Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Protein Arginin ( R ) -metilasyonu, çoklu biyolojik yolları düzenleyen geniş çaplı bir translasyonel sonrası modifikasyondur. Kütle spektrometresi, modifiye peptid zenginleştirme için biyokimyasal yaklaşımlarla birleştirildiğinde, R-metil-proteomun küresel profilini çıkarmak için en iyi teknolojidir. İnsan hücrelerinde küresel R-metilasyonun yüksek güvenilirlikle tanımlanması için tasarlanan iş akışı burada açıklanmaktadır.

Özet

Protein Arginin ( R ) -metilasyonu, RNA işleme, sinyal iletimi, DNA hasar yanıtı, miRNA biyogenezi ve translasyon dahil olmak üzere çeşitli hücresel yolakların düzenlenmesinde rol oynayan yaygın bir protein post-translasyonel modifikasyonudur (PTM).

Son yıllarda, biyokimyasal ve analitik gelişmeler sayesinde, kütle spektrometresi (MS) bazlı proteomikler, hücresel metil-proteomu tek bölge çözünürlüğü ile karakterize etmek için en etkili strateji olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, MS tarafından in vivo protein R-metilasyonunun tanımlanması ve profillenmesi, esas olarak bu modifikasyonun substokiyometrik doğası ve çeşitli amino asit ikamelerinin varlığı ve metilasyona izobarik olan asidik kalıntıların kimyasal metil-esterifikasyonu nedeniyle zor ve hataya açık olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, R-metil-peptitlerin tanımlanmasını arttırmak için zenginleştirme yöntemleri ve metil-proteomik çalışmalarda Yanlış Keşif Oranlarını (FDR) azaltmak için ortogonal doğrulama stratejileri gereklidir.

Burada, hücresel örneklerden yüksek güvenilirliğe sahip R-metil-peptitlerin tanımlanması ve kantitasyonu için özel olarak tasarlanmış bir protokol tanımlanmıştır; bu, hücrelerin metabolik etiketlemesini, ağır izotop kodlu Metiyonin (hmSILAC) ve tüm hücre ekstraktının çift proteaz çözelti içi sindirimi ile birleştiren, ardından anti-pan-R-metil antikorları kullanılarak R-metil-peptitlerin çevrimdışı Yüksek pH Ters Faz (HpH-RP) kromatografi fraksiyonasyonu ve afinite zenginleştirmesi ile eşleştirilmiştir. Yüksek çözünürlüklü MS analizi üzerine, ham veriler önce MaxQuant yazılım paketi ile işlenir ve sonuçlar daha sonra MaxQuant çıktı dosyalarındaki hafif ve ağır metil-peptide karşılık gelen MS tepe çiftlerinin derinlemesine araştırılması için tasarlanmış bir yazılım olan hmSEEKER tarafından analiz edilir.

Giriş

Arginin ( R ) -metilasyon, memeli proteomunun yaklaşık% 1'ini süsleyen bir translasyonel modifikasyondur (PTM)1. Protein Arginin Metiltransferazlar (PRMT'ler), R'nin yan zincirinin guanidinos grubunun azot (N) atomlarına simetrik veya asimetrik bir şekilde bir veya iki metil grubunun birikmesiyle R-metilasyon reaksiyonunu katalize eden enzimlerdir. Memelilerde, PRMT'ler hem mono-metilasyon (MMA) hem de asimetrik di-metilasyon (ADMA), MMA ve simetrik di-metilasyon (SDMA) veya sadece MMA'yı biriktirme yeteneklerine bağlı olarak üç sınıfa ayrılabilir - sırasıyla 2,3. PRMT'ler esas olarak GAR motifleri olarak bilinen glisin ve arginin bakımından zengin bölgelerde bulunan R kalıntılarını hedef alır, ancak PRMT5 ve CARM1 gibi bazı PRMT'ler prolin-glisin-metiyonin bakımından zengin (PGM) motifleri metilleştirebilir4. R-metilasyon, RNA ekleme5, DNA onarımı6, miRNA biyogenezi7 ve çeviri2 gibi çeşitli biyolojik süreçlerin bir protein modülatörü olarak ortaya çıkmış ve bu PTM üzerindeki araştırmaları teşvik etmiştir.

Kütle Spektrometresi (MS), protein, peptit ve saha çözünürlüğünde küresel R-metilasyonunu sistematik olarak incelemek için en etkili teknoloji olarak kabul edilmektedir. Bununla birlikte, bu PTM, MS tarafından yüksek güvenilirlikle tanımlanması için bazı özel önlemler gerektirir. İlk olarak, R-metilasyonu substokiyometriktir, peptitlerin değiştirilmemiş formu modifiye edilmiş olanlardan çok daha bol miktarda bulunur, böylece Veriye Bağımlı Edinme (DDA) modunda çalışan kütle spektrometreleri, yüksek yoğunluklu modifiye edilmemiş peptitleri, düşük yoğunluklu metillenmiş muadillerinden daha sık parçalayacaktır8. Ayrıca, R-metillenmiş saha tanımlaması için MS tabanlı iş akışlarının çoğu, biyoinformatik analiz düzeyinde sınırlamalardan muzdariptir. Gerçekten de, metil-peptitlerin hesaplamalı olarak tanımlanması yüksek Yanlış Keşif Oranlarına (FDR) eğilimlidir, çünkü bu PTM çeşitli amino asit ikamelerine (örneğin, glisin içine alanin) ve aspartat ve glutamatın metil-esterifikasyonu gibi kimyasal modifikasyonlara izobariktir9. Bu nedenle, Hücre kültüründe Amino Asitlerle Ağır Metil Kararlı İzotop Etiketleme (hmSILAC) gibi metil gruplarının izotop etiketlemesine dayanan yöntemler, in vivo metilasyonların güvenli MS-tanımlanması için ortogonal stratejiler olarak uygulanmış ve yanlış pozitif ek açıklamaların oranını önemli ölçüde azaltmıştır10.

Son zamanlarda, R-metillenmiş proteinleri incelemek için çeşitli proteom çapında protokoller optimize edilmiştir. R-metil-peptitlerin immüno-afinite zenginleştirilmesi için antikor tabanlı stratejilerin geliştirilmesi, insan hücrelerinde yüzlerce R-metillenmiş bölgenin ek açıklamasına yol açmıştır11,12. Ayrıca, birçok çalışma 3,13, antikor bazlı zenginleştirmenin HpH-RP kromatografi fraksiyonasyonu gibi peptid ayırma teknikleriyle birleştirilmesinin tanımlanan toplam metil-peptit sayısını artırabileceğini bildirmiştir.

Bu makalede, çeşitli biyokimyasal ve analitik adımlara dayanarak, insan hücrelerinde R-metillenmiş bölgelerin sistematik ve yüksek güvenilirlikle tanımlanması için tasarlanmış deneysel bir strateji açıklanmaktadır: hmSILAC etiketli hücrelerden protein ekstraksiyonu, Tripsin ve LysargiNase proteazları ile paralel çift enzimatik sindirim, ardından sindirilmiş peptitlerin HpH-RP kromatografik fraksiyonasyonu, MMA-, SDMA'nın antikor bazlı immüno-afinite zenginleştirmesi ile birleştiğinde, ve ADMA içeren peptitler. Tüm afiniteyle zenginleştirilmiş peptitler daha sonra DDA modunda yüksek çözünürlüklü Sıvı Kromatografisi (LC)-MS / MS ile analiz edilir ve ham MS verileri, R-metil-peptitlerin tanımlanması için MaxQuant algoritması tarafından işlenir. Son olarak, MaxQuant çıktı sonuçları, ağır ve hafif metil-peptit çiftlerini aramak için şirket içinde geliştirilen bir biyoinformatik araç olan hmSEEKER ile işlenir. Kısaca, hmSEEKER msms dosyasından metil-peptitler tanımlamalarını okur ve filtreler, daha sonra her metil-peptidi allPeptides dosyasındaki karşılık gelen MS1 zirvesiyle eşleştirir ve son olarak ağır / hafif peptid muadilinin zirvesini arar. Her varsayılan ağır-hafif çift için, Log2 H/L oranı (LogRatio), Bekletme Süresi farkı (dRT) ve Kütle Hatası (ME) parametreleri hesaplanır ve kullanıcı tanımlı kesmeler içinde bulunan çiftler gerçek pozitif olarak etiketlenir. Biyokimyasal protokolün iş akışı Şekil 1'de açıklanmıştır.

Protokol

1. Hücre kültürü ve protein ekstraksiyonu (zaman: 3 - 4 hafta gerekli)

  1. HeLa hücrelerini, sırasıyla Hafif (L) veya Ağır (H) Metiyonin ile sağlanan ortamlarda paralel olarak büyütün (ortam bileşimi için Tablo 1'e bakınız). En az sekiz hücre bölünmesi üzerine, her SILAC kanalından bir hücre aliquot toplayın ve birleştirme testini gerçekleştirin.
    NOT: Birleştirme verimliliğini kontrol etmek için, LC-MS/MS analizi ile Ağır kanaldaki ağır Metiyonin (Met-4) yüzdesinin mümkün olduğunca %100'e yakın olduğunu test edin. Ağır etiketli hücrelerin bir aliquot'unu LC-MS/MS ile analiz edin (ayarlar için Tablo 2'ye bakın), ardından Tablo 3'te belirtilen parametreleri kullanarak MS verilerini MaxQuant ile işleyin. Met-4 kuruluşunu kontrol etmek için https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/ şirket içi geliştirilmiş bir komut dosyası mevcuttur.
  2. Ağır Metiyonin birleşmesini% >97'ye ulaştığında tamamlanmış olarak düşünün. Her kanal toplam yaklaşık 60 x 10 hücre sayısına ulaştığında6 hücre (HeLa hücreleri için% 85 akıcılıkta her biri 15 cm'lik yaklaşık 40 kabak karşılık gelir, hücre tipine bağlı olarak değişir) bunları toplar. Bunları dikkatlice sayın, 1: 1 oranında karıştırın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 335 x g'de santrifüjleme ile pelet edin.
    NOT: Uygun 1: 1 L / H karışımını değerlendirmek için, bir aliquot tutun ve yüksek miktarda ve ağır R-metillenmiş protein (örneğin, fibrillarin) içerdiği bilinen bir jel dilimi üzerinde çalıştırın. Etiketleme başarılı olmuşsa ve 1:1 karıştırma sağlanmışsa, numunede bulunan R-metillenmiş peptitlerin hafif ve ağır versiyonlarının 1:1 oranında olması gerekir. Alternatif olarak, LC-MS / MS tarafından analiz edilecek karışık numunenin bir aliquot'unu tutun, ardından MS verilerini Tablo 3'te belirtilen parametreleri kullanarak MaxQuant ile işleyin ve Şekil 2C'de gösterildiği gibi Log2 H / L oranının dağılımını çizin. Protokol burada peleti kolayca dondurarak ve -80 ° C'de saklayarak durdurulabilir.
  3. Hücre peletini hücre pelet hacmine göre dört hacim Lizis Tamponunda (Lizis Tamponu bileşimi için Tablo 1'e bakınız) yeniden askıya alın. Örneğin, 1,5 mL hacme karşılık gelen 120 x 10 6 Hela hücresinden (60 x 10 6 Işık + 60 x 106 Ağır) bir pelet için6 mL Lizis Tamponu kullanın.
    NOT: Protein ekstraksiyonu oda sıcaklığında (RT) yapılmalıdır, çünkü Lizis Tamponu buz sıcaklığında çökelen kaotropik ajan 9 M Üre içerir; Bu nedenle, proteinleri proteolitik bozunma ve defosforilasyona karşı aynı anda korumak için geniş bir Serin ve Sistein proteaz inhibitör spektrumunun yanı sıra fosfataz inhibitörlerinin eklenmesi önemlidir, proteaz ve fosfataz inhibitörlerinin kokteyli küçük tabletler olarak ticari olarak temin edilebilir, bakınız Tablo 1 ve Malzeme Tablosu.
  4. Hücre zarlarının verimli bir şekilde kırılmasını ve DNA salınımını ve kesilmesini sağlamak için numuneyi 15 s ON ve 30 s KAPALI en az beş döngü için bir mikrotip hücre bozucu sonicator ile sonikleştirin. Çözeltiyi yukarı ve aşağı pipetleyerek ekstraktın viskozitesini kontrol edin. Eksik DNA kesme ve membran çözünürlüğü nedeniyle çok viskoz ise, sonikasyon döngülerini tekrarlayın.
    NOT: Numunenin sonikasyon sırasında aşırı ısınmadığından emin olun, çünkü yüksek sıcaklık proteinlere zarar verebilir. Bununla birlikte, 9M Üre varlığı nedeniyle örneği sonikasyon döngüleri arasında buz üzerine koymak mümkün değildir; Bu nedenle, farklı sonikasyon döngüleri arasında 60 s KAPALI için duraklatılması tavsiye edilir. Dahası, sonikasyon sırasında hava kabarcıklarının oluşumundan kaçının çünkü sonikasyon etkinliğini azaltırlar.
  5. Ekstraktı RT'de 10 dakika boyunca 3.000 x g'de santrifüj ederek kalıntıları toplayın ve süpernatantı yeni bir 15 mL tüpe aktarın.
  6. Ekstraktın protein içeriğini, Bradford veya biskinkoninik asit (BCA) 14,15 gibi kolorimetrik bir tahlille ölçün. Bu protokol için optimal bir başlangıç protein ekstraktı miktarı 20-30 mg arasındadır.
    NOT: Yüksek konsantrasyonlu üre içeren lizis tamponları hem Bradford hem de BCA nicelleştirme testi ile uyumludur; Yüksek konsantrasyonda sodyum dodesil sülfat (SDS) içerenler gibi diğer Lizis tamponu türleri Bradford ile uyumlu değildir.

2.  Lizat sindirimi (gösterge süresi 2 saat gerektirir)

  1. 4.5 mM'lik son konsantrasyonda ultra saf suda çözünmüş bir dikitiyotreitol (DTT) stok çözeltisi kullanarak proteinlerin tiol grubunun (-SH) indirgenmesini gerçekleştirin ve reaksiyonun 55 ° C'de 30 dakika boyunca devam etmesine izin verin.
    NOT: 1 M stok DTT çözeltisi hazırlamak ve 1 aya kadar -20 ° C'de saklamak mümkündür, böylece her deney için sadece gerekli olan alikotlar çözülür. Alternatif olarak, sülfhidril redüktant tris-(2-karboksiyetil)-fosfin (TCEP), -SH gruplarının indirgenmesini gerçekleştirmek için kullanılabilir; Özellikle proteinlerin uzun süreli depolanması için TCHEP, tamponda EGTA gibi metal şelatları olmayan DTT'den önemli ölçüde daha kararlıdır, oysa metal şelatlar varsa DTT daha kararlıdır16.
  2. 10 mM'lik bir konsantrasyonda iyodoasetamid (IAA) ekleyerek proteinlerin tiol grubunun (-SH) alkilasyonunu gerçekleştirin ve karanlıkta RT'de 15 dakika boyunca inkübe edin. Ekstrakte edilen proteinlerin inkübasyonunu karanlıkta IAA çözeltisi ile gerçekleştirin, çünkü IAA ışığa duyarlıdır.
    NOT: 100 mM'deki IAA stok çözeltisi her deneyden önce taze olarak hazırlanmalıdır. Alternatif olarak, kloroasetamid, -SH gruplarının alkilasyonunu gerçekleştirmek için kullanılabilir, özellikle de deneyin amacı metilasyon ve ubikitinasyon arasındaki çapraz konuşmayı analiz etmekse, çünkü IAA kaynaklı artefakt ubikitinasyonu taklit eder17.
  3. Protein sindirim adımına geçmeden önce, SDS-PAGE Coomassie boyalı jel üzerinde daha sonraki analizler ve sindirim üzerine karşılık gelen miktarda numune ile karşılaştırma için bir protein ekstraktı (1/1.000 başlangıç yapılmamış lizat) saklayın; Bu test proteoliz etkinliğini doğrulamaya yarar (bkz. nokta 4).
  4. Kalan protein ekstraktını dört hacim 20 mM HEPES pH 8.0 ile seyreltin, böylece 2 M'lik bir nihai üre konsantrasyonuna (proteazların enzimatik aktivitesi ile uyumlu konsantrasyondur) ulaşın. Numuneyi iki bölüme ayırın: birincisinde Sıralama Sınıfı Modifiye Tripsin ekleyin ve ikincisinde başlangıç malzemesinin mg'ına göre 1:100 (w / w) oranında LysargiNase proteaz ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. Enzimatik sindirime izin vermek için gece boyunca 37 ° C'de 600 rpm'de bir termomikserde bırakın.
    NOT: Proteomikte en yaygın sindirim enzimi olan tripsin, R ve Lizin'in (K) C-ucunda ayrılır ve çarpışmaya bağlı ayrışma (CID) üzerine y-tipi iyonların hakim olduğu parçalanma spektrumları ile sonuçlanan bir yük dağılımına sahip peptitler üretir. LysargiNase, R ve K'nın N-terminusunda ayrılır, bu nedenle, Tripsin bölünme özgüllüğünü yansıtır ve CID parçalanması üzerine esas olarak b-tipi iyonları serbest bırakan peptitler üretir. Bu kombine analiz, peptid dizisi kapsamının çok artmasına ve R-metilasyonlarının bölgeye özgü tanımlanmasında daha fazla güvene yol açar18.

3. Peptit saflaştırma (gösterge süresi 1 saat gerektirir)

  1. Her iki reaksiyondan da sindirilmiş peptitlerin bir alikotunu saklayın, proteaz sindirim verimliliğini değerlendirmek için SDS-PAGE Coomassie boyalı jel üzerinde karşılaştırma için madde 2.3'teki ile aynı hacimleri toplayın (bkz. nokta 4).
  2. Numuneleri% 5'lik bir nihai konsantrasyona trifloroasetik asit (TFA) ilavesiyle asitleştirerek sindirimi durdurun. İyice karıştırın ve numunelerin pH'ını bir turnusol kağıdıyla ölçün (pH yaklaşık 3 olmalıdır). Vorteksi kısaca yapın ve asitlenmiş numuneleri yeni 15 mL tüplere aktarmadan önce döndürün.
  3. Numuneleri, biri Tripsin ile sindirilen numune için, diğeri LysargiNase ile sindirilen numune için olmak üzere iki C18 vac kartuşundan (sorbent ağırlığı 1 g, Malzeme Tablosuna bakınız) temizleyin. Solvent A, Solvent B ve Yıkama Tamponunu hazırlayın (tampon bileşimi için Tablo 1'e bakınız).
  4. Cam pipetler kullanarak, her kartuşu 6 mL ACN ile 3 kez %100 oranında rehidre edin. Bundan sonra, her kartuşu sırayla 3-9-18 mL Solvent A ile dengeleyin. numuneleri yükleyin (reçineler sarı olmalıdır). 3-9-18 mL Solvent A ile sırayla tekrar yıkayın ve ardından 6 mL Yıkama tamponu ekleyin. Her bir sütunu temiz 15 mL tüplere aktarın ve numuneleri 7 mL Solvent B ile süzün. 14 mL'lik son hacim için elüsyon adımını 7 mL Solvent B ile tekrarlayın.
    NOT: Tüm bu adımları, tamponların ve çözeltinin sütunlardan yerçekimi ile geçmesine izin vererek gerçekleştirin. Tamponların kolondan akışını desteklemek için, vakumu taklit etmek için her çözeltiyi bir şırınga ile yavaşça itin.
  5. SDS-PAGE tarafından sonraki peptid değerlendirmesi için 50 μL salınımlı peptit, 50 μL akış (FT), Solvent A ile yıkamanın 50 μL'si ve son yıkamanın 50 μL'sini kaydedin (bkz. madde 4).

4. Coomassie boyalı SDS-PAGE jel (gösterge süresi 2 saat gerektirir)

  1. Toplanan alikotları% 17,5'lik bir SDS-PAGE jel üzerinde çalıştırın ve Instant-Blu Coomassie boyama ile boyayın (bkz. Beklenen sonuç Şekil 2A'da gösterilmiştir.

5. Peptit liyofilizasyonu (gösterge süresi 2 gün)

  1. Salınımlı peptitleri içeren 15 mL tüpleri parafin filmi ile örtün, daha sonra 3-5 delik oluşturmak için 20 G'lik bir iğne ile delinir. Tüpleri, numuneler tamamen donana kadar en az 30 dakika kuru buz içine koyun.
  2. Dondurulmuş fraksiyonları, dondurarak kurutucu performansı nedeniyle bazı değişkenlikler meydana gelse bile, numunelerin tam liyofilizasyonunu sağlamak için tipik olarak yeterli bir zaman aralığı olan 48 saat boyunca liyofilize edin.
    NOT: Deney burada duraklatılabilir ve liyofilize numuneler -80 °C'de saklanabilir.

6. Peptitlerin çevrimdışı HpH-RP kromatografik fraksiyonasyonu (gösterge süresi 4 gün)

  1. Peptitleri 60 fraksiyona ayırmak için, C12-RP HPLC sütunu (250 x 4.6 mm, 4 μm Proteo 90A) ile donatılmış HPLC sistemini kullanarak HpH-RP sıvı kromatografisini kullanın.
  2. Çalıştırmadan önce, taze Tampon A ve Tampon B hazırlayın (Tamponların bileşimi Tablo 1'de açıklanmıştır).
  3. Tüm çözeltiyi 0,22 μm filtre ile filtreleyin ve en az 30 dakika boyunca bir sonicator banyosunda gazını çözün.
  4. Liyofilize peptitleri 1 mL Tampon A'da çözün Peptitleri bir şırınga kullanarak bir politetrafloroetilen (PTFE) 0.45 μm filtreden süzün.
  5. Fraksiyonasyon hızını 1 mL/dak akışa ayarlayın ve aşağıdaki kromatografik gradyanı kullanarak 1 mL fraksiyon toplayın: 60 dakikada %5 B ila %30 B; 2 dakika içinde% 30 B'den% 60'a; 3 dakika boyunca %70 B
  6. HPLC'yi, bu noktada, fraksiyon toplama durdurulacak ve gradyan, %100 Tampon B'ye kadar hızlı bir gradyanla sütunun kapsamlı bir şekilde yıkanmasından önce 5 dakika boyunca %70 Tampon B'de tutulacak ve ardından son bir yıkama (10 dakika boyunca %100 Tampon B) olacak şekilde ayarlayın.
    NOT: Her kromatografik çalışmanın sonunda, sütunu her zaman 20 dakika boyunca% 100 Arabellek A ile dengeleyin.
  7. Her iki numuneyi, madde 6.5'te açıklandığı gibi, Off-Line HpH RP kromatografik gradyanları ile Tripsin ve LysargiNase ile ayrı ayrı sindirilmiş olarak fraksiyone edin.
  8. Her kromatografik gradyan için, tüm fraksiyonları derin bir 96 kuyucuk plakasında toplayın.
  9. Degradeden önce toplanan kesirleri PRE adlı tek bir kesirde toplayın. HpH-RP sıvı kromatografik (LC) gradyanından 60 fraksiyonu, bitişik olmayan bir şekilde 14 son fraksiyonda birleştirerek birleştirin. Bu tür bitişik olmayan birleştirmeyi elde etmek için, HpH-RP fraksiyonlarını aşağıdaki şemaya göre bir araya getirin.
    1. Fraksiyon 1 (son cilt 5 mL): Havuz 1-15-29-43-57
    2. Fraksiyon 2 (son cilt 5 mL): Havuz 2-16-30-44-58
    3. Fraksiyon 3 (son cilt 5 mL): Havuz 3-17-31-45-59
    4. Fraksiyon 4 (son cilt 5 mL): Havuz 4-18-32-46-60
    5. Fraksiyon 5 (son cilt 4 mL): Havuz 5-19-33-47
    6. Fraksiyon 6 (son cilt 4 mL): Havuz 6-20-34-48
    7. Fraksiyon 7 (son cilt 4 mL): Havuz 7-21-35-49
    8. Fraksiyon 8 (son cilt 4 mL): Havuz 8-22-36-50
    9. Fraksiyon 9 (son cilt 4 mL): Havuz 9-23-37-51
    10. Fraksiyon 10 (son cilt 4 mL): Havuz 10-24-38-52
    11. Fraksiyon 11 (son cilt 4 mL): Havuz 11-25-39-53
    12. Fraksiyon 12 (son cilt 4 mL): Havuz 12-26-40-54
    13. Fraksiyon 13 (son cilt 4 mL): Havuz 13-27-41-55
    14. Fraksiyon 14 (son cilt 4 mL): Havuz 14-28-42-56
      NOT: Bitişik olmayan birleştirme, havuzlanmış fraksiyonlar içindeki peptid bileşimindeki heterojenliğin arttırılmasına izin veren erken, orta ve geç salınımlı fraksiyonların birleştirilmesinden oluşur. Sonuç olarak, havuzlanmış her fraksiyonun peptid karışımı, kütle spektrometresine doğrudan bağlanmış sonraki nano akışlı düşük pH-RP-LC kromatografisinde, sınırlı ko-elüsyon ile verimli bir şekilde ayrılır.
  10. Degradeden sonra toplanan kesirleri POST adlı benzersiz bir kesirde toplayın.
    NOT: PRE ve POST gradyanı fraksiyonları dahil edilerek, 15 mL tüplerde toplam 16 fraksiyon elde edilir (bkz. Şekil 3A).
  11. 15 mL tüpleri parafin film ile örtün ve 3-5 delik oluşturmak için 20 G'lik bir iğne ile delin. Santrifüj tüplerini kuru buzda inkübe ederek her fraksiyon tamamen donana kadar dondurun.
  12. Fraksiyonları yaklaşık 48 saat boyunca liyofilize edin. Dondurarak kurutucuyu durdurmadan önce her numunenin tamamen kuruduğundan emin olun.
    NOT: Deney burada duraklatılabilir ve liyofilize numuneler -80 °C'de saklanabilir.

7. R-metillenmiş peptid immüno-afinite zenginleştirme (gösterge süresi 2 gün)

  1. Modifiye peptidin anti-pan-R-metilasyon antikorları ile sıralı immüno-afinite zenginleştirmesini paralel olarak, ancak sırasıyla Tripsin ve LysargiNase sindirimlerinden alınan iki örnek için ayrı ayrı gerçekleştirin. İmmüno-Afinite Saflaştırma (IAP) Tamponu, modifiye peptid afinite zenginleştirmesi için anti-pan-R-metil antikorlarını satın alan şirket tarafından sağlanır (ayrıntılar Tablo Materyali ve Reaktifler'dedir). IAP tamponu 10x konsantre edilmiştir ve kullanımdan önce 10 kez seyreltilmelidir.
    NOT: IAP Arabellek 1x, -20 °C'de 1 yıla kadar saklanabilir.
  2. Peptitleri 15 mL tüpün dibine doğru döndürmek için RT'de 5 dakika boyunca liyofilize peptitleri 2.000 x g'de santrifüj edin. Liyofilize peptitleri 15 mL tüp başına 250 μL 1x IAP Tamponu ile tekrar askıya alın ve 1.5 mL düşük bağlayıcı bir tüpe aktarın. Bir turnusol kağıdı kullanarak pH'ın >6 olup olmadığını kontrol edin.
  3. Sonraki MS analizi için girdi olarak her fraksiyonun küçük bir aliquot'unu (hacmin yaklaşık% 5'i) tutun.
  4. Asimetrik di-metillenmiş (ADMA) ve simetrik olarak di-metillenmiş (SDMA) peptitlerin immüno-zenginleştirmesini paralel olarak gerçekleştirmek için her fraksiyonu iki alikotta bölün.
  5. İlk protein ekstraktının 10 mg'ı başına protein A agaroz boncuklarına konjuge edilmiş seçilmiş anti-pan-R-metillenmiş antikorların üç şişesini kullanın.
  6. Her bir şişeyi 2.000 x g'de 30 s boyunca santrifüj ederek ve tamponu boncuklardan çıkararak agaroz boncuklarına konjuge edilmiş doğru antikor miktarını hazırlayın. Boncukları her zaman 1 mL 1x PBS ile üç kez yıkayın, 30 s boyunca 2.000 x g'de santrifüj yapın.
  7. Son yıkamadan sonra, boncukları her şişe için 40 μL 1x PBS'de tekrar askıya alın; onları bir araya getirin ve sonunda 16 fraksiyona eşit olarak bölün (böylece her fraksiyona 2.5 μL antikor-boncuk eklenir).
  8. Her tüpe 250 μL 1x IAP Tamponu ekleyin, ters çevirerek karıştırın ve 4 ° C'de 2 saat boyunca dönen bir tekerlek üzerinde inkübe edilmesine izin verin.
    NOT: Numuneleri, boncuklara zarar verebilecek veya kaybetmelerine neden olabilecek mikro uçlarla pipetlemek yerine 1,5 mL'lik tüpleri ters çevirerek karıştırın.
  9. 2 saatlik inkübasyonda, peptitler ve pan-R-metil-antikor-konjuge boncuklar içeren 1.5 mL tüpleri, boncukları peletlemek için 30 s boyunca 2.000 x g'de santrifüj yapın; FT'yi her fraksiyondan temiz 1,5 mL düşük bağlayıcı tüplere aktarın.
  10. R-mono-metilasyona (MMA) karşı antikorlara konjuge edilmiş boncukları FT'lere ekleyin ve 7.7 ila 7.9 arasındaki adımları tekrarlayın.
  11. Peptit örneklerinin MMA-boncuklarla inkübasyonu sırasında, daha önce anti-ADMA ve SDMA ile immüno-çökeltilmiş fraksiyonların iki katını 250 μL IAP Tamponu ile yıkayın (ters çevirme ve pipetleme değil) ve her yıkamada süpernatantı atın.
  12. LC-MS derece H2O ile yıkamayı üç kez tekrarlayın.
  13. Her tüpe 50 μL% 0.15 TFA ekleyerek agaroz boncuklarından afinite bakımından zenginleştirilmiş simetrik ve asimetrik olarak R-di-metillenmiş peptitleri etkisiz hale getirin (güçlü asit koşulları, aslında, antijenlerin antikorlardan salınmasına yol açan epitopu denatüre eder). Bu çözeltiyi RT'de 10 dakika bırakın, tüpleri her 2-3 dakikada bir ters çevirin.
  14. İlk elüsyonu temiz 1,5 mL düşük bağlayıcı tüplere aktarın ve elüsyonu 50 μL% 0,15 TFA ile tekrarlayın; 2 fraksiyonu bir tüpte toplayın.
  15. Anti-MMA antikor-boncukları ile inkübe edilen R-mono-metillenmiş peptitler için 7.11 ila 7.14 arasındaki adımları tekrarlayın.

8. Afinite ile zenginleştirilmiş metil-peptitlerin C18 mikrokolonları ile tuzdan arındırılması ve konsantrasyonu (gösterge süresi 30 dakika gerektirir)

  1. MS analizi19'dan önce peptid tuzdan arındırma ve konsantrasyon için 3M Katı Faz ekstraksiyon kartuşları ile yapılan C18-RP mikrokolonlarını metanol ile dengeleyin.
  2. Numuneleri (ayrı immüno-afinite ile zenginleştirilmiş fraksiyonlara ve giriş fraksiyonlarına karşılık gelen) C18 mikrokolonlarına iki adımda (her C18 mikrokolonunda 50 μL + 50 μL) 6 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj yaparak yükleyin.
  3. Mikrokolonları 55 μL Tampon A ile yıkayın (tampon bileşimi için Tablo 1'e bakınız), her zaman 5 dakika boyunca yaklaşık 900 x g'de santrifüjleme yoluyla.
    NOT: Deney burada duraklatılabilir ve C18-RP mikrokolonları 4 °C'de bırakılarak 2 haftaya kadar saklanabilirler.

9. İkinci enzimatik sindirim (gösterge süresi 3 saat gerektirir)

  1. C18-RP mikrokolonlarını 55 μL Tampon A ile iki kez yıkayın (tampon bileşimi için Tablo 1'e bakınız), 5 dakika boyunca yaklaşık 850 x g'de santrifüjleme yoluyla.
  2. Peptitleri 20 μL Tampon B ile iki kez süzün (tampon bileşimi için Tablo 1'e bakınız) ve iki fraksiyonu bir araya getirin.
  3. Salınımlı peptitleri bir vakum yoğunlaştırıcısında kurutun (ayrıntılar için Tablo Malzemesi ve Reaktifleri'ne bakınız). Bu arada, taze yapılmış 1 M stok çözeltisinden seyreltilmiş 50 mM amonyum bikarbonattan oluşan sindirim çözeltisini hazırlayın (bkz. Tablo 1).
  4. İlgili numunelere, 25 ng / μL'lik son konsantrasyona Tripsin veya LysargiNase ekleyin.
  5. Sindirimi durdurmak için 1 μL% 5 TFA ekleyin; vorteks ve numuneleri aşağı doğru döndürün.
    NOT: Tripsin tarafından enzimatik bölünme, metillenmiş R ve K'nın C-ucunda inhibe edilebilir, bu da peptid uzunluğunu ve yükünü artıran kaçırılmış bölünmelere neden olur, bu da peptid tanımlamasını ve metilasyon bölgelerinin bölgeye özgü atfedilmesini engelleyen karmaşık ve eksik parçalanma spektrumları üretir. İkinci bir enzimatik sindirimin, bu tür kaçırılmış bölünmelerin sıklığını azaltabileceği, gelişmiş dizi kapsamı ve saha ilişkilendirmesi20 ile gösterilmiştir.

10. Tuzdan arındırma peptidleri (gösterge süresi 30 dakika gerektirir)

  1. Asitleştirilmiş peptit çözeltilerini, madde 8'de açıklanan aynı adımları izleyerek daha önce dengelenmiş olan yeni C18-RP mikrokolonlarına yükleyin.
  2. C18-RP mikrokolonlarına yüklenen peptid, LC-MS / MS analizi için elüsyona kadar 4 ° C'de saklanabilir.

11. Sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) analizi (gösterge süresi 5 gün)

  1. Peptitleri C18-RP mikrokolonlarından 10μL Tampon B'yi geçirerek, RT'de 5 dakika boyunca 615 x g'de santrifüj yaparak süzün. Bu adımı iki kez tekrarlayın ve eluateleri birleştirin.
  2. Bir vakum yoğunlaştırıcısındaki elüatların hacmini neredeyse kuruyana kadar azaltın ve aşırı kurumayı önleyin.
  3. LC-MS/MS analizi için peptitleri 10 μL Tampon A'da tekrar askıya alın.
  4. R-metil-peptitlerin her bir fraksiyonunu, nano akışlı ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi (UHPLC) sistemine bağlı olarak, yüksek çözünürlüklü bir Kütle Spektrometresinde (bkz. Malzeme Tablosu) sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS / MS) ile analiz edin. Cihaz parametrelerini Tablo 2'de açıklandığı gibi ayarlayın.
  5. Her numunenin 2 μL'sini, C18-RP reçine (2 μm partikül boyutu) ile paketlenmiş bir nano-analitik kolona (kolay püskürtme sütunu 75 μm iç çap, 25 cm uzunluk) yükleyin.
  6. Numuneler C18 RP nano-kolonundan 300 nL/dak akış hızında geçirilir ve aşağıdaki doğrusal gradyan uygulanır: 89 dakika için %3-%30 B, 5 dakika için %30-%60 B, 1 dakika için %60-%95 B ve 5 dakika boyunca %95 B.
  7. Kütle spektrometresi, tam tarama MS ve MS/MS alımı arasında otomatik olarak geçiş yapmak için veriye bağımlı toplama (DDA) modunda çalışır. Spektrometre dedektöründe analiz edilecek anket tam tarama MS'sini R = 70.000 çözünürlüğünde ayarlayın. En yoğun on beş peptid iyonu, 3 x 106'lık bir hedef değere sırayla izole edilir ve% 28'lik göreceli çarpışma enerjisi ile parçalanır. İzin verilen maksimum iyon biriktirme sürelerini tam taramalar için 20 ms'ye ve MS/MS için 50 ms'ye ayarlayın ve MSMS için hedef değeri 1 x 106 olarak sabitleyin. Dinamik hariç tutma süresi 20 sn olarak ayarlanır.

12. MaxQuant ve hmSEEKER veri analizinin çalıştırılması

  1. LC-MS / MS çalıştırmalarının tamamlanmasının ardından, metil-peptitleri referans veritabanına karşı olasılık tabanlı yaklaşımla tanımlamak için MS ham verilerini bir peptid arama motoruna aktarın. Bu protokolde analizimiz için MaxQuant versiyon 1.6.2.10 kullanılmıştır. MaxQuant'ın çalışması için en az 2 GB RAM'in yanı sıra tüm ham verileri ve tüm çıktı dosyalarını depolamak için yeterli disk alanı gerekir.
    NOT: Kurulum, donanım ve yazılım gereksinimleri hakkında tüm ayrıntılar için https://www.maxquant.org adresindeki resmi belgelere bakın.
  2. Her ham veri dosyasını çoğaltın. Orijinalleri, adlarına "_light" ekleyerek yeniden adlandırın, ardından "_heavy" ekleyerek kopyaları yeniden adlandırın.
    NOT: hmSEEKER, aşağı akış analizi için komut dosyası, büyük/küçük harfe duyarlıdır.
  3. Tablo 3'te belirtilen ayarlarla peptid tanımlaması için MaxQuant/Andromeda aramasını başlatın. MaxQuant tarafından üretilen birkaç çıktı verisinden yalnızca allPeptides.txt ve msms.txt dosyaları (birleştirilmiş/txt alt klasöründe bulunur) işlem sonrası adım için gereklidir.
  4. MaxQuant çıktı verilerinin son işlenmesi hmSEEKER algoritması tarafından gerçekleştirilir. hmSEEKER'ı şuradan indirin: https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/. Betik, Python 3.7'de yazılmış bir Jupyter not defteri olarak kullanılabilir ve test amacıyla örnek bir veri kümesiyle birlikte gelir. Yeni kullanıcılar için, Anaconda platformunu (https://www.anaconda.com/products/individual) indirip yüklemeniz önerilir. En son sürüm varsayılan olarak Python 3.8, Jupyter ve hmSEEKER'ı çalıştırmak için gereken tüm paketleri içerir (örneğin, Scikit-learn 0.23.1).
  5. Bir klasör oluşturun ve MaxQuant çıktısından allPeptides.txt ve msms.txt dosyalarını saklayın.
  6. Jupyter'ı başlatın (komut satırından veya Anaconda navigatörden).
  7. hmSEEKER klasörüne gidin ve hmSEEKER.ipynb dosyasını açın.
  8. Not defterinin Giriş Parametreleri bölümünde, FASTA veritabanına ve MaxQuant metin dosyalarını içeren klasörlere giden yolları belirtin.
  9. Hücreyi seçip Jupyter arayüzünün üstündeki Oynat düğmesine tıklayarak her hücrenin içindeki kodu çalıştırın.
  10. Betik, analiz edilen her veri kümesi için virgülle ayrılmış bir çıktı dosyası ve birleştirilmiş bir dosya oluşturur. Son çiftler listesi "[tarih]-[saat]-combined_hmSILAC_doublets_HxL_summary.csv" adlı dosyada bulunabilir.
    (Tablo 4 , çıktı tablosundaki sütunların kısa bir açıklamasını içerir).

Sonuçlar

Makalede, protein ekstraktının enzimatik sindiriminin paralel olarak iki ayrı proteaz ile kombinasyonuna dayanan küresel protein R-metilasyonunun yüksek güvenilirlikte tanımlanması için bir iş akışı anlatılmaktadır, bunu proteolitik peptitlerin HpH-RP sıvı kromatografisi fraksiyonasyonu ve R-metil-peptidlerin anti-pan-R-metil antikorları ile immüno-afinite zenginleştirmesi izlemektedir (Şekil 1).

Hücreler, doğal (Hafif, L, Met-0) veya izotop...

Tartışmalar

Global MS bazlı proteomikler tarafından in vivo protein/peptit metilasyonunun yüksek güvenilirlikle tanımlanması, yüksek FDR riski nedeniyle, metilasyona izobarik olan ve ortogonal MS doğrulama stratejilerinin yokluğunda yanlış atamalara neden olabilen numune hazırlama sırasında meydana gelen çeşitli amino asit ikameleri ve metil-esterifikasyonu ile zordur. Bu PTM'nin substokiyometrik doğası, küresel metil-proteomiklerin görevini daha da karmaşıklaştırır, ancak modifiye peptidlerin seçi...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

MM ve EM, Avrupa Moleküler Tıp Okulu (SEMM) bünyesindeki doktora öğrencileridir. EM, 3 yıllık FIRC-AIRC bursunun sahibidir (Proje Kodu: 22506). TB grubundaki R-metil-proteomların küresel analizleri AIRC IG Hibe (Proje Kodu: 21834) ile desteklenmektedir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Ammonium Bicarbonate (AMBIC)Sigma-Aldrich09830
Ammonium Persulfate (APS)Sigma-Aldrich497363
C18 Sep-Pak columns vacc 6cc (1g)WatersWAT036905
Colloidal Coomassie staining InstantSigma-AldrichISB1L-1L
cOmplete Mini, EDTA-freeRoche-Sigma Aldrich11836170001Protease Inhibitor
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS)GIBCO ThermoFisher26400-044
DL-Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich3483-12-3
DMEM MediumGIBCO ThermoFisherrequested with stabile glutamine and without methionine
EASY-nano LC 1200 chromatography systemThermoFisher
EASY-Spray HPLC ColumnsThermoFisherES907
GlyceroloSigma-AldrichG5516
HeLa cellsATCCATCC CCL-2
HEPESSigma-AldrichH3375
Iodoacetamide (IAA)Sigma-Aldrich144-48-9
Jupiter C12-RP columnPhenomenex00G-4396-E0
L-MethionineSigma-AldrichM5308Light (L) Methionine
L-Methionine-(methyl-13C,d3)Sigma-Aldrich299154Heavy (H) Methionine
LysargiNaseMerck MilliporeEMS0008
Microtip Cell Disruptor Sonifier 250Branson
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED)Sigma-AldrichT9281
Penicillin-StreptomycinGIBCO ThermoFisher15140122
PhosSTOPRoche-Sigma Aldrich4906837001Phosphatase Inhibitor
Pierce C18 TipsThermoFisher87782
Pierce  0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS GradeThermoFisher85175LC-MS Solvent B
Pierce  0.1% Formic Acid (v/v) in Water, LC-MS GradeThermoFisher85170LC-MS Solvent A
Pierce  Acetonitrile (ACN), LC-MS GradeThermoFisher51101
Pierce  Water, LC-MS GradeThermoFisher51140
PolyacrylamideSigma-Aldrich92560
Precision Plus Protein  All Blue Prestained Protein StandardsBio-Rad1610373
PTMScan antibodies α-ADMACell Signaling Technology13474
PTMScan antibodies α-MMACell Signaling Technology12235
PTMScan antibodies α-SDMACell Signaling Technology13563
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass SpectrometerThermoFisher
Sequencing Grade Modified TrypsinPromegaV5113
Trifluoroacetic acidSigma-AldrichT6508
Ultimate 3000 HPLCDionex
UreaSigma-AldrichU5378
Vacuum Concentrator 5301EppendorfSpeed vac

Referanslar

  1. Bulau, P., et al. Quantitative assessment of arginine methylation in free versus protein-incorporated amino acids in vitro and in vivo using protein hydrolysis and high-performance liquid chromatography. Biotechniques. 40 (3), 305-310 (2006).
  2. Blanc, R. S., Richard, S. Arginine methylation: the coming of age. Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).
  3. Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).
  4. Yang, Y., Bedford, M. T. Protein arginine methyltransferases and cancer. Nature Reviews Cancer. 13 (1), 37-50 (2013).
  5. Bezzi, M., et al. Regulation of constitutive and alternative splicing by PRMT5 reveals a role for Mdm4 pre-mRNA in sensing defects in the spliceosomal machinery. Genes & Development. 27 (17), 1903-1916 (2013).
  6. Auclair, Y., Richard, S. The role of arginine methylation in the DNA damage response. DNA Repair. 12 (7), 459-465 (2013).
  7. Spadotto, V., et al. PRMT1-mediated methylation of the microprocessor-associated proteins regulates microRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. 48 (1), 96-115 (2020).
  8. Musiani, D., Massignani, E., Cuomo, A., Yadav, A., Bonaldi, T. Biochemical and computational approaches for the large-scale analysis of protein arginine methylation by mass spectrometry. Current Protein and Peptide Science. 21 (7), 725-739 (2020).
  9. Ong, S. -. E., Mittler, G., Mann, M. Identifying and quantifying in vivo methylation sites by heavy methyl SILAC. Nature Methods. 1 (2), 119-126 (2004).
  10. Hart-Smith, G., Yagoub, D., Tay, A. P., Pickford, R., Wilkins, M. R. Large scale mass spectrometry-based identifications of enzyme-mediated protein methylation are subject to high false discovery rates. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (3), 989-1006 (2016).
  11. Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).
  12. Larsen, S. C., et al. Proteome-wide analysis of arginine monomethylation reveals widespread occurrence in human cells. Science Signaling. 9 (443), (2016).
  13. Massignani, E., et al. hmSEEKER: Identification of hmSILAC doublets in MaxQuant output data. Proteomics. 19 (5), 1800300 (2019).
  14. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  15. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  16. Getz, E. B., Xiao, M., Chakrabarty, T., Cooke, R., Selvin, P. R. A comparison between the sulfhydryl reductants tris(2-carboxyethyl)phosphine and dithiothreitol for use in protein biochemistry. Analytical Biochemistry. 273 (1), 73-80 (1999).
  17. Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
  18. Huesgen, P. F., et al. LysargiNase mirrors trypsin for protein C-terminal and methylation-site identification. Nature Methods. 12 (1), 55-58 (2015).
  19. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896 (2007).
  20. Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).
  21. Bremang, M., et al. Mass spectrometry-based identification and characterisation of lysine and arginine methylation in the human proteome. Molecular bioSystems. 9 (9), 2231-2247 (2013).
  22. Geoghegan, V., Guo, A., Trudgian, D., Thomas, B., Acuto, O. Comprehensive identification of arginine methylation in primary T cells reveals regulatory roles in cell signalling. Nature Communications. 6 (1), 1-8 (2015).
  23. Tabb, D. L., Huang, Y., Wysocki, V. H., Yates, J. R. Influence of basic residue content on fragment ion peak intensities in low-energy collision-induced dissociation spectra of peptides. Analytical Chemistry. 76 (5), 1243-1248 (2004).
  24. Guthals, A., Bandeira, N. Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (9), 550-557 (2012).
  25. Swaney, D. L., et al. Supplemental activation method for high-efficiency electron-transfer dissociation of doubly protonated peptide precursors. Analytical Chemistry. 79 (2), 477-485 (2007).
  26. Kundinger, S. R., Bishof, I., Dammer, E. B., Duong, D. M., Seyfried, N. T. Middle-down proteomics reveals dense sites of methylation and phosphorylation in arginine-rich RNA-binding proteins. Journal of Proteome Research. 19 (4), 1574-1591 (2020).
  27. Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6176-6186 (2014).
  28. Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Review of Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
  29. Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).
  30. Uhlmann, T., et al. A method for large-scale identification of protein arginine methylation. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (11), 1489-1499 (2012).
  31. Wang, K., et al. Antibody-free approach for the global analysis of protein methylation. Analytical chemistry. 88 (23), 11319-11327 (2016).
  32. Moore, K. E., et al. A general molecular affinity strategy for global detection and proteomic analysis of lysine methylation. Molecular cell. 50 (3), 444-456 (2013).
  33. Wu, Z., et al. A chemical proteomics approach for global analysis of lysine monomethylome profiling. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (2), 329-339 (2015).
  34. Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).
  35. Tay, A. P., Geoghegan, V., Yagoub, D., Wilkins, M. R., Hart-Smith, G. MethylQuant: A Tool for Sensitive Validation of Enzyme-Mediated Protein Methylation Sites from Heavy-Methyl SILAC Data. Journal of Proteome Research. 17 (1), 359-373 (2018).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyokimyaSay 182R metilasyonproteomikk tle spektrometrisiprotein arginin metiltransferazlarhmSILACimm no afinite zenginle tirmeHpH RP kromatografi fraksiyonasyonu

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır