АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Белковое аргининовое (R)-метилирование является широко распространенной посттрансляционной модификацией, регулирующей несколько биологических путей. Масс-спектрометрия является лучшей технологией для глобального профилирования R-метил-протеома в сочетании с биохимическими подходами к обогащению модифицированными пептидами. Рабочий процесс, предназначенный для высокой достоверности идентификации глобального R-метилирования в клетках человека, описан здесь.

Аннотация

Белковое аргининовое (R)-метилирование является широко распространенной посттрансляционной модификацией белка (PTM), участвующей в регуляции нескольких клеточных путей, включая обработку РНК, трансдукцию сигналов, реакцию на повреждение ДНК, биогенез микроРНК и трансляцию.

В последние годы, благодаря биохимическим и аналитическим разработкам, протеомика на основе масс-спектрометрии (МС) стала наиболее эффективной стратегией для характеристики клеточного метилпротеома с односайтовым разрешением. Однако идентификация и профилирование R-метилирования белка in vivo при РС остается сложным и подверженным ошибкам, главным образом из-за субстохиометрического характера этой модификации и наличия различных замен аминокислот и химической метилэтерификации кислотных остатков, которые являются изобарическими к метилированию. Таким образом, необходимы методы обогащения для улучшения идентификации R-метилпептидов и ортогональные стратегии валидации для снижения коэффициентов ложного обнаружения (FDR) в исследованиях метилпротеомики.

Здесь описан протокол, специально разработанный для идентификации и количественного определения R-метилпептидов с высокой степенью достоверности из клеточных образцов, который связывает метаболическую маркировку клеток с тяжелым изотоп-кодированным метионином (hmSILAC) и двойным перевариванием протеазы в растворе цельноклеточного экстракта, за которым следует оффлайн-фракционирование хроматографии с высоким рН (HpH-RP) и аффинное обогащение R-метил-пептидов с использованием анти-пан-R-метиловых антител. При анализе MS с высоким разрешением необработанные данные сначала обрабатываются с помощью программного пакета MaxQuant, а затем результаты анализируются hmSEEKER, программным обеспечением, предназначенным для углубленного поиска пиковых пар MS, соответствующих легким и тяжелым метил-пептидам в выходных файлах MaxQuant.

Введение

Аргинин (R)-метилирование представляет собой посттрансляционную модификацию (PTM), которая украшает около 1% протеома млекопитающих1. Белковые аргининметилтрансферазы (PRMT) представляют собой ферменты, катализирующие реакцию R-метилирования путем осаждения одной или двух метильных групп к атомам азота (N) группы гуанидино боковой цепи R симметричным или асимметричным образом. У млекопитающих PRMT могут быть сгруппированы в три класса - тип I, тип II и тип III - в зависимости от их способности депонировать как монометилирование (ММА), так и асимметричное диметилирование (ADMA), ММА и симметричное диметилирование (SDMA) или только ММА, соответственно 2,3. PRMT в основном нацелены на остатки R, расположенные в богатых глицином и аргинином регионах, известных как мотивы GAR, но некоторые PRMT, такие как PRMT5 и CARM1, могут метилировать пролин-глицин-метионин-богатые (PGM) мотивы4. R-метилирование появилось как модулятор белка нескольких биологических процессов, таких как сплайсинг РНК5, репарация ДНК6, биогенез миРНК7 и трансляция2, способствуя исследованиям этого ПТМ.

Масс-спектрометрия (МС) признана наиболее эффективной технологией для систематического изучения глобального R-метилирования при разрешении белка, пептида и сайта. Тем не менее, этот PTM требует некоторых особых мер предосторожности для его высокой достоверности идентификации по РС. Во-первых, R-метилирование является субстохиометрическим, причем немодифицированная форма пептидов гораздо более распространена, чем модифицированные, так что масс-спектрометры, работающие в режиме Data Dependent Acquisition (DDA), будут фрагментировать высокоинтенсивные немодифицированные пептиды чаще, чем их метилированные аналоги с более низкой интенсивностью8. Кроме того, большинство рабочих процессов на основе МС для идентификации R-метилированных участков страдают от ограничений на уровне биоинформационного анализа. Действительно, вычислительная идентификация метилпептидов подвержена высоким показателям ложного открытия (FDR), потому что этот PTM является изобарическим для различных аминокислотных замен (например, глицин в аланин) и химической модификации, такой как метилэтерификация аспартата и глутамата9. Следовательно, методы, основанные на изотопной маркировке метильных групп, такие как Heavy Methyl Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell culture (hmSILAC), были реализованы в качестве ортогональных стратегий для уверенной MS-идентификации метилирования in vivo , значительно снижая частоту ложноположительных аннотаций10.

В последнее время были оптимизированы различные протоколы для изучения R-метилированных белков. Разработка основанных на антителах стратегий иммуноаффинного обогащения R-метилпептидов привела к аннотированию нескольких сотен R-метилированных участков в клетках человека11,12. Кроме того, во многих исследованиях 3,13 сообщалось, что соединение обогащения на основе антител с методами разделения пептидов, такими как фракционирование хроматографии HpH-RP, может увеличить общее количество идентифицированных метилпептидов.

В данной статье описывается экспериментальная стратегия, предназначенная для систематической и высокодостоверной идентификации R-метилированных участков в клетках человека, основанная на различных биохимических и аналитических этапах: экстракция белка из клеток, меченых hmSILAC, параллельное двойное ферментативное пищеварение протеазами трипсина и лисаргиназы с последующим хроматографическим фракционированием HpH-RP переваренных пептидов в сочетании с иммуноаффинным обогащением на основе антител MMA-, SDMA-, и ADMA-содержащие пептиды. Все обогащенные аффинностью пептиды затем анализируются методом жидкостной хроматографии высокого разрешения (LC)-MS/MS в режиме DDA, а необработанные данные MS обрабатываются алгоритмом MaxQuant для идентификации R-метилпептидов. Наконец, выходные результаты MaxQuant обрабатываются с помощью hmSEEKER, собственного инструмента биоинформатики для поиска пар тяжелых и легких метилпептидов. Вкратце, hmSEEKER считывает и фильтрует идентификацию метилпептидов из файла msms, затем сопоставляет каждый метилпептид с соответствующим пиком MS1 в файле allPeptides и, наконец, ищет пик тяжелого/ легкого пептидного аналога. Для каждой предполагаемой пары тяжелых легких вычисляются коэффициент Log2 H/L (LogRatio), разность времени удержания (dRT) и параметры mass error (ME), а дублеты, расположенные в пределах заданных пользователем отсечек, помечаются как истинные положительные значения. Рабочий процесс биохимического протокола описан на рисунке 1.

протокол

1. Культивирование клеток и экстракция белка (требуется время: 3 - 4 недели)

  1. Выращивайте клетки HeLa параллельно в средах, снабженных либо легким (L), либо тяжелым (H) метионином соответственно (см. Таблицу 1 для композиции среды). По крайней мере, после восьми делений клеток соберите аликвоту клеток из каждого канала SILAC и выполните тест на инкорпорацию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы проверить эффективность включения, проверьте с помощью анализа LC-MS / MS, что процент тяжелого метионина (Met-4) в тяжелом канале максимально близок к 100%. Проанализируйте аликвоту тяжело меченых ячеек LC-MS/MS (настройки см. в таблице 2), затем обработайте данные MS с помощью MaxQuant с использованием параметров, указанных в таблице 3. Для проверки включения Met-4 на сайте https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/ доступен собственный сценарий.
  2. Считать тяжелое включение метионина полным, когда оно достигает >97%. Когда каждый канал достигает общего числа около 60 х 106 клеток (соответствующих примерно 40 чашкам по 15 см каждая при 85% слиянии для клеток HeLa, с вариациями в зависимости от типа клетки) собирают их. Тщательно пересчитать, перемешать в пропорции 1:1 и гранулировать центрифугированием при 335 х г в течение 5 мин при 4 °С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы оценить правильное смешивание 1: 1 л / ч, сохраните аликвоту и запустите ее на срезе геля, который, как известно, содержит большое количество и сильно R-метилированный белок (например, фибрилларин). Если маркировка прошла успешно и было достигнуто смешивание 1:1, то в образце должно быть соотношение легких и тяжелых версий R-метилированных пептидов, присутствующих в 1:1. В качестве альтернативы, сохраните аликвоту смешанного образца для анализа LC-MS/MS, затем обработайте данные MS с помощью MaxQuant, используя параметры, указанные в таблице 3 , и постройте график распределения соотношения Log2 H/L, как показано на рисунке 2C. Протокол здесь можно остановить, заморозив гранулу и сохранив ее при -80 °C.
  3. Повторно суспендировать ячейку гранулы в четырех объемах буфера лизиса (см. Таблицу 1 для композиции Lysis Buffer) по отношению к объему гранул ячейки. Например, используйте 6 мл лизисного буфера для гранулы из 120 x 106 клеток Hela (60 x 106 Light + 60 x 106 Heavy), соответствующих объему 1,5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Экстракция белка должна выполняться при комнатной температуре (RT), поскольку буфер лизиса содержит хаотропный агент 9 М мочевины, который выпадает в осадок при температуре льда; Поэтому добавление широкого спектра ингибиторов сериновой и цистеиновой протеазы имеет важное значение, а также ингибиторов фосфатаз, для одновременной защиты белков от протеолитической деградации и дефосфорилирования, коктейль из ингибиторов протеазы и фосфатазы коммерчески доступен в виде небольших таблеток, см. Таблицу 1 и Таблицу материалов.
  4. Обрабатывайте образец ультразвуком с помощью ультраконтактного разрушителя клеток в течение не менее пяти циклов 15 с ON и 30 s OFF, чтобы обеспечить эффективный разрыв клеточных мембран и высвобождение и сдвиг ДНК. Проверьте вязкость экстракта, пипетируя раствор вверх и вниз. Если он слишком вязкий из-за неполной сдвига ДНК и солюбилизации мембраны, повторите циклы обработки ультразвуком.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что образец не перегревается во время обработки ультразвуком, потому что высокая температура может повредить белки. Однако невозможно поместить образец на лед между циклами обработки ультразвуком из-за наличия мочевины 9M; следовательно, желательно сделать паузу на 60 с OFF между различными циклами обработки ультразвуком. Кроме того, избегайте образования пузырьков воздуха во время обработки ультразвуком, потому что они снижают эффективность обработки ультразвуком.
  5. Центрифугируйте экстракт при 3000 х г в течение 10 мин при РТ, чтобы гранулировать мусор и перенести супернатант в новую трубку объемом 15 мл.
  6. Измерьте содержание белка в экстракте с помощью колориметрического анализа, такого как Брэдфорд или бицинхониновая кислота (BCA)14,15. Оптимальное начальное количество белкового экстракта для этого протокола составляет 20-30 мг.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буферы лизиса, содержащие мочевину с высокой концентрацией, совместимы как с количественной оценкой Брэдфорда, так и с анализом количественной оценки BCA; другие типы буфера лизиса, такие как те, которые включают высокую концентрацию додецилсульфата натрия (SDS), не совместимы с Брэдфордом.

2.Переваривание  лизата (ориентировочное время требуется 2 часа)

  1. Выполняют восстановление тиольной группы (-SH) белков с помощью исходного раствора дитиотрейтола (ДТТ), растворенного в сверхчистой воде в конечной концентрации 4,5 мМ, и отпускают реакцию в течение 30 мин при 55 °С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно приготовить 1 млн раствора DTT и хранить его при -20 °C до 1 месяца, размораживая только аликвоты, необходимые для каждого эксперимента. Альтернативно, сульфгидрилредуктант трис-(2-карбоксиэтил)-фосфин (TCEP) может быть использован для выполнения восстановления -SH групп; особенно для длительного хранения белков, TCEP значительно более стабилен, чем DTT без хелатов металлов, таких как EGTA в буфере, тогда как DTT более стабилен, если присутствуют хелаты металлов16.
  2. Выполняют алкилирование тиольной группы (-SH) белков путем добавления йодоацетамида (ИАА) в концентрации 10 мМ и инкубации в течение 15 мин при РТ в темноте. Выполняйте инкубацию экстрагированных белков раствором IAA в темноте, потому что IAA светочувствительна.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Исходный раствор IAA при 100 мМ следует готовить свежим перед каждым экспериментом. Альтернативно, хлорацетамид может быть использован для выполнения алкилирования групп -SH, особенно если целью эксперимента является анализ перекрестных помех между метилированием и убиквитинированием, поскольку артефакт, индуцированный IAA, имитирует убиквитинирование17.
  3. Прежде чем приступить к этапу переваривания белка, сохраните аликвоту белкового экстракта (1/1000 исходного непереваренного лизата) для последующего анализа на геле SDS-PAGE Coomassie и сравнения с соответствующим количеством образца при пищеварении; этот тест служит для проверки эффективности протеолиза (см. пункт 4).
  4. Разбавляют оставшийся белковый экстракт четырьмя объемами 20 мМ HEPES pH 8,0, чтобы достичь конечной концентрации мочевины 2 М (что является концентрацией, совместимой с ферментативной активностью протеаз). Разделите образец на две части: в первой добавляют модифицированный трипсин секвенирования, а во второй добавляют протеазу лисаргиназы (см. Таблицу материалов) в пропорции 1:100 (ш/ж) относительно мг исходного материала. Оставить на ночь при 37 °C в термомиксоре при 600 об/мин, чтобы обеспечить ферментативное сбраживание.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трипсин, наиболее распространенный фермент пищеварения в протеомике, расщепляется на С-конце R и лизина (K), генерируя пептиды с распределением заряда, которое приводит к спектрам фрагментации, в которых доминируют ионы Y-типа при диссоциации, вызванной столкновением (CID). Таким образом, лисаргиназа расщепляется на N-конце R и K, отражая специфичность расщепления трипсина и генерируя пептиды, которые высвобождают в основном ионы b-типа при фрагментации CID. Этот комбинированный анализ приводит к значительному увеличению охвата пептидных последовательностей и повышению уверенности в идентификации R-метилированияR-метилирования 18.

3. Пептидная очистка (ориентировочное время требуется 1 час)

  1. Сохраните аликвоту переваренных пептидов от обеих реакций, собирая те же объемы, что и в пункте 2.3 для сравнения на SDS-PAGE Coomassie-окрашенном гелем для оценки эффективности пищеварения протеазы (см. пункт 4).
  2. Остановить пищеварение путем подкисления образцов добавлением трифторуксусной кислоты (ТФА) до конечной концентрации 5%. Хорошо перемешайте и измерьте pH образцов лакмусовой бумагой (pH должен быть около 3). Вихрь ненадолго и раскрутите подкисленные образцы, прежде чем перенести их в новые 15 мл пробирки.
  3. Очистите образцы через два вакуумных картриджа C18 (масса сорбента 1 г, см. Таблицу материалов), один для образца, переваренного трипсином, а другой для образца, переваренного лисаргиназой. Приготовьте растворитель А, растворитель В и буфер для промывки (см. Таблицу 1 для буферной композиции).
  4. Используя стеклянные пипетки, регидратируйте каждый картридж 6 мл ACN 100% в течение 3 раз. После этого уравновешивайте каждый картридж последовательно 3-9-18 мл растворителя А. Загрузите образцы (смолы должны стать желтыми). Снова последовательно вымойте 3-9-18 мл растворителя А, а затем добавьте 6 мл буфера для стирки. Переложите каждую колонну в чистые пробирки по 15 мл и элюируйте образцы 7 мл растворителя B. Повторите стадию элюирования с 7 мл растворителя B для окончательного объема 14 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все эти шаги, позволив буферам и раствору пройти через колонны под действием силы тяжести. Чтобы облегчить поток буферов через колонну, медленно толкайте каждый раствор шприцем, чтобы имитировать вакуум.
  5. Сохраните 50 мкл элюированных пептидов, 50 мкл проточной (FT), 50 мкл промывки растворителем А и 50 мкл последней промывки для последующей оценки пептидов SDS-PAGE (см. пункт 4).

4. Окрашенный Coomassie гель SDS-PAGE (ориентировочное время требуется 2 часа)

  1. Запустите собранные аликвоты на 17,5% геле SDS-PAGE и окрашивании с окрашиванием Instant-Blu Coomassie (см. Таблицу материалов). Ожидаемый результат представлен на рисунке 2A.

5. Пептидная лиофилизация (ориентировочное время 2 дня)

  1. Накройте пробирки объемом 15 мл, содержащие элюированные пептиды, парафиновой пленкой, которую затем пробивают иглой 20 г для создания 3-5 отверстий. Поместите пробирки в сухой лед не менее чем на 30 минут, пока образцы полностью не замерзнут.
  2. Лиофилизируйте замороженные фракции в течение 48 ч, интервал времени, обычно достаточный для обеспечения полной лиофилизации образцов, даже если может возникнуть некоторая изменчивость, из-за производительности сублимационной сушилки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь эксперимент можно приостановить, сохраняя лиофилизированные образцы при -80 °C.

6. Автономное хроматографическое фракционирование пептидов HpH-RP (индикативное время 4 дня)

  1. Для фракционирования пептидов на 60 фракций используют жидкостную хроматографию HpH-RP, используя систему ВЭЖХ, оснащенную колонкой C12-RP HPLC (250 x 4,6 мм, 4 мкм Proteo 90A).
  2. Перед запуском подготовьте свежие Buffer A и Buffer B (состав Buffers описан в таблице 1).
  3. Процедите весь раствор фильтром 0,22 мкм и дегазируйте их в ванне с ультразвуком в течение не менее 30 мин.
  4. Растворите лиофилизированные пептиды в 1 мл буфера А. Фильтруйте пептиды через фильтр из политетрафторэтилена (PTFE) 0,45 мкм с помощью шприца.
  5. Устанавливают скорость фракционирования при расходе 1 мл/мин и собирают 1 мл фракций, используя следующий хроматографический градиент: от 5% В до 30% В за 60 мин; от 30% В до 60% - через 2 мин; 70% B в течение 3 мин.
  6. Установите ВЭЖХ таким образом, чтобы в этот момент сбор фракций был остановлен, а градиент удерживался на уровне 70% буфера B в течение 5 минут перед обширной промывкой колонны с быстрым градиентом до 100% буфера B с последующей окончательной промывкой (100% buffer B в течение 10 мин).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В конце каждого хроматографического прогона всегда уравновешивайте столбец со 100% буфером A в течение 20 минут.
  7. Фракционировать оба образца, отдельно переваренные трипсином и лисаргиназой, с помощью хроматографических градиентов Off-Line HpH RP, как описано в точке 6.5.
  8. Для каждого хроматографического градиента соберите все фракции в глубокую 96-луночную пластину.
  9. Объедините дроби, собранные перед градиентом, в одну единственную дробь с именем PRE. Объедините 60 фракций из жидкого хроматографического (LC) градиента HpH-RP, объединив их несмежным образом в 14 конечных фракций. Чтобы получить такую несмежную конкатенацию, объедините фракции HpH-RP по следующей схеме.
    1. Фракция 1 (конечный объем 5 мл): Бассейн 1-15-29-43-57
    2. Фракция 2 (конечный объем 5 мл): Бассейн 2-16-30-44-58
    3. Фракция 3 (конечный объем 5 мл): Бассейн 3-17-31-45-59
    4. Фракция 4 (конечный объем 5 мл): Бассейн 4-18-32-46-60
    5. Фракция 5 (конечный объем 4 мл): Бассейн 5-19-33-47
    6. Фракция 6 (конечный объем 4 мл): Бассейн 6-20-34-48
    7. Фракция 7 (конечный объем 4 мл): Бассейн 7-21-35-49
    8. Фракция 8 (конечный объем 4 мл): Бассейн 8-22-36-50
    9. Фракция 9 (конечный объем 4 мл): Бассейн 9-23-37-51
    10. Фракция 10 (конечный объем 4 мл): Бассейн 10-24-38-52
    11. Фракция 11 (конечный объем 4 мл): Бассейн 11-25-39-53
    12. Фракция 12 (конечный объем 4 мл): Бассейн 12-26-40-54
    13. Фракция 13 (конечный объем 4 мл): Бассейн 13-27-41-55
    14. Фракция 14 (конечный объем 4 мл): Бассейн 14-28-42-56
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несмежное конкатенирование заключается в объединении фракций раннего, среднего и позднего элюирования, что позволяет увеличить неоднородность пептидного состава в пределах объединенных фракций. Следовательно, пептидная смесь каждой объединенной фракции эффективно разделяется с ограниченным соэлюированием в последующей нанопоточной низкопоточной хроматографии pH-RP-LC, непосредственно связанной с масс-спектрометром.
  10. Объедините дроби, собранные после градиента, в уникальную дробь с именем POST.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Путем включения фракций градиента PRE и POST получается в общей сложности 16 фракций в пробирках по 15 мл (см. Рисунок 3A).
  11. Накройте трубки объемом 15 мл парафиновой пленкой и пробьете их иглой 20 г, чтобы создать 3-5 отверстий. Заморозьте их, инкубируя трубки центрифуги в сухом льду до тех пор, пока каждая фракция не будет полностью заморожена.
  12. Лиофилизируют фракции в течение примерно 48 ч. Убедитесь, что каждый образец полностью высушен перед остановкой сублимационной сушилки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь эксперимент можно приостановить, сохраняя лиофилизированные образцы при -80 °C.

7. Иммуноаффинное обогащение R-метилированным пептидом (ориентировочное время 2 дня)

  1. Проводят последовательное иммуноаффинное обогащение модифицированного пептида антипан-R-метилирующими антителами параллельно, но отдельно для двух образцов из диверсий Трипсина и ЛисаргиНазы соответственно. Буфер иммуноаффинной очистки (IAP) предоставляется компанией, закупающей антипан-R-метиловые антитела для обогащения модифицированного пептидного сродства (подробности приведены в Table Material and Reagents). Буфер IAP концентрируется 10x и должен быть разбавлен 10 раз перед использованием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер IAP 1x может храниться при температуре от -20 °C до 1 года.
  2. Центрифугируйте лиофилизированные пептиды при 2000 х г в течение 5 мин на RT, чтобы раскрутить пептиды до дна трубки объемом 15 мл. Повторно суспендировать лиофилизированные пептиды с 250 мкл 1x IAP Buffer на 15 мл трубки и переносить в низкосвязанную трубку объемом 1,5 мл. Проверьте с помощью лакмусовой бумаги, составляет ли рН >6.
  3. Держите небольшую аликвоту (около 5% от объема) каждой фракции в качестве входных данных для последующего анализа МС.
  4. Разделите каждую фракцию на две аликвоты, чтобы параллельно выполнить иммунообогащение асимметрично-диметилированными (ADMA) и симметрично-диметилированными (SDMA) пептидами.
  5. Используйте три флакона с выбранными антипан-R-метилированными антителами, конъюгированными с белком А агарозными шариками на 10 мг исходного белкового экстракта.
  6. Подготовьте правильное количество антител, конъюгированных с шариками агарозы, центрифугируя каждый флакон по 2000 х г в течение 30 с и удаляя буфер из шариков. Мойте бусины три раза с 1 мл 1x PBS, всегда центрифугируя их при 2000 x g в течение 30 с.
  7. После последней промывки повторно суспендировать шарики по 40 мкл 1x PBS для каждого флакона; объединить их и окончательно разделить поровну на 16 фракций (так, чтобы к каждой фракции добавлялось 2,5 мкл бусин антител).
  8. Добавьте 250 мкл 1x IAP Buffer в каждую трубку, перемешайте путем инвертирования и дайте ему инкубироваться на вращающемся колесе в течение 2 ч при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смешайте образцы, перевернув трубки объемом 1,5 мл, а не пипетируя их микрокончиками, которые могут повредить шарики или привести к их потере.
  9. После 2-часовой инкубации центрифугируют пробирки объемом 1,5 мл, содержащие пептиды и пан-R-метил-антитело-конъюгированные шарики по 2000 х г в течение 30 с, чтобы гранулировать шарики; переложить FT из каждой фракции в чистые трубки с низким связыванием объемом 1,5 мл.
  10. Добавьте шарики, конъюгированные с антителами против R-монометилирования (ММА) к FT и повторите шаги с 7,7 по 7,9.
  11. Во время инкубации пептидных образцов с MMA-шариками промывайте в два раза фракции, которые ранее были иммуноосаждены анти-ADMA и SDMA с буфером IAP 250 мкл (инвертируя, а не пипетирование), и выбрасывайте супернатант при каждой промывке.
  12. Повторите стирку с ЛК-МС степениН2О трижды.
  13. Элюируют аффинно-обогащенные симметрично и асимметрично R-диметилированные пептиды из шариков агарозы путем добавления 50 мкл 0,15% TFA в каждую трубку (сильные кислотные условия, по сути, денатурируют эпитоп, что приводит к высвобождению антигенов из антител). Оставьте этот раствор на 10 мин при РТ, переворачивая трубки каждые 2-3 мин.
  14. Переложить первое элюирование в чистые низкосвязующие пробирки объемом 1,5 мл и повторить элюирование с 50 мкл 0,15% TFA; объединить 2 фракции в одну трубку.
  15. Повторите шаги с 7.11 по 7.14 для R-монометилированных пептидов, которые инкубировали с анти-ММА антителами-шариками.

8. Обессоливание и концентрация обогащенных аффинностью метилпептидов микроколонками C18 (ориентировочное время требуется 30 минут)

  1. Уравновешивайте метанолом микроколонки C18-RP, изготовленные с помощью 3M твердофазных экстракционных картриджей для обессоливания и концентрации пептидов до анализаMS 19.
  2. Загружают образцы (соответствующие отдельным иммуноаффинным обогащенным фракциям и входным фракциям) на микроколонки C18 в два этапа (50 мкл + 50 мкл на каждую микроколонку C18) путем центрифугирования при 600 х г в течение 6 мин.
  3. Промывайте микроколонки буфером А 55 мкл (см. Таблицу 1 для буферного состава), всегда центрифугированием при температуре около 900 х г в течение 5 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент здесь можно приостановить, оставив микроколонки C18-RP при 4 °C, где они могут храниться до 2 недель.

9. Повторное ферментативное сбраживание (ориентировочное время требуется 3 часа)

  1. Промыть микроколонки C18-RP 55 мкл буфера А (см. Таблицу 1 для буферной композиции) в течение двух раз, центрифугированием при температуре около 850 х г в течение 5 мин.
  2. Элюируют пептиды дважды с 20 мкл буфера В (см. Таблицу 1 для буферного состава) и объединяют две фракции.
  3. Высушите элюированные пептиды в вакуумном концентраторе (подробнее см. Таблицу Материал и реагенты ). Тем временем готовят раствор для пищеварения, состоящий из бикарбоната аммония 50 мМ, который разбавляют из свежеприготовленного 1 М запасного раствора (см. Таблицу 1).
  4. Добавьте трипсин или лисаргиназу к соответствующим образцам до конечной концентрации 25 нг/мкл. Инкубируйте каждый образец при 37 °C в течение 2 ч.
  5. Добавьте 1 мкл 5% TFA для остановки пищеварения; вихрь и вращение вниз образцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ферментативное расщепление трипсином может ингибироваться на С-конце метилированных R и K, вызывая пропущенные расщепления, которые увеличивают длину и заряд пептида, которые, в свою очередь, производят сложные и неполные спектры фрагментации, препятствующие идентификации пептидов и сайт-специфической атрибуции участков метилирования. Было показано, что второе ферментативное сбраживание может снизить частоту таких пропущенных расщеплений с улучшенным охватом последовательностей и атрибуцией сайта20.

10. Обессоливание пептидов (ориентировочное время требуется 30 минут)

  1. Загрузите подкисленные пептидные растворы в новые микроколонки C18-RP, которые были ранее уравновешены, следуя тем же шагам, описанным в пункте 8.
  2. Пептид, загруженный на микроколонки C18-RP, может храниться при 4 °C до элюирования для анализа LC-MS/MS.

11. Анализ жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (LC-MS/MS) (индикативное время 5 дней)

  1. Элюируют пептиды из микроколонок C18-RP, пропуская 10 мкл буфера B, центрифугируя при 615 х г в течение 5 минут при RT. Повторите этот шаг дважды и объедините элюаты.
  2. Уменьшите объем элюатов в вакуумном концентраторе до тех пор, пока они не станут почти сухими, избегая чрезмерного высыхания.
  3. Повторно приостановить пептиды в 10 мкл буфера А для анализа LC-MS/MS.
  4. Анализ каждой фракции R-метилпептидов методом жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (LC-MS/MS) в масс-спектрометре высокого разрешения (см. Таблицу материалов) в сочетании с системой нанопоточной сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии (UHPLC). Задайте параметры прибора, как описано в таблице 2.
  5. Загрузите 2 мкл каждого образца на наноаналитическую колонну (легкая распылительная колонна внутреннего диаметра 75 мкм, длина 25 см), упакованную смолой C18-RP (размер частиц 2 мкм).
  6. Образцы пропускают через наноколонку C18 RP со скоростью потока 300 нЛ/мин, со следующим линейным градиентом: 3%-30% B в течение 89 мин, 30%-60% B в течение 5 мин, 60%-95% B в течение 1 мин и 95% B в течение 5 мин.
  7. Масс-спектрометр работает в режиме data-dependent acquisition (DDA) для автоматического переключения между полным сканированием MS и MS/MS acquisition. Установите обзор полного сканирования МС для анализа в спектрометрическом детекторе с разрешением R = 70 000. Пятнадцать наиболее интенсивных пептидных ионов последовательно выделяются до целевого значения 3 х 106 и фрагментируются относительной энергией столкновения 28%. Установите максимально допустимое время накопления ионов равным 20 мс для полного сканирования и 50 мс для MS/MS и установите целевое значение для MSMS равным 1 x 106. Время динамического исключения установлено равным 20 с.

12. Выполнение анализа данных MaxQuant и hmSEEKER

  1. По завершении запусков LC-MS/MS импортируйте необработанные данные MS в поисковую систему пептидов для идентификации метилпептидов с помощью вероятностного подхода по справочной базе данных. В этом протоколе для нашего анализа использовался MaxQuant версии 1.6.2.10. MaxQuant требует минимум 2 ГБ ОЗУ для запуска, а также достаточно места на диске для хранения всех необработанных данных и всех выходных файлов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к официальной документации по адресу https://www.maxquant.org для получения всех подробностей об установке и требованиях к оборудованию и программному обеспечению.
  2. Дублируйте каждый файл необработанных данных. Переименуйте оригиналы, добавив «_light» к их имени, а затем переименуйте копии, добавив «_heavy».
    ПРИМЕЧАНИЕ: hmSEEKER, скрипт для последующего анализа, чувствителен к регистру.
  3. Запустите поиск MaxQuant/Andromeda для идентификации пептидов с настройками, указанными в таблице 3. Из нескольких выходных данных, полученных MaxQuant, для этапа постобработки требуются только файлы allPeptides.txt и msms.txt (расположенные во вложенной папке combined/txt).
  4. Постобработка выходных данных MaxQuant осуществляется алгоритмом hmSEEKER. Скачать hmSEEKER с: https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/. Скрипт доступен в виде записной книжки Jupyter, написанной на Python 3.7, и поставляется с образцом набора данных для тестирования. Для новых пользователей желательно скачать и установить платформу Anaconda (https://www.anaconda.com/products/individual). Последняя версия включает в себя по умолчанию Python 3.8, Jupyter и все пакеты, необходимые для запуска hmSEEKER (например, Scikit-learn 0.23.1).
  5. Создайте папку и сохраните в ней файлы allPeptides.txt и msms.txt из выходных данных MaxQuant.
  6. Запустите Jupyter (из командной строки или из навигатора Anaconda).
  7. Перейдите в папку hmSEEKER и откройте файл hmSEEKER.ipynb.
  8. В разделе Входные параметры записной книжки укажите пути к базе данных FASTA и к папкам, содержащим текстовые файлы MaxQuant.
  9. Запустите код внутри каждой ячейки, выбрав ячейку и нажав кнопку Play в верхней части интерфейса Jupyter.
  10. Сценарий создает выходной файл с разделителями-запятыми для каждого анализируемого набора данных, а также объединенный файл. Окончательный список дублетов можно найти в файле с именем "[дата]-[время]-combined_hmSILAC_doublets_HxL_summary.csv"
    (Таблица 4 содержит краткое описание столбцов в выходной таблице).

Результаты

В статье описан рабочий процесс для высокодоверной идентификации глобального R-метилирования белка, который основан на сочетании ферментативного переваривания белкового экстракта с двумя различными протеазами параллельно, с последующим фракционированием жидкой хроматографии HpH-RP п...

Обсуждение

Высоконадежная идентификация метилирования белка/пептида in vivo глобальной протеомикой на основе РС является сложной задачей из-за риска высокого FDR, с несколькими аминокислотными замещениями и метилэтерификацией, происходящими во время подготовки образца, которые являются изоба...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

MM и EM являются аспирантами Европейской школы молекулярной медицины (SEMM). EM является получателем 3-летней стипендии FIRC-AIRC (Код проекта: 22506). Глобальные анализы R-метил-протеомов в группе туберкулеза поддерживаются грантом AIRC IG (Код проекта: 21834).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Ammonium Bicarbonate (AMBIC)Sigma-Aldrich09830
Ammonium Persulfate (APS)Sigma-Aldrich497363
C18 Sep-Pak columns vacc 6cc (1g)WatersWAT036905
Colloidal Coomassie staining InstantSigma-AldrichISB1L-1L
cOmplete Mini, EDTA-freeRoche-Sigma Aldrich11836170001Protease Inhibitor
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS)GIBCO ThermoFisher26400-044
DL-Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich3483-12-3
DMEM MediumGIBCO ThermoFisherrequested with stabile glutamine and without methionine
EASY-nano LC 1200 chromatography systemThermoFisher
EASY-Spray HPLC ColumnsThermoFisherES907
GlyceroloSigma-AldrichG5516
HeLa cellsATCCATCC CCL-2
HEPESSigma-AldrichH3375
Iodoacetamide (IAA)Sigma-Aldrich144-48-9
Jupiter C12-RP columnPhenomenex00G-4396-E0
L-MethionineSigma-AldrichM5308Light (L) Methionine
L-Methionine-(methyl-13C,d3)Sigma-Aldrich299154Heavy (H) Methionine
LysargiNaseMerck MilliporeEMS0008
Microtip Cell Disruptor Sonifier 250Branson
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED)Sigma-AldrichT9281
Penicillin-StreptomycinGIBCO ThermoFisher15140122
PhosSTOPRoche-Sigma Aldrich4906837001Phosphatase Inhibitor
Pierce C18 TipsThermoFisher87782
Pierce  0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS GradeThermoFisher85175LC-MS Solvent B
Pierce  0.1% Formic Acid (v/v) in Water, LC-MS GradeThermoFisher85170LC-MS Solvent A
Pierce  Acetonitrile (ACN), LC-MS GradeThermoFisher51101
Pierce  Water, LC-MS GradeThermoFisher51140
PolyacrylamideSigma-Aldrich92560
Precision Plus Protein  All Blue Prestained Protein StandardsBio-Rad1610373
PTMScan antibodies α-ADMACell Signaling Technology13474
PTMScan antibodies α-MMACell Signaling Technology12235
PTMScan antibodies α-SDMACell Signaling Technology13563
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass SpectrometerThermoFisher
Sequencing Grade Modified TrypsinPromegaV5113
Trifluoroacetic acidSigma-AldrichT6508
Ultimate 3000 HPLCDionex
UreaSigma-AldrichU5378
Vacuum Concentrator 5301EppendorfSpeed vac

Ссылки

  1. Bulau, P., et al. Quantitative assessment of arginine methylation in free versus protein-incorporated amino acids in vitro and in vivo using protein hydrolysis and high-performance liquid chromatography. Biotechniques. 40 (3), 305-310 (2006).
  2. Blanc, R. S., Richard, S. Arginine methylation: the coming of age. Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).
  3. Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).
  4. Yang, Y., Bedford, M. T. Protein arginine methyltransferases and cancer. Nature Reviews Cancer. 13 (1), 37-50 (2013).
  5. Bezzi, M., et al. Regulation of constitutive and alternative splicing by PRMT5 reveals a role for Mdm4 pre-mRNA in sensing defects in the spliceosomal machinery. Genes & Development. 27 (17), 1903-1916 (2013).
  6. Auclair, Y., Richard, S. The role of arginine methylation in the DNA damage response. DNA Repair. 12 (7), 459-465 (2013).
  7. Spadotto, V., et al. PRMT1-mediated methylation of the microprocessor-associated proteins regulates microRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. 48 (1), 96-115 (2020).
  8. Musiani, D., Massignani, E., Cuomo, A., Yadav, A., Bonaldi, T. Biochemical and computational approaches for the large-scale analysis of protein arginine methylation by mass spectrometry. Current Protein and Peptide Science. 21 (7), 725-739 (2020).
  9. Ong, S. -. E., Mittler, G., Mann, M. Identifying and quantifying in vivo methylation sites by heavy methyl SILAC. Nature Methods. 1 (2), 119-126 (2004).
  10. Hart-Smith, G., Yagoub, D., Tay, A. P., Pickford, R., Wilkins, M. R. Large scale mass spectrometry-based identifications of enzyme-mediated protein methylation are subject to high false discovery rates. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (3), 989-1006 (2016).
  11. Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).
  12. Larsen, S. C., et al. Proteome-wide analysis of arginine monomethylation reveals widespread occurrence in human cells. Science Signaling. 9 (443), (2016).
  13. Massignani, E., et al. hmSEEKER: Identification of hmSILAC doublets in MaxQuant output data. Proteomics. 19 (5), 1800300 (2019).
  14. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  15. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  16. Getz, E. B., Xiao, M., Chakrabarty, T., Cooke, R., Selvin, P. R. A comparison between the sulfhydryl reductants tris(2-carboxyethyl)phosphine and dithiothreitol for use in protein biochemistry. Analytical Biochemistry. 273 (1), 73-80 (1999).
  17. Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
  18. Huesgen, P. F., et al. LysargiNase mirrors trypsin for protein C-terminal and methylation-site identification. Nature Methods. 12 (1), 55-58 (2015).
  19. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896 (2007).
  20. Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).
  21. Bremang, M., et al. Mass spectrometry-based identification and characterisation of lysine and arginine methylation in the human proteome. Molecular bioSystems. 9 (9), 2231-2247 (2013).
  22. Geoghegan, V., Guo, A., Trudgian, D., Thomas, B., Acuto, O. Comprehensive identification of arginine methylation in primary T cells reveals regulatory roles in cell signalling. Nature Communications. 6 (1), 1-8 (2015).
  23. Tabb, D. L., Huang, Y., Wysocki, V. H., Yates, J. R. Influence of basic residue content on fragment ion peak intensities in low-energy collision-induced dissociation spectra of peptides. Analytical Chemistry. 76 (5), 1243-1248 (2004).
  24. Guthals, A., Bandeira, N. Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (9), 550-557 (2012).
  25. Swaney, D. L., et al. Supplemental activation method for high-efficiency electron-transfer dissociation of doubly protonated peptide precursors. Analytical Chemistry. 79 (2), 477-485 (2007).
  26. Kundinger, S. R., Bishof, I., Dammer, E. B., Duong, D. M., Seyfried, N. T. Middle-down proteomics reveals dense sites of methylation and phosphorylation in arginine-rich RNA-binding proteins. Journal of Proteome Research. 19 (4), 1574-1591 (2020).
  27. Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6176-6186 (2014).
  28. Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Review of Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
  29. Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).
  30. Uhlmann, T., et al. A method for large-scale identification of protein arginine methylation. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (11), 1489-1499 (2012).
  31. Wang, K., et al. Antibody-free approach for the global analysis of protein methylation. Analytical chemistry. 88 (23), 11319-11327 (2016).
  32. Moore, K. E., et al. A general molecular affinity strategy for global detection and proteomic analysis of lysine methylation. Molecular cell. 50 (3), 444-456 (2013).
  33. Wu, Z., et al. A chemical proteomics approach for global analysis of lysine monomethylome profiling. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (2), 329-339 (2015).
  34. Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).
  35. Tay, A. P., Geoghegan, V., Yagoub, D., Wilkins, M. R., Hart-Smith, G. MethylQuant: A Tool for Sensitive Validation of Enzyme-Mediated Protein Methylation Sites from Heavy-Methyl SILAC Data. Journal of Proteome Research. 17 (1), 359-373 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

182RhmSILACHpH RP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены