazlar (PRMT'ler), R'nin yan zincirinin guanidinos grubunun azot (N) atomlarına simetrik veya asimetrik bir şekilde bir veya iki metil grubunun birikmesiyle R-metilasyon reaksiyonunu katalize eden enzimlerdir. Memelilerde, PRMT'ler hem mono-metilasyon (MMA) hem de asimetrik di-metilasyon (ADMA), MMA ve simetrik di-metilasyon (SDMA) veya sadece MMA'yı biriktirme yeteneklerine bağlı olarak üç sınıfa ayrılabilir - sırasıyla ^2,3. PRMT'ler esas olarak G....

Protokol

1. Hücre kültürü ve protein ekstraksiyonu (zaman: 3 - 4 hafta gerekli)

1. HeLa hücrelerini, sırasıyla Hafif (L) veya Ağır (H) Metiyonin ile sağlanan ortamlarda paralel olarak büyütün (ortam bileşimi için Tablo 1'e bakınız). En az sekiz hücre bölünmesi üzerine, her SILAC kanalından bir hücre aliquot toplayın ve birleştirme testini gerçekleştirin.
   NOT: Birleştirme verimliliğini kontrol etmek için, LC-MS/MS analizi ile Ağır kanaldaki ağır Metiyonin (Met-4) yüzdesinin mümkün olduğunca %100'e yakın olduğunu test edin. Ağır etiketli hücrelerin bir aliquot'unu LC-MS/MS ile analiz edin (ayarlar için Tablo 2'ye bakın), ardından

Sonuçlar

Makalede, protein ekstraktının enzimatik sindiriminin paralel olarak iki ayrı proteaz ile kombinasyonuna dayanan küresel protein R-metilasyonunun yüksek güvenilirlikte tanımlanması için bir iş akışı anlatılmaktadır, bunu proteolitik peptitlerin HpH-RP sıvı kromatografisi fraksiyonasyonu ve R-metil-peptidlerin anti-pan-R-metil antikorları ile immüno-afinite zenginleştirmesi izlemektedir (Şekil 1).

Hücreler, doğal (Hafif, L, Met-0) veya izotop.......

Tartışmalar

Global MS bazlı proteomikler tarafından in vivo protein/peptit metilasyonunun yüksek güvenilirlikle tanımlanması, yüksek FDR riski nedeniyle, metilasyona izobarik olan ve ortogonal MS doğrulama stratejilerinin yokluğunda yanlış atamalara neden olabilen numune hazırlama sırasında meydana gelen çeşitli amino asit ikameleri ve metil-esterifikasyonu ile zordur. Bu PTM'nin substokiyometrik doğası, küresel metil-proteomiklerin görevini daha da karmaşıklaştırır, ancak modifiye peptidlerin seçi.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium Bicarbonate (AMBIC)	Sigma-Aldrich	09830
Ammonium Persulfate (APS)	Sigma-Aldrich	497363
C18 Sep-Pak columns vacc 6cc (1g)	Waters	WAT036905
Colloidal Coomassie staining Instant	Sigma-Aldrich	ISB1L-1L
cOmplete Mini, EDTA-free	Roche-Sigma Aldrich	11836170001	Protease Inhibitor
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS)	GIBCO ThermoFisher	26400-044
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	3483-12-3
DMEM Medium	GIBCO ThermoFisher	requested	with stabile glutamine and without methionine
EASY-nano LC 1200 chromatography system	ThermoFisher
EASY-Spray HPLC Columns	ThermoFisher	ES907
Glycerolo	Sigma-Aldrich	G5516
HeLa cells	ATCC	ATCC CCL-2
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Iodoacetamide (IAA)	Sigma-Aldrich	144-48-9
Jupiter C12-RP column	Phenomenex	00G-4396-E0
L-Methionine	Sigma-Aldrich	M5308	Light (L) Methionine
L-Methionine-(methyl-13C,d3)	Sigma-Aldrich	299154	Heavy (H) Methionine
LysargiNase	Merck Millipore	EMS0008
Microtip Cell Disruptor Sonifier 250	Branson
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich	T9281
Penicillin-Streptomycin	GIBCO ThermoFisher	15140122
PhosSTOP	Roche-Sigma Aldrich	4906837001	Phosphatase Inhibitor
Pierce C18 Tips	ThermoFisher	87782
Pierce  0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS Grade	ThermoFisher	85175	LC-MS Solvent B
Pierce  0.1% Formic Acid (v/v) in Water, LC-MS Grade	ThermoFisher	85170	LC-MS Solvent A
Pierce  Acetonitrile (ACN), LC-MS Grade	ThermoFisher	51101
Pierce  Water, LC-MS Grade	ThermoFisher	51140
Polyacrylamide	Sigma-Aldrich	92560
Precision Plus Protein  All Blue Prestained Protein Standards	Bio-Rad	1610373
PTMScan antibodies α-ADMA	Cell Signaling Technology	13474
PTMScan antibodies α-MMA	Cell Signaling Technology	12235
PTMScan antibodies α-SDMA	Cell Signaling Technology	13563
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer	ThermoFisher
Sequencing Grade Modified Trypsin	Promega	V5113
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	T6508
Ultimate 3000 HPLC	Dionex
Urea	Sigma-Aldrich	U5378
Vacuum Concentrator 5301	Eppendorf		Speed vac