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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

La proteina arginina (R)-metilazione è una diffusa modificazione post-traduzionale che regola molteplici percorsi biologici. La spettrometria di massa è la migliore tecnologia per profilare globalmente il R-metil-proteoma, quando accoppiata ad approcci biochimici per l'arricchimento peptidico modificato. Il flusso di lavoro progettato per l'identificazione ad alta confidenza della R-metilazione globale nelle cellule umane è descritto qui.

Abstract

La proteina arginina (R)-metilazione è una diffusa modificazione post-traduzionale della proteina (PTM) coinvolta nella regolazione di diverse vie cellulari, tra cui l'elaborazione dell'RNA, la trasduzione del segnale, la risposta al danno del DNA, la biogenesi dei miRNA e la traduzione.

Negli ultimi anni, grazie agli sviluppi biochimici e analitici, la proteomica basata sulla spettrometria di massa (MS) è emersa come la strategia più efficace per caratterizzare il metil-proteoma cellulare con risoluzione a sito singolo. Tuttavia, l'identificazione e la profilazione della R-metilazione della proteina in vivo da parte della SM rimane impegnativa e soggetta a errori, principalmente a causa della natura substechiometrica di questa modifica e della presenza di varie sostituzioni aminoacidiche e metil-esterificazione chimica di residui acidi che sono isobarici alla metilazione. Pertanto, sono necessari metodi di arricchimento per migliorare l'identificazione di R-metil-peptidi e strategie di convalida ortogonale per ridurre i tassi di falsa scoperta (FDR) negli studi di metil-proteomica.

Qui viene descritto un protocollo specificamente progettato per l'identificazione e la quantificazione di R-metil-peptidi ad alta affidabilità da campioni cellulari, che accoppia la marcatura metabolica delle cellule con la metionina codificata da isotopi pesanti (hmSILAC) e la digestione in soluzione a doppia proteasi dell'estratto di cellule intere, seguita dal frazionamento cromatografico off-line ad alto pH a fase invertita (HpH-RP) e dall'arricchimento di affinità di R-metil-peptidi utilizzando anticorpi anti-pan-R-metile. Dopo l'analisi MS ad alta risoluzione, i dati grezzi vengono prima elaborati con il pacchetto software MaxQuant e i risultati vengono quindi analizzati da hmSEEKER, un software progettato per la ricerca approfondita di coppie di picco MS corrispondenti a peptidi metilici leggeri e pesanti all'interno dei file di output MaxQuant.

Introduzione

L'arginina (R)-metilazione è una modificazione post-traduzionale (PTM) che decora circa l'1% del proteoma 1 deimammiferi. Le proteine arginina metiltransferasi (PRMT) sono gli enzimi che catalizzano la reazione di R-metilazione mediante la deposizione di uno o due gruppi metilici agli atomi di azoto (N) del gruppo guanidino della catena laterale di R in modo simmetrico o asimmetrico. Nei mammiferi, i PRMT possono essere raggruppati in tre classi - tipo I, tipo II e tipo III - a seconda della loro capacità di depositare sia la monometilazione (MMA) che la dimetilazione asimmetrica (ADMA), l'MMA e la dimetilazione simmetrica (SDMA) o solo MMA, rispettivamente 2,3. I PRMT colpiscono principalmente i residui di R situati all'interno di regioni ricche di glicina e arginina, noti come motivi GAR, ma alcuni PRMT, come PRMT5 e CARM1, possono metilare motivi ricchi di prolina-glicina-metionina (PGM)4. La R-metilazione è emersa come modulatore proteico di diversi processi biologici, come lo splicing dell'RNA5, la riparazione del DNA6, la biogenesi7 dei miRNA e la traduzione2, promuovendo la ricerca su questo PTM.

La spettrometria di massa (MS) è riconosciuta come la tecnologia più efficace per studiare sistematicamente la R-metilazione globale a risoluzione di proteine, peptidi e siti. Tuttavia, questo PTM richiede alcune precauzioni particolari per la sua identificazione ad alta affidabilità da parte della SM. In primo luogo, la R-metilazione è substechiometrica, con la forma non modificata dei peptidi che è molto più abbondante di quelli modificati, in modo che gli spettrometri di massa che operano in modalità Data Dependent Acquisition (DDA) frammentano peptidi non modificati ad alta intensità più spesso delle loro controparti metilate a bassa intensità8. Inoltre, la maggior parte dei flussi di lavoro basati su MS per l'identificazione del sito R-metilato soffrono di limitazioni a livello di analisi bioinformatica. In effetti, l'identificazione computazionale dei peptidi metilici è soggetta ad alti tassi di falsa scoperta (FDR), perché questo PTM è isobarico a varie sostituzioni aminoacidiche (ad esempio, glicina in alanina) e modificazioni chimiche, come la metil-esterificazione dell'aspartato e del glutammato9. Pertanto, metodi basati sulla marcatura isotopica di gruppi metilici, come l'Heavy Methyl Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell culture (hmSILAC), sono stati implementati come strategie ortogonali per l'identificazione sicura della MS di metilazioni in vivo , riducendo significativamente il tasso di annotazioni false positive10.

Recentemente, sono stati ottimizzati vari protocolli a livello di proteoma per studiare le proteine R-metilate. Lo sviluppo di strategie basate su anticorpi per l'arricchimento di immuno-affinità di R-metil-peptidi ha portato all'annotazione di diverse centinaia di siti R-metilati in cellule umane11,12. Inoltre, molti studi 3,13 hanno riportato che l'accoppiamento dell'arricchimento basato su anticorpi con tecniche di separazione peptidica come il frazionamento cromatografico HpH-RP può aumentare il numero complessivo di peptidi metilici identificati.

Questo articolo descrive una strategia sperimentale progettata per l'identificazione sistematica e ad alta affidabilità di siti R-metilati in cellule umane, basata su varie fasi biochimiche e analitiche: estrazione di proteine da cellule marcate con hmSILAC, digestione enzimatica doppia parallela con proteasi Tripsina e LysargiNase, seguita da frazionamento cromatografico HpH-RP di peptidi digeriti, accoppiato con arricchimento di immuno-affinità basato su anticorpi di MMA-, SDMA-, e peptidi contenenti ADMA. Tutti i peptidi arricchiti di affinità vengono quindi analizzati mediante cromatografia liquida ad alta risoluzione (LC)-MS/MS in modalità DDA e i dati grezzi MS vengono elaborati dall'algoritmo MaxQuant per l'identificazione dei peptidi R-metilici. Infine, i risultati dell'output di MaxQuant vengono elaborati con hmSEEKER, uno strumento bioinformatico sviluppato internamente per cercare coppie di peptidi metilici pesanti e leggeri. In breve, hmSEEKER legge e filtra le identificazioni dei peptidi metilici dal file msms, quindi abbina ciascun peptide metilico al suo picco MS1 corrispondente nel file allPeptides e, infine, cerca il picco della controparte peptidica pesante / leggera. Per ogni coppia putativa pesante-leggera, vengono calcolati i parametri Log2 H/L ratio (LogRatio), Retention Time difference (dRT) e Mass Error (ME) e i doppietti che si trovano all'interno di cut-off definiti dall'utente vengono etichettati come veri positivi. Il flusso di lavoro del protocollo biochimico è descritto nella Figura 1.

Protocollo

1. Coltura cellulare ed estrazione delle proteine (tempo: 3 - 4 settimane richieste)

  1. Coltivare cellule HeLa in parallelo in mezzi forniti rispettivamente con metionina leggera (L) o pesante (H) (vedere Tabella 1 per la composizione del mezzo). Su almeno otto divisioni cellulari, raccogliere un'aliquota di cellule da ciascun canale SILAC ed eseguire il test di incorporazione.
    NOTA: Per verificare l'efficienza di incorporazione, testare mediante analisi LC-MS/MS che la percentuale di metionina pesante (Met-4) nel canale pesante sia il più vicino possibile al 100%. Analizzare un'aliquota di celle marcate pesantemente mediante LC-MS/MS (per le impostazioni vedere Tabella 2), quindi elaborare i dati MS con MaxQuant utilizzando i parametri indicati nella Tabella 3. Per verificare l'incorporazione di Met-4 è disponibile uno script sviluppato internamente su https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/.
  2. Considerare l'incorporazione di metionina pesante come completa quando raggiunge >97%. Quando ogni canale raggiunge un numero totale di circa 60 x 106 cellule (corrispondenti a circa 40 piatti di 15 cm ciascuno all'85% di confluenza per le cellule HeLa, con variazioni a seconda del tipo di cellula) li raccolgono. Contarli attentamente, mescolare in proporzione 1:1 e pellettare per centrifugazione a 335 x g per 5 minuti a 4 °C.
    NOTA: Per valutare la corretta miscelazione 1:1 L/H, tenere un'aliquota e farla scorrere su una fetta di un gel che è noto per contenere un'elevata abbondanza e proteine fortemente R-metilate (ad esempio, fibrillarina). Se l'etichettatura ha avuto successo ed è stata raggiunta una miscelazione 1:1, dovrebbe esserci un rapporto 1:1 di versioni leggere e pesanti dei peptidi R-metilati presenti nel campione. In alternativa, tenere un'aliquota del campione misto da analizzare con LC-MS/MS, quindi elaborare i dati MS con MaxQuant utilizzando i parametri indicati nella Tabella 3 e tracciare la distribuzione del rapporto H/L Log2 come illustrato nella Figura 2C. Il protocollo può essere fermato qui congelando a scatto il pellet e conservandolo a -80 °C.
  3. Risospendere il pellet cellulare in quattro volumi di tampone di lisi (vedere Tabella 1 per la composizione del tampone di lisi) rispetto al volume del pellet cellulare. Ad esempio, utilizzare 6 ml di tampone di lisi per un pellet da 120 x 10 6 celle Hela (60 x 10 6 Light + 60 x 106 Heavy) corrispondenti a 1,5 mL di volume.
    NOTA: L'estrazione delle proteine deve essere eseguita a temperatura ambiente (RT) perché Lysis Buffer contiene l'agente caotropico 9 M Urea che precipita a temperatura del ghiaccio; pertanto, l'aggiunta di un ampio spettro di inibitori della proteasi della serina e della cisteina è importante, così come l'inibitore delle fosfatasi, per proteggere simultaneamente le proteine dalla degradazione proteolitica e dalla defosforilazione, cocktail di inibitori della proteasi e della fosfatasi sono disponibili in commercio come piccole compresse, vedere Tabella 1 e Tabella dei materiali.
  4. Sonicare il campione con un sonicatore distruttore di cellule microtip per almeno cinque cicli di 15 s ON e 30 s OFF, per garantire un'efficiente rottura delle membrane cellulari e il rilascio e il taglio del DNA. Controllare la viscosità dell'estratto pipettando la soluzione su e giù. Se è troppo viscoso a causa del taglio incompleto del DNA e della solubilizzazione della membrana, ripetere i cicli di sonicazione.
    NOTA: Assicurarsi che il campione non si surriscaldi durante la sonicazione, perché le alte temperature possono danneggiare le proteine. Tuttavia, non è possibile mettere il campione su ghiaccio tra i cicli di sonicazione, a causa della presenza di 9M Urea; quindi, è consigliabile mettere in pausa per 60 s OFF tra diversi cicli di sonicazione. Inoltre, evitare la formazione di bolle d'aria durante la sonicazione perché riducono l'efficacia della sonicazione.
  5. Centrifugare l'estratto a 3.000 x g per 10 minuti a RT per pellettare i detriti e trasferire il surnatante in una nuova provetta da 15 ml.
  6. Misurare il contenuto proteico dell'estratto con un test colorimetrico, come Bradford o acido bicinconinico (BCA)14,15. Una quantità iniziale ottimale di estratto proteico per questo protocollo è compresa tra 20-30 mg.
    NOTA: I tamponi di lisi contenenti urea ad alta concentrazione sono compatibili sia con il test di quantificazione Bradford che BCA; altri tipi di tampone di lisi, come quelli che includono un'alta concentrazione di sodio dodecilsolfato (SDS), non sono compatibili con Bradford.

2.Digestione  del lisato (tempo indicativo richiesto 2 ore)

  1. Eseguire la riduzione del gruppo tiolo (-SH) delle proteine utilizzando una soluzione madre di ditiotreitolo (DTT) disciolta in acqua ultrapura ad una concentrazione finale di 4,5 mM e lasciare andare la reazione per 30 minuti a 55 °C.
    NOTA: È possibile preparare una soluzione DTT madre da 1 M e conservarla a -20 °C per un massimo di 1 mese, scongelando solo le aliquote necessarie per ogni esperimento. In alternativa, la tris-(2-carbossietil)-fosfina (TCEP) riducente del sulfidrile (TCEP) può essere utilizzata per eseguire la riduzione dei gruppi -SH; soprattutto per la conservazione a lungo termine delle proteine, la TCEP è significativamente più stabile della DTT senza chelati metallici come EGTA nel tampone, mentre la DTT è più stabile se sono presenti chelati metallici16.
  2. Eseguire l'alchilazione del gruppo tiolo (-SH) delle proteine aggiungendo iodoacetamide (IAA) ad una concentrazione di 10 mM e incubare per 15 minuti a RT al buio. Eseguire l'incubazione delle proteine estratte con la soluzione di IAA al buio perché l'IAA è fotosensibile.
    NOTA: La soluzione madre IAA a 100 mM deve essere preparata fresca prima di ogni esperimento. In alternativa, la cloroacetammide potrebbe essere utilizzata per eseguire l'alchilazione dei gruppi -SH, specialmente se l'obiettivo dell'esperimento è quello di analizzare il cross-talk tra metilazione e ubiquitinazione perché l'artefatto indotto da IAA imita l'ubiquitinazione17.
  3. Prima di procedere con la fase di digestione delle proteine, conservare un'aliquota di estratto proteico (1/1.000 di lisato non digerito iniziale) per la successiva analisi su gel colorato con coomassie SDS-PAGE e il confronto con una quantità corrispondente di campione durante la digestione; Questo test serve a verificare l'efficienza della proteolisi (vedi punto 4).
  4. Diluire l'estratto proteico rimanente con quattro volumi di 20 mM HEPES pH 8,0, per raggiungere una concentrazione finale di urea di 2 M (che è la concentrazione compatibile con l'attività enzimatica delle proteasi). Dividere il campione in due parti: nella prima aggiungere Tripsina modificata di grado sequenziale e nella seconda aggiungere la proteasi LysargiNase (vedi Tabella dei materiali) in proporzione 1:100 (p/p) rispetto ai mg del materiale di partenza. Lasciare per una notte a 37 °C in termomiscelatore a 600 giri/min, per consentire la digestione enzimatica.
    NOTA: La tripsina, l'enzima di digestione più comune in proteomica, si scinde al C-terminale di R e lisina (K), generando peptidi con una distribuzione di carica che si traduce in spettri di frammentazione dominati da ioni di tipo y dopo dissociazione indotta da collisione (CID). LysargiNase si scinde al N-terminale di R e K, rispecchiando quindi la specificità della scissione della tripsina e generando peptidi che rilasciano principalmente ioni di tipo b dopo la frammentazione del CID. Questa analisi combinata porta ad una maggiore copertura della sequenza peptidica e ad una maggiore fiducia nell'identificazione sito-specifica delle R-metilazioni18.

3. Purificazione dei peptidi (tempo indicativo richiesto 1 ora)

  1. Conservare un'aliquota di peptidi digeriti da entrambe le reazioni, raccogliendo gli stessi volumi di cui al punto 2.3 per il confronto su SDS-PAGE Gel colorato con Coomassie per valutare l'efficienza della digestione della proteasi (vedi punto 4).
  2. Arrestare la digestione acidificando i campioni con l'aggiunta di acido trifluoroacetico (TFA) ad una concentrazione finale del 5%. Mescolare bene e misurare il pH dei campioni con una cartina tornasole (il pH dovrebbe essere intorno a 3). Vortice brevemente e ruotare i campioni acidificati prima di trasferirli in nuove provette da 15 ml.
  3. Pulire i campioni attraverso due cartucce C18 vac (peso assorbente 1 g, vedere Tabella dei materiali), una per il campione digerito con Trypsin e l'altra per il campione digerito con LysargiNase. Preparare il solvente A, il solvente B e il tampone di lavaggio (vedere la Tabella 1 per la composizione del tampone).
  4. Utilizzando pipette di vetro, reidratare ogni cartuccia con 6 ml di ACN al 100% per 3 volte. Successivamente, equilibrare ogni cartuccia in sequenza con 3-9-18 ml di solvente A. Caricare i campioni (le resine dovrebbero diventare gialle). Lavare nuovamente in sequenza con 3-9-18 ml di solvente A e quindi aggiungere 6 ml di tampone di lavaggio. Trasferire ciascuna colonna in provette pulite da 15 mL ed eluire i campioni con 7 mL di solvente B. Ripetere la fase di eluizione con 7 mL di solvente B, per un volume finale di 14 mL.
    Nota : eseguire tutti questi passaggi lasciando che i buffer e la soluzione passino attraverso le colonne per gravità. Per favorire il flusso dei tamponi attraverso la colonna, spingere lentamente ogni soluzione con una siringa, per imitare il vuoto.
  5. Risparmiare 50 μL di peptidi eluiti, 50 μL di flow-through (FT), 50 μL di lavaggio con solvente A e 50 μL dell'ultimo lavaggio per la successiva valutazione peptidica mediante SDS-PAGE (vedere punto 4).

4. Gel SDS-PAGE colorato con Coomassie (tempo indicativo richiesto 2 ore)

  1. Eseguire le aliquote raccolte su un gel SDS-PAGE al 17,5% e colorare con la colorazione Instant-Blu Coomassie (vedi Tabella dei materiali). Il risultato atteso è rappresentato nella Figura 2A.

5. Liofilizzazione peptidica (tempo indicativo 2 giorni)

  1. Coprire i tubi da 15 mL contenenti i peptidi eluiti con pellicola di paraffina, che viene poi perforata con un ago da 20 G per creare 3-5 fori. Mettere i tubi in ghiaccio secco per almeno 30 minuti, fino a quando i campioni sono completamente congelati.
  2. Liofilizzare le frazioni congelate per 48 h, un intervallo di tempo tipicamente sufficiente a garantire una liofilizzazione completa dei campioni, anche se può verificarsi una certa variabilità, dovuta alle prestazioni del liofilizzatore.
    NOTA: L'esperimento può essere messo in pausa qui, conservando i campioni liofilizzati a -80 °C.

6. Frazionamento cromatografico HPH-RP off-line di peptidi (tempo indicativo 4 giorni)

  1. Per frazionare i peptidi in 60 frazioni, utilizzare la cromatografia liquida HpH-RP, utilizzando il sistema HPLC dotato di colonna HPLC C12-RP (250 x 4,6 mm, 4 μm Proteo 90A).
  2. Prima dell'esecuzione, preparare nuovi buffer A e buffer B (la composizione dei buffer è descritta nella tabella 1).
  3. Filtrare tutte le soluzioni con un filtro da 0,22 μm e degasarle in un bagno sonicatore per almeno 30 minuti.
  4. Sciogliere i peptidi liofilizzati in 1 mL di tampone A. Filtrare i peptidi attraverso un filtro in politetrafluoroetilene (PTFE) da 0,45 μm, utilizzando una siringa.
  5. Impostare la velocità di frazionamento a 1 mL/min di flusso e raccogliere 1 mL di frazioni, utilizzando il seguente gradiente cromatografico: da 5% B a 30% B in 60 min; 30% B a 60% in 2 min; 70% B per 3 min.
  6. Impostare l'HPLC in modo che, a questo punto, la raccolta delle frazioni venga interrotta e la pendenza mantenuta al 70% del buffer B per 5 minuti prima di un lavaggio esteso della colonna con un gradiente rapido fino al 100% del buffer B, seguito da un lavaggio finale (buffer B al 100% per 10 minuti).
    NOTA: Alla fine di ogni ciclo cromatografico, equilibrare sempre la colonna con il buffer A al 100% per 20 minuti.
  7. Frazionare entrambi i campioni digeriti separatamente con tripsina e LysargiNase mediante gradienti cromatografici Off-Line HpH RP, come descritto al punto 6.5.
  8. Per ogni gradiente cromatografico, raccogliere tutte le frazioni in una piastra profonda da 96 pozzetti.
  9. Raggruppare le frazioni raccolte prima del gradiente in un'unica frazione denominata PRE. Concatenare le 60 frazioni del gradiente cromatografico liquido (LC) HpH-RP raggruppandole in modo non contiguo in 14 frazioni finali. Per ottenere tale concatenazione non contigua, raggruppare le frazioni HpH-RP secondo il seguente schema.
    1. Frazione 1 (volume finale 5 ml): Pool 1-15-29-43-57
    2. Frazione 2 (volume finale 5 ml): Pool 2-16-30-44-58
    3. Frazione 3 (volume finale 5 ml): Pool 3-17-31-45-59
    4. Frazione 4 (volume finale 5 ml): Pool 4-18-32-46-60
    5. Frazione 5 (volume finale 4 ml): Pool 5-19-33-47
    6. Frazione 6 (volume finale 4 ml): Pool 6-20-34-48
    7. Frazione 7 (volume finale 4 ml): Pool 7-21-35-49
    8. Frazione 8 (volume finale 4 ml): Pool 8-22-36-50
    9. Frazione 9 (volume finale 4 ml): Pool 9-23-37-51
    10. Frazione 10 (volume finale 4 ml): Pool 10-24-38-52
    11. Frazione 11 (volume finale 4 ml): Pool 11-25-39-53
    12. Frazione 12 (volume finale 4 ml): Pool 12-26-40-54
    13. Frazione 13 (volume finale 4 ml): Pool 13-27-41-55
    14. Frazione 14 (volume finale 4 ml): Pool 14-28-42-56
      NOTA: La concatenazione non contigua consiste nel combinare frazioni a rilascio precoce, medio e tardivo, il che consente di aumentare l'eterogeneità nella composizione peptidica all'interno delle frazioni raggruppate. Di conseguenza, la miscela peptidica di ciascuna frazione aggregata viene efficacemente separata, con una co-eluizione limitata, nella successiva cromatografia a basso flusso nanometrico a basso PH-RP-LC direttamente accoppiata allo spettrometro di massa.
  10. Raggruppare le frazioni raccolte dopo il gradiente in una frazione univoca, denominata POST.
    NOTA: Includendo le frazioni PRE e POST gradiente, si ottiene un totale di 16 frazioni, in provette da 15 mL (vedi Figura 3A).
  11. Coprire i tubi da 15 mL con pellicola di paraffina e perforarli con un ago da 20 G per generare 3-5 fori. Congelarli incubando le provette da centrifuga in ghiaccio secco fino a quando ogni frazione è completamente congelata.
  12. Liofilizzare le frazioni per circa 48 h. Assicurarsi che ogni campione sia completamente asciutto prima di fermare il liofilizzatore.
    NOTA: L'esperimento può essere messo in pausa qui, conservando i campioni liofilizzati a -80 °C.

7. Arricchimento di immuno-affinità peptidica R-metilata (tempo indicativo 2 giorni)

  1. Eseguire l'arricchimento sequenziale di immuno-affinità del peptide modificato con anticorpi anti-pan-R-metilazione in parallelo, ma separatamente per i due campioni dalle digestioni Tripsina e LysargiNase, rispettivamente. Il tampone di purificazione dell'immunoaffinità (IAP) è fornito dalla società che acquista gli anticorpi anti-pan-R-metile per l'arricchimento dell'affinità peptidica modificata (i dettagli sono in Tabella Materiale e Reagenti). Il tampone IAP è concentrato 10x e deve essere diluito 10 volte prima dell'uso.
    NOTA: il buffer IAP 1x può essere conservato a temperature comprese tra -20 °C e un massimo di 1 anno.
  2. Centrifugare i peptidi liofilizzati a 2.000 x g per 5 minuti a RT per far girare i peptidi sul fondo del tubo da 15 ml. Risospendere i peptidi liofilizzati con 250 μL di 1x tampone IAP per tubo da 15 mL e trasferirli in una provetta a basso legame da 1,5 ml. Controllare con una cartina tornasole se il pH è >6.
  3. Conservare una piccola aliquota (circa il 5% del volume) di ciascuna frazione come input per la successiva analisi della SM.
  4. Dividere ogni frazione in due aliquote, al fine di eseguire l'immuno-arricchimento di peptidi asimmetricamente dimetilati (ADMA) e simmetricamente di-metilati (SDMA) in parallelo.
  5. Utilizzare tre flaconcini degli anticorpi anti-pan-R-metilati selezionati coniugati a perle di agarosio di proteina A per 10 mg dell'estratto proteico iniziale.
  6. Preparare la giusta quantità di anticorpi coniugati alle perle di agarosio centrifugando ogni flaconcino a 2.000 x g per 30 s e rimuovendo il tampone dalle perle. Lavare le perle tre volte con 1 mL di 1x PBS sempre centrifugandole a 2.000 x g per 30 s.
  7. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le perle in 40 μL 1x PBS per ciascun flaconcino; raggrupparli e infine dividerli equamente in 16 frazioni (in modo che 2,5 μL di perline anticorpali vengano aggiunti a ciascuna frazione).
  8. Aggiungere 250 μL di 1x tampone IAP a ciascun tubo, mescolare capovolgendo e lasciarlo incubare su una ruota rotante per 2 ore a 4 °C.
    NOTA: Mescolare i campioni invertendo i tubi da 1,5 mL anziché pipettandoli con micropunte, che potrebbero danneggiare le perline o causarne la perdita.
  9. Dopo 2 ore di incubazione, centrifugare i tubi da 1,5 ml contenenti peptidi e perle coniugate con anticorpi pan-R metile a 2.000 x g per 30 s per pellettare le perle; trasferire l'FT da ciascuna frazione in tubi puliti da 1,5 mL a basso legame.
  10. Aggiungere le perle coniugate agli anticorpi contro la R-monometilazione (MMA) agli FT e ripetere i passaggi da 7,7 a 7,9.
  11. Durante l'incubazione dei campioni peptidici con le perle di MMA, lavare il doppio delle frazioni precedentemente immunoprecipitate con anti-ADMA e SDMA con 250 μL di tampone IAP (invertendo e non pipettando) e scartare il surnatante ad ogni lavaggio.
  12. Ripetere il lavaggio con LC-MS grado H2O tre volte.
  13. Eluire i peptidi R-di-metilati arricchiti di affinità simmetricamente e asimmetricamente dalle perle di agarosio aggiungendo 50 μL di TFA allo 0,15% a ciascuna provetta (forti condizioni acide, infatti, denaturano l'epitopo portando al rilascio degli antigeni dagli anticorpi). Lasciare questa soluzione 10 minuti a RT, invertendo i tubi ogni 2-3 minuti.
  14. Trasferire la prima eluizione in provette pulite da 1,5 mL a basso legame e ripetere l'eluizione con 50 μL 0,15% TFA; Raggruppa le 2 frazioni in un tubo.
  15. Ripetere i passaggi da 7.11 a 7.14 per i peptidi R-mono-metilati che sono stati incubati con le perle anticorpali anti-MMA.

8. Dissalazione e concentrazione di metilpeptidi arricchiti di affinità mediante microcolonne C18 (tempo indicativo richiesto 30 minuti)

  1. Equilibrare con metanolo le microcolonne C18-RP realizzate con cartucce di estrazione 3M in fase solida per la desalinizzazione e la concentrazione dei peptidi prima dell'analisi MS19.
  2. Caricare i campioni (corrispondenti alle frazioni arricchite di immunoaffinità separate e alle frazioni in ingresso) sulle microcolonne C18 in due fasi (50 μL + 50 μL su ciascuna microcolonna C18) centrifugando a 600 x g per 6 minuti.
  3. Lavare le microcolonne con 55 μL di tampone A (vedere Tabella 1 per la composizione del tampone), sempre mediante centrifugazione a circa 900 x g per 5 minuti.
    NOTA: L'esperimento può essere messo in pausa qui, lasciando le microcolonne C18-RP a 4 °C, dove possono essere conservate fino a 2 settimane.

9. Seconda digestione enzimatica (tempo indicativo richiesto 3 ore)

  1. Lavare le microcolonne C18-RP con 55 μL di tampone A (vedere Tabella 1 per la composizione del tampone) per due volte, mediante centrifugazione a circa 850 x g per 5 minuti.
  2. Eluire i peptidi due volte con 20 μL di tampone B (vedere Tabella 1 per la composizione del tampone) e raggruppare le due frazioni.
  3. Asciugare i peptidi eluiti in un concentratore sottovuoto (vedere Tabella Materiale e reagenti per i dettagli). Nel frattempo, preparare la soluzione di digestione costituita da 50 mM di bicarbonato di ammonio diluito da una soluzione madre 1 M appena fatta (vedere Tabella 1).
  4. Aggiungere tripsina o LysargiNase ai rispettivi campioni, fino ad una concentrazione finale di 25 ng/μL. Incubare ciascun campione a 37 °C per 2 ore.
  5. Aggiungere 1 μL di TFA al 5% per fermare la digestione; vortice e spin giù i campioni.
    NOTA: La scissione enzimatica da parte della tripsina può essere inibita al C-terminale di R e K metilati, causando scissioni mancate che aumentano la lunghezza e la carica del peptide, che a loro volta producono spettri di frammentazione complessi e incompleti che ostacolano l'identificazione del peptide e l'attribuzione sito-specifica dei siti di metilazione. È stato dimostrato che una seconda digestione enzimatica può ridurre la frequenza di tali scissioni mancate, con una migliore copertura della sequenza e l'attribuzione del sito20.

10. Dissalazione dei peptidi (tempo indicativo richiesto 30 minuti)

  1. Caricare le soluzioni peptidiche acidificate su nuove microcolonne C18-RP che sono state precedentemente equilibrate seguendo gli stessi passaggi descritti al punto 8.
  2. Il peptide caricato sulle microcolonne C18-RP può essere conservato a 4 °C fino all'eluizione per l'analisi LC-MS/MS.

11. Analisi cromatografia-spettrometria di massa tandem liquida (LC-MS/MS) (tempo indicativo 5 giorni)

  1. Eluire i peptidi dalle microcolonne C18-RP passando 10μL di tampone B, centrifugando a 615 x g per 5 minuti a RT. Ripetere questo passaggio due volte e combinare gli eluati.
  2. Ridurre il volume degli eluati in un concentratore sottovuoto fino a quando non sono quasi asciutti, evitando un'essiccazione eccessiva.
  3. Risospendere i peptidi in 10 μL di tampone A per l'analisi LC-MS/MS.
  4. Analizzare ogni frazione di R-metil-peptidi mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) in uno spettrometro di massa ad alta risoluzione (vedi Tabella dei materiali), accoppiato a un sistema di cromatografia liquida ad altissime prestazioni (UHPLC) a nano-flusso. Impostare i parametri dello strumento come descritto nella Tabella 2.
  5. Caricare 2 μL di ciascun campione su una colonna nanoanalitica (colonna a spruzzo facile diametro interno 75 μm, lunghezza 25 cm), confezionata con resina C18-RP (granulometria 2 μm).
  6. I campioni vengono fatti passare attraverso la nano-colonna C18 RP ad una portata di 300 nL/min, con il seguente gradiente lineare: 3%-30% B per 89 min, 30%-60% B per 5 min, 60%-95% B per 1 min e 95% B per 5 min.
  7. Lo spettrometro di massa opera in modalità di acquisizione dipendente dai dati (DDA) per passare automaticamente dall'acquisizione MS a scansione completa all'acquisizione MS/MS. Impostare la scansione completa MS del rilevamento da analizzare nel rivelatore dello spettrometro con risoluzione R = 70.000. I quindici ioni peptide più intensi sono isolati sequenzialmente ad un valore target di 3 x 106 e frammentati da un'energia di collisione relativa del 28%. Impostare i tempi massimi di accumulo di ioni consentiti su 20 ms per scansioni complete e 50 ms per MS/MS e fissare il valore target per MSMS su 1 x 106. Il tempo di esclusione dinamica è impostato su 20 s.

12. Esecuzione dell'analisi dei dati MaxQuant e hmSEEKER

  1. Al termine delle esecuzioni LC-MS/MS, importare i dati grezzi MS in un motore di ricerca peptidico per identificare i peptidi metilici con un approccio basato sulla probabilità rispetto al database di riferimento. In questo protocollo, MaxQuant versione 1.6.2.10 è stato utilizzato per la nostra analisi. MaxQuant richiede un minimo di 2 GB di RAM per funzionare, nonché spazio su disco sufficiente per memorizzare tutti i dati grezzi e tutti i file di output.
    NOTA: Fare riferimento alla documentazione ufficiale di https://www.maxquant.org per tutti i dettagli sull'installazione e sui requisiti hardware e software.
  2. Duplicare ogni file di dati non elaborati. Rinominare gli originali aggiungendo "_light" al loro nome, quindi rinominare le copie aggiungendo "_heavy".
    NOTA: hmSEEKER, lo script per l'analisi a valle, fa distinzione tra maiuscole e minuscole.
  3. Avviare la ricerca MaxQuant/Andromeda per l'identificazione del peptide con le impostazioni indicate nella Tabella 3. Dei numerosi dati di output prodotti da MaxQuant, solo i file allPeptides.txt e msms.txt (che si trovano nella sottocartella combined/txt) sono necessari per la fase di post-elaborazione.
  4. La post-elaborazione dei dati di output MaxQuant viene eseguita dall'algoritmo hmSEEKER. Scarica hmSEEKER da: https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/. Lo script è disponibile come notebook Jupyter scritto in Python 3.7 e viene fornito con un set di dati di esempio a scopo di test. Per i nuovi utenti, è consigliabile scaricare e installare la piattaforma Anaconda (https://www.anaconda.com/products/individual). L'ultima versione include di default Python 3.8, Jupyter e tutti i pacchetti necessari per eseguire hmSEEKER (ad esempio, Scikit-learn 0.23.1).
  5. Creare una cartella e memorizzare i file allPeptides.txt e msms.txt dall'output MaxQuant in essa.
  6. Avvia Jupyter (dalla riga di comando o dal navigatore Anaconda).
  7. Passare alla cartella hmSEEKER e aprire hmSEEKER.ipynb.
  8. Nella sezione Parametri di input del blocco appunti, indicare i percorsi del database FASTA e delle cartelle contenenti i file di testo MaxQuant.
  9. Esegui il codice all'interno di ogni cella selezionando la cella e facendo clic sul pulsante Riproduci nella parte superiore dell'interfaccia Jupyter.
  10. Lo script produce un file di output separato da virgole per ogni set di dati analizzato, oltre a un file combinato. L'elenco finale dei doppietti può essere trovato nel file denominato "[date]-[time]-combined_hmSILAC_doublets_HxL_summary.csv"
    (La tabella 4 include una breve descrizione delle colonne nella tabella di output).

Risultati

L'articolo descrive un flusso di lavoro per l'identificazione ad alta affidabilità della R-metilazione globale della proteina, che si basa sulla combinazione della digestione enzimatica dell'estratto proteico con due proteasi distinte in parallelo, seguita dal frazionamento della cromatografia liquida HpH-RP di peptidi proteolitici e dall'arricchimento di immuno-affinità di peptidi R-metilici con anticorpi anti-pan-R-metile (Figura 1).

Le cellule sono state colt...

Discussione

L'identificazione ad alta confidenza della metilazione in vivo di proteine/peptidi mediante proteomica globale basata sulla SM è impegnativa, a causa del rischio di FDR elevato, con diverse sostituzioni di aminoacidi e metil-esterificazione che si verificano durante la preparazione del campione che sono isobariche alla metilazione e possono causare assegnazioni errate in assenza di strategie di convalida ortogonali della SM. La natura substechiometrica di questo PTM complica ulteriormente il compito della metil...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

MM ed EM sono studenti di dottorato all'interno della Scuola Europea di Medicina Molecolare (SEMM). EM è il destinatario di una borsa di studio FIRC-AIRC di 3 anni (Codice progetto: 22506). Le analisi globali di R-metil-proteomi nel gruppo TB sono supportate dall'AIRC IG Grant (Codice progetto: 21834).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Ammonium Bicarbonate (AMBIC)Sigma-Aldrich09830
Ammonium Persulfate (APS)Sigma-Aldrich497363
C18 Sep-Pak columns vacc 6cc (1g)WatersWAT036905
Colloidal Coomassie staining InstantSigma-AldrichISB1L-1L
cOmplete Mini, EDTA-freeRoche-Sigma Aldrich11836170001Protease Inhibitor
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS)GIBCO ThermoFisher26400-044
DL-Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich3483-12-3
DMEM MediumGIBCO ThermoFisherrequested with stabile glutamine and without methionine
EASY-nano LC 1200 chromatography systemThermoFisher
EASY-Spray HPLC ColumnsThermoFisherES907
GlyceroloSigma-AldrichG5516
HeLa cellsATCCATCC CCL-2
HEPESSigma-AldrichH3375
Iodoacetamide (IAA)Sigma-Aldrich144-48-9
Jupiter C12-RP columnPhenomenex00G-4396-E0
L-MethionineSigma-AldrichM5308Light (L) Methionine
L-Methionine-(methyl-13C,d3)Sigma-Aldrich299154Heavy (H) Methionine
LysargiNaseMerck MilliporeEMS0008
Microtip Cell Disruptor Sonifier 250Branson
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED)Sigma-AldrichT9281
Penicillin-StreptomycinGIBCO ThermoFisher15140122
PhosSTOPRoche-Sigma Aldrich4906837001Phosphatase Inhibitor
Pierce C18 TipsThermoFisher87782
Pierce  0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS GradeThermoFisher85175LC-MS Solvent B
Pierce  0.1% Formic Acid (v/v) in Water, LC-MS GradeThermoFisher85170LC-MS Solvent A
Pierce  Acetonitrile (ACN), LC-MS GradeThermoFisher51101
Pierce  Water, LC-MS GradeThermoFisher51140
PolyacrylamideSigma-Aldrich92560
Precision Plus Protein  All Blue Prestained Protein StandardsBio-Rad1610373
PTMScan antibodies α-ADMACell Signaling Technology13474
PTMScan antibodies α-MMACell Signaling Technology12235
PTMScan antibodies α-SDMACell Signaling Technology13563
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass SpectrometerThermoFisher
Sequencing Grade Modified TrypsinPromegaV5113
Trifluoroacetic acidSigma-AldrichT6508
Ultimate 3000 HPLCDionex
UreaSigma-AldrichU5378
Vacuum Concentrator 5301EppendorfSpeed vac

Riferimenti

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