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Résumé

La méthylation de l’arginine (R) est une modification post-traductionnelle généralisée régulant de multiples voies biologiques. La spectrométrie de masse est la meilleure technologie pour établir le profil global du R-méthyl-protéome, lorsqu’elle est couplée à des approches biochimiques pour l’enrichissement peptidique modifié. Le flux de travail conçu pour l’identification à haut niveau de confiance de la R-méthylation globale dans les cellules humaines est décrit ici.

Résumé

La protéine arginine (R)-méthylation est une protéine répandue de modification post-traductionnelle (PTM) impliquée dans la régulation de plusieurs voies cellulaires, y compris le traitement de l’ARN, la transduction du signal, la réponse aux dommages de l’ADN, la biogenèse des miARN et la traduction.

Ces dernières années, grâce aux développements biochimiques et analytiques, la protéomique basée sur la spectrométrie de masse (SM) est apparue comme la stratégie la plus efficace pour caractériser le méthyl-protéome cellulaire avec une résolution sur un seul site. Cependant, l’identification et le profilage in vivo de la R-méthylation des protéines par la SEP restent difficiles et sujets aux erreurs, principalement en raison de la nature substœchiométrique de cette modification et de la présence de diverses substitutions d’acides aminés et de méthyl-estérification chimique de résidus acides isobares à la méthylation. Par conséquent, des méthodes d’enrichissement pour améliorer l’identification des peptides R-méthyl et des stratégies de validation orthogonale pour réduire les taux de fausses découvertes (FDR) dans les études méthyl-protéomiques sont nécessaires.

Ici, un protocole spécialement conçu pour l’identification et la quantification de peptides R-méthyl à haute confiance à partir d’échantillons cellulaires est décrit, qui couple le marquage métabolique des cellules avec de la méthionine codée par les isotopes lourds (hmSILAC) et la digestion en solution de protéase double de l’extrait de cellules entières, suivie d’un fractionnement par chromatographie à pH élevé en phase inversée (HpH-RP) hors ligne et d’un enrichissement d’affinité des peptides R-méthyl à l’aide d’anticorps anti-pan-R-méthyl. Lors de l’analyse MS haute résolution, les données brutes sont d’abord traitées avec le progiciel MaxQuant et les résultats sont ensuite analysés par hmSEEKER, un logiciel conçu pour la recherche approfondie de paires de pics MS correspondant à des méthylpeptides légers et lourds dans les fichiers de sortie MaxQuant.

Introduction

L’arginine (R)-méthylation est une modification post-traductionnelle (PTM) qui décore environ 1% du protéome des mammifères1. Les protéines arginines méthyltransférases (PRMT) sont les enzymes catalysant la réaction de R-méthylation par dépôt d’un ou deux groupes méthyle sur les atomes d’azote (N) du groupe guanidino de la chaîne latérale de R de manière symétrique ou asymétrique. Chez les mammifères, les PRMT peuvent être regroupés en trois classes - type I, type II et type III - en fonction de leur capacité à déposer à la fois la monométhylation (MMA) et la diméthylation asymétrique (ADMA), le MMA et la diméthylation symétrique (SDMA) ou seulement le MMA, respectivement 2,3. Les PRMT ciblent principalement les résidus R situés dans les régions riches en glycine et en arginine, connus sous le nom de motifs GAR, mais certains PRMT, tels que PRMT5 et CARM1, peuvent méthyler des motifs riches en proline-glycine-méthionine (PGM)4. La R-méthylation a émergé comme un modulateur protéique de plusieurs processus biologiques, tels que l’épissage de l’ARN5, la réparation de l’ADN6, la biogenèse miARN7 et la traduction2, favorisant la recherche sur ce PTM.

La spectrométrie de masse (SM) est reconnue comme la technologie la plus efficace pour étudier systématiquement la R-méthylation globale à la résolution des protéines, des peptides et des sites. Cependant, ce PTM nécessite certaines précautions particulières pour son identification à haut niveau de confiance par la SEP. Tout d’abord, la R-méthylation est substœchiométrique, la forme non modifiée des peptides étant beaucoup plus abondante que les peptides modifiés, de sorte que les spectromètres de masse fonctionnant en mode d’acquisition dépendante des données (DDA) fragmenteront les peptides non modifiés de haute intensité plus souvent que leurs homologues méthylés de plus faible intensité8. De plus, la plupart des flux de travail basés sur MS pour l’identification de sites R-méthylés souffrent de limitations au niveau de l’analyse bioinformatique. En effet, l’identification informatique des peptides méthyliques est sujette à des taux élevés de fausses découvertes (FDR), car ce PTM est isobare à diverses substitutions d’acides aminés (par exemple, la glycine en alanine) et à des modifications chimiques, telles que la méthyl-estérification de l’aspartate et du glutamate9. Par conséquent, des méthodes basées sur le marquage isotopique des groupes méthyle, telles que le marquage isotopique stable des méthyles lourds avec des acides aminés en culture cellulaire (hmSILAC), ont été mises en œuvre en tant que stratégies orthogonales pour l’identification sûre des méthylations in vivo par la SM, réduisant considérablement le taux d’annotations faussement positives10.

Récemment, divers protocoles à l’échelle du protéome pour étudier les protéines R-méthylées ont été optimisés. Le développement de stratégies basées sur les anticorps pour l’enrichissement immuno-affinité des peptides R-méthyl a conduit à l’annotation de plusieurs centaines de sites R-méthylés dans des cellules humaines11,12. En outre, de nombreuses études 3,13 ont rapporté que le couplage de l’enrichissement à base d’anticorps avec des techniques de séparation peptidique telles que le fractionnement par chromatographie HpH-RP peut augmenter le nombre total de méthylpeptides identifiés.

Cet article décrit une stratégie expérimentale conçue pour l’identification systématique et à haut niveau de confiance des sites R-méthylés dans les cellules humaines, basée sur diverses étapes biochimiques et analytiques: extraction de protéines à partir de cellules marquées hmSILAC, digestion enzymatique double parallèle avec des protéases de trypsine et de lysarginase, suivie d’un fractionnement chromatographique HpH-RP de peptides digérés, couplé à un enrichissement immuno-affinité à base d’anticorps de MMA-, SDMA-, et les peptides contenant de l’ADMA. Tous les peptides enrichis par affinité sont ensuite analysés par chromatographie liquide (LC)-MS/MS à haute résolution en mode DDA, et les données MS brutes sont traitées par l’algorithme MaxQuant pour l’identification des peptides R-méthyl. Enfin, les résultats de sortie MaxQuant sont traités avec hmSEEKER, un outil bioinformatique développé en interne pour rechercher des paires de méthylpeptides lourds et légers. En bref, hmSEEKER lit et filtre les identifications de méthylpeptides à partir du fichier msms, puis fait correspondre chaque méthylpeptide à son pic MS1 correspondant dans le fichier allPeptides, et, enfin, recherche le pic de la contrepartie peptidique lourde/légère. Pour chaque paire putative lourd-léger, les paramètres Log2 H/L (LogRatio), Retention Time difference (dRT) et Mass Error (ME) sont calculés, et les doublets situés dans les seuils définis par l’utilisateur sont étiquetés comme vrais positifs. Le flux de travail du protocole biochimique est décrit à la figure 1.

Protocole

1. Culture cellulaire et extraction de protéines (durée: 3 - 4 semaines requises)

  1. Cultiver des cellules HeLa en parallèle dans des milieux alimentés en méthionine légère (L) ou lourde (H), respectivement (voir le tableau 1 pour la composition du milieu). Sur au moins huit divisions cellulaires, prélever une partie aliquote des cellules de chaque canal SILAC et effectuer le test d’incorporation.
    NOTE: Pour vérifier l’efficacité de l’incorporation, testez par analyse LC-MS/MS que le pourcentage de méthionine lourde (Met-4) dans le canal lourd est aussi proche que possible de 100%. Analyser une partie aliquote de cellules fortement marquées par LC-MS/MS (pour les paramètres, voir le tableau 2), puis traiter les données MS avec MaxQuant en utilisant les paramètres indiqués dans le tableau 3. Pour vérifier l’incorporation de Met-4, un script développé en interne est disponible à https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/.
  2. Considérez l’incorporation de méthionine lourde comme complète lorsqu’elle atteint >97%. Lorsque chaque canal atteint un nombre total d’environ 60 x 106 cellules (correspondant à environ 40 boîtes de 15 cm chacune à 85% de confluence pour les cellules HeLa, avec des variations selon le type de cellule) les récoltent. Comptez soigneusement, mélangez dans une proportion de 1:1 et pelletez par centrifugation à 335 x g pendant 5 min à 4 °C.
    REMARQUE : Pour évaluer le bon mélange de 1:1 L/H, conservez une partie aliquote et faites-la passer sur une tranche d’un gel qui est connu pour contenir une abondance élevée et une protéine fortement R-méthylée (p. ex. fibrillarine). Si le marquage a été réussi et que le mélange 1:1 a été atteint, il devrait y avoir un rapport 1:1 des versions légères et lourdes des peptides R-méthylés présents dans l’échantillon. Sinon, conserver une partie aliquote de l’échantillon mélangé à analyser par LC-MS/MS, puis traiter les données MS avec MaxQuant en utilisant les paramètres indiqués dans le tableau 3 et tracer la distribution du rapport Log2 H/L comme illustré à la figure 2C. Le protocole peut être arrêté ici en congelant la pastille et en la stockant à -80 °C.
  3. Resuspendre la pastille de cellule dans quatre volumes de tampon de lyse (voir le tableau 1 pour la composition du tampon de lyse) par rapport au volume de pastille de cellule. Par exemple, utilisez 6 mL de tampon de lyse pour une pastille de 120 x 10 6 cellules Hela (60 x 10 6 Light + 60 x 10 6 Heavy) correspondant à un volume de 1,5 mL.
    NOTE: L’extraction des protéines doit être effectuée à température ambiante (RT) car le tampon de lyse contient l’agent chaotique 9 M d’urée qui précipite à la température de la glace; par conséquent, l’ajout d’un large spectre d’inhibiteurs de la sérine et de la cystéine protéase est important, ainsi que d’inhibiteur des phosphatases, pour protéger simultanément les protéines contre la dégradation protéolytique et la déphosphorylation, un cocktail d’inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase sont disponibles dans le commerce sous forme de petits comprimés, voir le tableau 1 et le tableau des matériaux.
  4. Sonicer l’échantillon avec un sonicateur perturbateur de cellules microtip pendant au moins cinq cycles de 15 s ON et 30 s OFF, pour assurer une rupture efficace des membranes cellulaires et la libération et le cisaillement de l’ADN. Vérifiez la viscosité de l’extrait en pipetant la solution de haut en bas. S’il est trop visqueux en raison d’un cisaillement incomplet de l’ADN et d’une solubilisation membranaire, répétez les cycles de sonication.
    REMARQUE: Assurez-vous que l’échantillon ne surchauffe pas pendant la sonication, car une température élevée peut endommager les protéines. Cependant, il n’est pas possible de mettre l’échantillon sur de la glace entre les cycles de sonication, en raison de la présence d’urée 9M; par conséquent, il est conseillé de faire une pause de 60 s entre les différents cycles de sonication. De plus, évitez la formation de bulles d’air pendant la sonication car elles réduisent l’efficacité de la sonication.
  5. Centrifuger l’extrait à 3 000 x g pendant 10 min à TA pour enduire les débris et transférer le surnageant dans un nouveau tube de 15 mL.
  6. Mesurer la teneur en protéines de l’extrait avec un dosage colorimétrique, tel que Bradford ou l’acide bicinchoninique (BCA)14,15. Une quantité initiale optimale d’extrait de protéine pour ce protocole est comprise entre 20 et 30 mg.
    NOTE: Les tampons de lyse contenant de l’urée à forte concentration sont compatibles avec les tests de quantification Bradford et BCA; d’autres types de tampons de lyse, tels que ceux comprenant une concentration élevée de dodécylsulfate de sodium (SDS), ne sont pas compatibles avec Bradford.

2.Digestion  du lysat (temps indicatif requis 2 heures)

  1. Effectuer une réduction du groupe thiol (-SH) des protéines à l’aide d’une solution mère de dithiothréitol (DTT) dissous dans de l’eau ultrapure à une concentration finale de 4,5 mM et laisser aller la réaction pendant 30 min à 55 °C.
    NOTE: Il est possible de préparer 1 M de solution mère de DTT et de la stocker à -20 °C jusqu’à 1 mois, en décongelant uniquement les aliquotes nécessaires pour chaque expérience. Alternativement, le réducteur du sulfhydryle tris-(2-carboxyéthyl)-phosphine (TCEP) peut être utilisé pour effectuer une réduction des groupes -SH; en particulier pour le stockage à long terme des protéines, le PTCE est significativement plus stable que le DTT sans chélates métalliques tels que l’EGTA dans le tampon, tandis que le DTT est plus stable si des chélates métalliques sont présents16.
  2. Effectuer l’alkylation du groupe thiol (-SH) des protéines en ajoutant de l’iodoacétamide (IAA) à une concentration de 10 mM et incuber pendant 15 min à TA dans l’obscurité. Effectuer l’incubation des protéines extraites avec une solution d’IAA dans l’obscurité car l’IAA est photosensible.
    NOTE: La solution mère IAA à 100 mM doit être préparée fraîche avant chaque expérience. Alternativement, le chloroacétamide pourrait être utilisé pour effectuer l’alkylation des groupes -SH, en particulier si le but de l’expérience est d’analyser la diaphonie entre la méthylation et l’ubiquitination parce que l’artefact induit par l’IAA imite l’ubiquitination17.
  3. Avant de procéder à l’étape de digestion des protéines, conservez une partie aliquote de l’extrait de protéine (1/1 000 du lysat non digéré de départ) pour une analyse ultérieure sur un gel coloré à la coomassie SDS-PAGE et une comparaison avec une quantité correspondante d’échantillon lors de la digestion; Ce test sert à vérifier l’efficacité de la protéolyse (voir point 4).
  4. Diluer l’extrait protéique restant avec quatre volumes de 20 mM HEPES pH 8,0, pour atteindre une concentration finale d’urée de 2 M (qui est la concentration compatible avec l’activité enzymatique des protéases). Diviser l’échantillon en deux parties : dans la première, ajouter la trypsine modifiée de qualité séquentielle et dans la seconde, ajouter la lysarginase protéase (voir le tableau des matières) à une proportion de 1:100 (p/p) par rapport au mg de matière première. Laisser reposer toute la nuit à 37 °C dans un thermomélangeur à 600 tr/min, pour permettre la digestion enzymatique.
    REMARQUE: La trypsine, l’enzyme de digestion la plus courante en protéomique, se clive à l’extrémité C de R et de Lysine (K), générant des peptides avec une distribution de charge qui se traduit par des spectres de fragmentation dominés par des ions de type Y lors de la dissociation induite par collision (CID). La lysargiNase se clive à l’extrémité N de R et K, reflétant donc la spécificité du clivage de la trypsine et générant des peptides qui libèrent principalement des ions de type b lors de la fragmentation CID. Cette analyse combinée conduit à une couverture de séquence peptidique beaucoup plus élevée et à une plus grande confiance dans l’identification spécifique au site des R-méthylations18.

3. Purification peptidique (temps indicatif requis 1 heure)

  1. Conservez une partie aliquote des peptides digérés des deux réactions, en recueillant les mêmes volumes que dans le point 2.3 pour la comparaison sur le gel coloré à la coomassie SDS-PAGE afin d’évaluer l’efficacité de la digestion de la protéase (voir point 4).
  2. Arrêter la digestion en acidifiant les échantillons avec l’ajout d’acide trifluoroacétique (TFA) à une concentration finale de 5%. Bien mélanger et mesurer le pH des échantillons avec un papier de tournesol (le pH devrait être d’environ 3). Vortex brièvement et faire tourner les échantillons acidifiés avant de les transférer dans de nouveaux tubes de 15 mL.
  3. Nettoyez les échantillons à l’aide de deux cartouches de C18 vac (poids du sorbant 1 g, voir le tableau des matériaux), l’une pour l’échantillon digéré avec la trypsine et l’autre pour l’échantillon digéré avec la lysargiNase. Préparer le solvant A, le solvant B et le tampon de lavage (voir le tableau 1 pour la composition du tampon).
  4. À l’aide de pipettes en verre, réhydrater chaque cartouche avec 6 mL d’ACN à 100 % pendant 3 fois. Après cela, équilibrez chaque cartouche séquentiellement avec 3-9-18 mL de solvant A. Chargez les échantillons (les résines doivent devenir jaunes). Laver de nouveau séquentiellement avec 3-9-18 mL de solvant A, puis ajouter 6 mL de tampon de lavage. Transférer chaque colonne dans des tubes propres de 15 mL et éluer les échantillons avec 7 mL de solvant B. Répéter l’étape d’élution avec 7 mL de Solvant B, pour un volume final de 14 mL.
    REMARQUE: Effectuez toutes ces étapes en laissant les tampons et la solution passer à travers les colonnes par gravité. Pour favoriser l’écoulement des tampons à travers la colonne, poussez chaque solution lentement avec une seringue, pour imiter le vide.
  5. Économisez 50 μL de peptides élués, 50 μL de fluidité (FT), 50 μL de lavage avec le solvant A et 50 μL du dernier lavage pour l’évaluation ultérieure des peptides par SDS-PAGE (voir point 4).

4. Gel FDS-PAGE coloré à Coomassie (temps indicatif requis 2 heures)

  1. Exécutez les aliquotes recueillies sur un gel SDS-PAGE à 17,5% et colorez avec coloration Instant-Blu Coomassie (voir le tableau des matériaux). Le résultat attendu est représenté à la figure 2A.

5. Lyophilisation peptidique (délai indicatif 2 jours)

  1. Couvrir les tubes de 15 mL contenant les peptides élués avec un film de paraffine, qui est ensuite perforé avec une aiguille de 20 G pour créer 3-5 trous. Mettez les tubes dans de la glace sèche pendant au moins 30 minutes, jusqu’à ce que les échantillons soient complètement congelés.
  2. Lyophiliser les fractions congelées pendant 48 h, un intervalle de temps généralement suffisant pour assurer une lyophilisation complète des échantillons, même si une certaine variabilité peut survenir, en raison de la performance du lyophilisateur.
    NOTE: L’expérience peut être interrompue ici, en stockant les échantillons lyophilisés à -80 ° C.

6. Fractionnement chromatographique HpH-RP hors ligne des peptides (temps indicatif 4 jours)

  1. Pour fractionner les peptides en 60 fractions, utilisez la chromatographie liquide HpH-RP, en utilisant un système HPLC équipé d’une colonne HPLC C12-RP (250 x 4,6 mm, 4 μm Proteo 90A).
  2. Avant l’essai, préparer les nouveaux tampons A et B (la composition des tampons est décrite dans le tableau 1).
  3. Filtrer toutes les solutions avec un filtre de 0,22 μm et les dégazer dans un bain de sonicateur pendant au moins 30 min.
  4. Dissoudre les peptides lyophilisés dans 1 mL de tampon A. Filtrer les peptides à travers un filtre en polytétrafluoroéthylène (PTFE) de 0,45 μm, à l’aide d’une seringue.
  5. Régler le débit de fractionnement à 1 mL/min et prélever 1 mL de fractions, en utilisant le gradient chromatographique suivant : 5 % B à 30 % B en 60 min; 30% B à 60% en 2 min; 70% B pendant 3 min.
  6. Régler la CLHP de telle sorte qu’à ce stade, la collecte des fractions soit arrêtée et que le gradient soit maintenu à 70 % du tampon B pendant 5 min avant un lavage approfondi de la colonne avec un gradient rapide jusqu’à 100 % du tampon B, suivi d’un lavage final (tampon B à 100 % pendant 10 min).
    NOTE: À la fin de chaque cycle chromatographique, équilibrez toujours la colonne avec le tampon A à 100% pendant 20 min.
  7. Fractionner les deux échantillons digérés séparément avec la trypsine et la lysarginase par gradients chromatographiques HpH RP hors ligne, comme décrit au point 6.5.
  8. Pour chaque gradient chromatographique, rassembler toutes les fractions dans une plaque profonde de 96 puits.
  9. Regroupez les fractions collectées avant le gradient en une seule fraction nommée PRE. Concaténer les 60 fractions du gradient de chromatographie liquide (LC) HpH-RP en les regroupant de manière non contiguë en 14 fractions finales. Pour obtenir une telle concaténation non contiguë, mettez en commun les fractions HpH-RP selon le schéma suivant.
    1. Fraction 1 (volume final 5 mL) : Piscine 1-15-29-43-57
    2. Fraction 2 (volume final 5 mL) : Piscine 2-16-30-44-58
    3. Fraction 3 (volume final 5 mL) : Piscine 3-17-31-45-59
    4. Fraction 4 (volume final 5 mL) : Piscine 4-18-32-46-60
    5. Fraction 5 (volume final 4 mL) : Piscine 5-19-33-47
    6. Fraction 6 (volume final 4 mL) : Piscine 6-20-34-48
    7. Fraction 7 (volume final 4 mL) : Piscine 7-21-35-49
    8. Fraction 8 (volume final 4 mL) : Piscine 8-22-36-50
    9. Fraction 9 (volume final 4 mL) : Piscine 9-23-37-51
    10. Fraction 10 (volume final 4 mL) : Piscine 10-24-38-52
    11. Fraction 11 (volume final 4 mL) : Piscine 11-25-39-53
    12. Fraction 12 (volume final 4 mL) : Piscine 12-26-40-54
    13. Fraction 13 (volume final 4 mL): Piscine 13-27-41-55
    14. Fraction 14 (volume final 4 mL) : Piscine 14-28-42-56
      NOTE: La concaténation non contiguë consiste à combiner des fractions précoces, moyennes et tardives, ce qui permet d’augmenter l’hétérogénéité de la composition peptidique au sein des fractions regroupées. Par conséquent, le mélange peptidique de chaque fraction groupée est efficacement séparé, avec une co-élution limitée, dans la chromatographie ultérieure à faible pH-RP-LC à faible flux nano-flux directement couplée au spectromètre de masse.
  10. Regroupez les fractions collectées après le gradient dans une fraction unique, appelée POST.
    NOTA : En incluant les fractions PRE et POST gradient, on obtient un total de 16 fractions dans des tubes de 15 mL (voir Figure 3A).
  11. Couvrir les tubes de 15 ml avec un film de paraffine et les poinçonner avec une aiguille de 20 g pour générer 3 à 5 trous. Congelez-les en incubant les tubes de centrifugation dans de la glace sèche jusqu’à ce que chaque fraction soit complètement congelée.
  12. Lyophiliser les fractions pendant environ 48 h. Assurez-vous que chaque échantillon est complètement séché avant d’arrêter le lyophilisateur.
    NOTE: L’expérience peut être interrompue ici, en stockant les échantillons lyophilisés à -80 ° C.

7. Enrichissement par immuno-affinité peptidique R-méthylé (délai indicatif 2 jours)

  1. Effectuer l’enrichissement séquentiel par immuno-affinité du peptide modifié avec des anticorps anti-pan-R-méthylation en parallèle, mais séparément pour les deux échantillons des digestions trypsine et lysarginase, respectivement. Le tampon de purification d’immuno-affinité (IAP) est fourni par la société qui achète les anticorps anti-pan-R-méthyl pour l’enrichissement par affinité peptidique modifiée (les détails sont dans le matériel de table et les réactifs). Le tampon IAP est concentré 10x et doit être dilué 10 fois avant utilisation.
    REMARQUE: Le tampon IAP 1x peut être stocké à -20 °C jusqu’à 1 an.
  2. Centrifuger les peptides lyophilisés à 2 000 x g pendant 5 min à TA pour faire tourner les peptides vers le bas du tube de 15 mL. Resuspendre les peptides lyophilisés avec 250 μL de 1x tampon IAP par tube de 15 mL et transférer dans un tube à faible liaison de 1,5 mL. Vérifiez à l’aide d’un papier de tournesol si le pH est de >6.
  3. Conservez une petite partie aliquote (environ 5 % du volume) de chaque fraction comme entrée pour l’analyse ultérieure de la SM.
  4. Diviser chaque fraction en deux aliquotes, afin d’effectuer l’immuno-enrichissement des peptides asymétriquement di-méthylés (ADMA) et symétriquement di-méthylés (SDMA) en parallèle.
  5. Utilisez trois flacons des anticorps anti-pan-R-méthylés sélectionnés conjugués à des billes d’agarose de protéine A pour 10 mg de l’extrait protéique initial.
  6. Préparer la quantité correcte d’anticorps conjugués aux billes d’agarose en centrifugeant chaque flacon à 2 000 x g pendant 30 s et en retirant le tampon des billes. Lavez les billes trois fois avec 1 ml de 1x PBS toujours en les centrifugeant à 2 000 x g pendant 30 s.
  7. Après le dernier lavage, remettre les billes en suspension dans 40 μL 1x PBS pour chaque flacon; Mettez-les en commun et enfin divisez-les également en 16 fractions (de sorte que 2,5 μL de billes d’anticorps sont ajoutés à chaque fraction).
  8. Ajouter 250 μL de 1x tampon IAP à chaque tube, mélanger par inversion et laisser incuber sur une roue tournante pendant 2 h à 4 °C.
    REMARQUE : Mélangez les échantillons en retournant les tubes de 1,5 mL plutôt qu’en les pipetant avec des micropointes, ce qui pourrait endommager les billes ou entraîner leur perte.
  9. Après 2 h d’incubation, centrifuger les tubes de 1,5 mL contenant des peptides et des billes conjuguées pan-R-méthyl-anticorps à 2 000 x g pendant 30 s pour enrober les billes; transférer le FT de chaque fraction dans des tubes propres à faible liaison de 1,5 mL.
  10. Ajouter les billes conjuguées aux anticorps contre la R-mono-méthylation (MMA) aux FT et répéter les étapes 7.7 à 7.9.
  11. Pendant l’incubation des échantillons de peptides avec les billes de MMA, laver deux fois les fractions qui étaient auparavant immunoprécipitées avec de l’anti-ADMA et de la SDMA avec 250 μL de tampon IAP (inversant et non pipetant), et jeter le surnageant à chaque lavage.
  12. Répétez le lavage avec LC-MS grade H2O trois fois.
  13. Éluer les peptides R-di-méthylés enrichis symétriquement et asymétriquement enrichis par affinité des billes d’agarose en ajoutant 50 μL de TFA à 0,15% dans chaque tube (les conditions acides fortes, en fait, dénaturent l’épitope conduisant à la libération des antigènes des anticorps). Laisser cette solution 10 min à TA, en inversant les tubes toutes les 2-3 min.
  14. Transférer la première élution dans des tubes propres à faible liaison de 1,5 mL et répéter l’élution avec 50 μL de TFA à 0,15 %; Mettez en commun les 2 fractions dans un tube.
  15. Répétez les étapes de 7.11 à 7.14 pour les peptides R-mono-méthylés qui ont été incubés avec les billes d’anticorps anti-MMA.

8. Dessalage et concentration des méthylpeptides enrichis par affinité par des microcolonnes C18 (temps indicatif requis 30 minutes)

  1. Équilibrer avec du méthanol les microcolonnes C18-RP fabriquées avec des cartouches d’extraction en phase solide 3M pour le dessalage et la concentration des peptides avant l’analyse MS19.
  2. Charger les échantillons (correspondant aux fractions enrichies en immunoaffinité et aux fractions d’entrée séparées) sur les microcolonnes C18 en deux étapes (50 μL + 50 μL sur chaque microcolonne C18) par centrifugation à 600 x g pendant 6 min.
  3. Laver les microcolonnes avec un tampon A de 55 μL (voir tableau 1 pour la composition du tampon), toujours par centrifugation à environ 900 x g pendant 5 min.
    REMARQUE: L’expérience peut être interrompue ici, laissant les microcolonnes C18-RP à 4 ° C, où elles peuvent être stockées jusqu’à 2 semaines.

9. Deuxième digestion enzymatique (temps indicatif requis 3 heures)

  1. Laver les microcolonnes C18-RP avec 55 μL de tampon A (voir tableau 1 pour la composition du tampon) deux fois, par centrifugation à environ 850 x g pendant 5 min.
  2. Éluer les peptides deux fois avec 20 μL de tampon B (voir Tableau 1 pour la composition du tampon) et regrouper les deux fractions.
  3. Sécher les peptides élués dans un concentrateur sous vide (voir Matériel du tableau et réactifs pour plus de détails). Pendant ce temps, préparer la solution de digestion composée de 50 mM de bicarbonate d’ammonium dilué à partir d’une solution mère de 1 M fraîchement préparée (voir Tableau 1).
  4. Ajouter la trypsine ou la lysarginase aux échantillons respectifs, jusqu’à une concentration finale de 25 ng/μL. Incuber chaque échantillon à 37 °C pendant 2 h.
  5. Ajouter 1 μL de TFA à 5% pour arrêter la digestion; vortex et faire tourner les échantillons.
    NOTE: Le clivage enzymatique par la trypsine peut être inhibé à l’extrémité C de R et K méthylés, provoquant des clivages manqués qui augmentent la longueur et la charge du peptide, ce qui produit des spectres de fragmentation complexes et incomplets entravant l’identification peptidique et l’attribution spécifique au site des sites de méthylation. Il a été démontré qu’une deuxième digestion enzymatique peut réduire la fréquence de tels clivages manqués, avec une meilleure couverture de séquence et une attribution de site20.

10. Dessalage des peptides (temps indicatif requis 30 minutes)

  1. Charger les solutions peptidiques acidifiées dans de nouvelles microcolonnes C18-RP préalablement équilibrées en suivant les mêmes étapes que celles décrites au point 8.
  2. Le peptide chargé sur les microcolonnes C18-RP peut être stocké à 4 °C jusqu’à élution pour l’analyse LC-MS/MS.

11. Analyse par chromatographie liquide et spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) (temps indicatif 5 jours)

  1. Éluer les peptides des microcolonnes C18-RP en passant 10μL de tampon B, centrifuger à 615 x g pendant 5min à TA. Répétez cette étape deux fois et combinez les éluats.
  2. Réduire le volume des éluats dans un concentrateur sous vide jusqu’à ce qu’ils soient presque secs, en évitant un séchage excessif.
  3. Re-suspendre les peptides dans 10 μL de Buffer A pour l’analyse LC-MS/MS.
  4. Analyser chaque fraction de R-méthyl-peptides par chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) dans un spectromètre de masse à haute résolution (voir Tableau des matériaux), couplé à un système de chromatographie liquide ultra-haute performance (UHPLC) à nano-flux. Réglez les paramètres de l’instrument comme décrit dans le tableau 2.
  5. Charger 2 μL de chaque échantillon sur une colonne nano-analytique (colonne de pulvérisation facile de 75 μm de diamètre intérieur, 25 cm de longueur), remplie de résine C18-RP (taille des particules de 2 μm).
  6. Les échantillons sont passés à travers la nanocolonne C18 RP à un débit de 300 nL/min, avec le gradient linéaire suivant : 3%-30% B pendant 89 min, 30%-60% B pendant 5 min, 60%-95% B pendant 1 min et 95% B pendant 5 min.
  7. Le spectromètre de masse fonctionne en mode d’acquisition dépendant des données (DDA) pour basculer automatiquement entre l’acquisition MS à balayage complet et l’acquisition MS/MS. Réglez le MS à balayage complet de l’enquête à analyser dans le détecteur du spectromètre avec une résolution R = 70 000. Les quinze ions peptidiques les plus intenses sont isolés séquentiellement à une valeur cible de 3 x 106 et fragmentés par une énergie de collision relative de 28%. Définissez les temps d’accumulation d’ions maximaux autorisés à 20 ms pour les balayages complets et à 50 ms pour MS/MS et fixez la valeur cible pour MSMS à 1 x 106. Le temps d’exclusion dynamique est réglé sur 20 s.

12. Exécution de l’analyse des données MaxQuant et hmSEEKER

  1. À la fin des exécutions LC-MS/MS, importer les données brutes MS dans un moteur de recherche de peptides pour identifier les méthylpeptides par une approche probabiliste par rapport à la base de données de référence. Dans ce protocole, MaxQuant version 1.6.2.10 a été utilisée pour notre analyse. MaxQuant nécessite un minimum de 2 Go de RAM pour fonctionner, ainsi que suffisamment d’espace disque pour stocker toutes les données brutes et tous les fichiers de sortie.
    REMARQUE: Reportez-vous à la documentation officielle à https://www.maxquant.org pour tous les détails sur l’installation et la configuration matérielle et logicielle requise.
  2. Dupliquez chaque fichier de données brutes. Renommez les originaux en ajoutant « _light » à leur nom, puis renommez les copies en ajoutant « _heavy ».
    REMARQUE : hmSEEKER, le script pour l’analyse en aval, est sensible à la casse.
  3. Lancez la recherche MaxQuant/Andromeda pour l’identification des peptides avec les paramètres indiqués dans le Tableau 3. Parmi les nombreuses données de sortie produites par MaxQuant, seuls les fichiers allPeptides.txt et msms.txt (situés dans le sous-dossier combiné/txt) sont requis pour l’étape de post-traitement.
  4. Le post-traitement des données de sortie MaxQuant est effectué par l’algorithme hmSEEKER. Téléchargez hmSEEKER depuis : https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/. Le script est disponible sous la forme d’un bloc-notes Jupyter écrit en Python 3.7 et est fourni avec un exemple de jeu de données à des fins de test. Pour les nouveaux utilisateurs, il est conseillé de télécharger et d’installer la plateforme Anaconda (https://www.anaconda.com/products/individual). La dernière version inclut par défaut Python 3.8, Jupyter et tous les paquets nécessaires à l’exécution de hmSEEKER (par exemple, Scikit-learn 0.23.1).
  5. Créez un dossier et stockez les fichiers allPeptides.txt et msms.txt à partir de la sortie MaxQuant.
  6. Lancez Jupyter (depuis la ligne de commande ou depuis le navigateur Anaconda).
  7. Accédez au dossier hmSEEKER et ouvrez hmSEEKER.ipynb.
  8. Dans la section Paramètres d’entrée du bloc-notes, indiquez les chemins d’accès à la base de données FASTA et au(x) dossier(s) contenant les fichiers texte MaxQuant.
  9. Exécutez le code à l’intérieur de chaque cellule en sélectionnant la cellule et en cliquant sur le bouton Lecture en haut de l’interface Jupyter.
  10. Le script produit un fichier de sortie séparé par des virgules pour chaque jeu de données analysé, ainsi qu’un fichier combiné. La liste finale des doublets se trouve dans le fichier nommé « [date]-[heure]-combined_hmSILAC_doublets_HxL_summary.csv »
    (Le tableau 4 comprend une brève description des colonnes du tableau de sortie).

Résultats

L’article décrit un flux de travail pour l’identification à haut niveau de confiance de la R-méthylation globale des protéines, qui repose sur la combinaison de la digestion enzymatique de l’extrait protéique avec deux protéases distinctes en parallèle, suivie d’un fractionnement par chromatographie liquide HpH-RP de peptides protéolytiques et d’un enrichissement par immuno-affinité de peptides R-méthyle avec des anticorps anti-pan-R-méthyle (Figure 1).

Discussion

L’identification de confiance élevée de la méthylation in vivo des protéines/peptides par la protéomique mondiale basée sur la SEP est difficile, en raison du risque de FDR élevé, avec plusieurs substitutions d’acides aminés et méthylestérification se produisant pendant la préparation des échantillons qui sont isobares à la méthylation et peuvent entraîner des assignations erronées en l’absence de stratégies orthogonales de validation de la SEP. La nature sous-stœchiométrique de ce PTM ...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

MM et EM sont doctorants au sein de l’École européenne de médecine moléculaire (SEMM). EM est récipiendaire d’une bourse FIRC-AIRC de 3 ans (code de projet: 22506). Les analyses mondiales des protéomes R-méthyl dans le groupe de la tuberculose sont soutenues par la subvention IG de l’AIRC (code de projet : 21834).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Ammonium Bicarbonate (AMBIC)Sigma-Aldrich09830
Ammonium Persulfate (APS)Sigma-Aldrich497363
C18 Sep-Pak columns vacc 6cc (1g)WatersWAT036905
Colloidal Coomassie staining InstantSigma-AldrichISB1L-1L
cOmplete Mini, EDTA-freeRoche-Sigma Aldrich11836170001Protease Inhibitor
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS)GIBCO ThermoFisher26400-044
DL-Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich3483-12-3
DMEM MediumGIBCO ThermoFisherrequested with stabile glutamine and without methionine
EASY-nano LC 1200 chromatography systemThermoFisher
EASY-Spray HPLC ColumnsThermoFisherES907
GlyceroloSigma-AldrichG5516
HeLa cellsATCCATCC CCL-2
HEPESSigma-AldrichH3375
Iodoacetamide (IAA)Sigma-Aldrich144-48-9
Jupiter C12-RP columnPhenomenex00G-4396-E0
L-MethionineSigma-AldrichM5308Light (L) Methionine
L-Methionine-(methyl-13C,d3)Sigma-Aldrich299154Heavy (H) Methionine
LysargiNaseMerck MilliporeEMS0008
Microtip Cell Disruptor Sonifier 250Branson
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED)Sigma-AldrichT9281
Penicillin-StreptomycinGIBCO ThermoFisher15140122
PhosSTOPRoche-Sigma Aldrich4906837001Phosphatase Inhibitor
Pierce C18 TipsThermoFisher87782
Pierce  0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS GradeThermoFisher85175LC-MS Solvent B
Pierce  0.1% Formic Acid (v/v) in Water, LC-MS GradeThermoFisher85170LC-MS Solvent A
Pierce  Acetonitrile (ACN), LC-MS GradeThermoFisher51101
Pierce  Water, LC-MS GradeThermoFisher51140
PolyacrylamideSigma-Aldrich92560
Precision Plus Protein  All Blue Prestained Protein StandardsBio-Rad1610373
PTMScan antibodies α-ADMACell Signaling Technology13474
PTMScan antibodies α-MMACell Signaling Technology12235
PTMScan antibodies α-SDMACell Signaling Technology13563
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass SpectrometerThermoFisher
Sequencing Grade Modified TrypsinPromegaV5113
Trifluoroacetic acidSigma-AldrichT6508
Ultimate 3000 HPLCDionex
UreaSigma-AldrichU5378
Vacuum Concentrator 5301EppendorfSpeed vac

Références

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