基于质谱的蛋白质组学方法用于全局和高置信度的蛋白质R-甲基化分析

摘要

蛋白精氨酸（R）-甲基化是一种广泛的翻译后修饰，调节多种生物学途径。质谱法是全球分析R-甲基蛋白质组的最佳技术，当与修饰肽富集的生化方法相结合时。本文介绍了专为高置信度鉴定人细胞中全球R-甲基化而设计的工作流程。

摘要

蛋白精氨酸（R）-甲基化是一种广泛的蛋白质翻译后修饰（PTM），参与多种细胞途径的调节，包括RNA加工，信号转导，DNA损伤反应，miRNA生物发生和翻译。

近年来，由于生化和分析的发展，基于质谱（MS）的蛋白质组学已成为以单位点分辨率表征细胞甲基蛋白质组的最有效策略。然而，通过MS鉴定和分析 体内 蛋白质R-甲基化仍然具有挑战性且容易出错，主要是由于这种修饰的亚化学计量性质以及存在各种氨基酸取代和酸性残基的化学甲酯化，这些残基与甲基化同量异位。因此，需要富集方法来增强R-甲基肽的鉴定和正交验证策略，以降低甲基蛋白质组学研究中的错误发现率（FDR）。

本文描述了一种专门为细胞样品中的高置信度R-甲基肽鉴定和定量而设计的方案，该方案将细胞的代谢标记与重同位素编码的蛋氨酸（hmSILAC）和双蛋白酶全细胞提取物的溶液内消化相结合，然后使用抗泛-R-甲基抗体对R-甲基肽进行离线高pH反相（HpH-RP）色谱分级分离和亲和富集。在高分辨率MS分析后，首先使用MaxQuant软件包处理原始数据，然后通过hmSEEKER分析结果，hmSEEKER是一款设计用于深入搜索MaxQuant输出文件中对应于轻质和重质甲基肽的MS峰对的软件。

引言

精氨酸（R）-甲基化是一种翻译后修饰（PTM），可装饰约1%的哺乳动物蛋白质组¹。蛋白精氨酸甲基转移酶（PRMTs）是通过一个或两个甲基以对称或不对称方式沉积到R侧链胍基的氮（N）原子上来催化R-甲基化反应的酶。在哺乳动物中，PRMT可分为三类 - I型，II型和III型 - 取决于它们沉积单甲基化（MMA）和不对称二甲基化（ADMA），MMA和对称二甲基化（SDMA）或仅MMA的能力，分别2^，3。PRMT主要靶向位于富含甘氨酸和精氨酸的区域的R残基，称为GAR基序，但一些PRMTs，如PRMT5和CARM1，可以将脯氨酸-甘氨酸-富含蛋氨酸（PGM）基序^4甲基化。R-甲基化已成为几种生物过程的蛋白质调节剂，例如RNA剪接⁵，DNA修复⁶，miRNA生物发生⁷和翻译²，促进了对该PTM的研究。

质谱 （MS） 被认为是以蛋白质、肽和位点分辨率系统研究全局 R-甲基化的最有效技术。但是，该PTM需要一些特殊的预防措施才能通过MS进行高置信度鉴定。首先，R-甲基化是亚化学计量的，肽....

研究方案

1. 细胞培养和蛋白质提取（时间：需要3-4周）

1. 分别在用轻（L）或重（H）蛋氨酸提供的培养基中平行生长HeLa细胞（参见 表1 的培养基组成）。在至少八次细胞分裂后，从每个SILAC通道收集等分试样的细胞并进行掺入测试。
   注意：为了检查掺入效率，请通过LC-MS/MS分析测试重质通道中重蛋氨酸（Met-4）的百分比尽可能接近100%。通过LC-MS/MS分析重标记细胞的等分试样（设置见表 2），然后使用 表3所示的参数使用MaxQuant处理MS数据。为了检查Met-4的合并情况，可以在 https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/ 获得内部开发的脚本。
2. 当蛋氨酸达到 >97% 时，考虑将其完全掺入。当每个通道达到约60×10⁶ 个细胞的总数（对应于约40个培养皿，每个培养皿15cm，HeLa细胞的85%汇合度，根据细胞类型而变化）收获它们。仔细计数，以1：1的比例混合，并在4°C下以335× g 离心5分钟沉淀。
   注意：要评估正确的 1：1 L/H 混合，请保持等分试样并在已知含有高丰度和重度 R-甲基化蛋白质（例如原纤维蛋白）的凝胶切片上运行。如果标记成功并实现了 1：1 混合，则样品中存在的 R-甲基化肽的轻质和重质版本的比例应为 1：1。或者，保留要通过LC-MS/MS分析的混....

结果

本文介绍了一种高置信度鉴定全局蛋白R-甲基化的工作流程，该工作流程基于蛋白质提取物的酶消化与两种不同的蛋白酶并行结合，然后对蛋白水解肽进行HpH-RP液相色谱分级分离，以及使用抗泛-R-甲基抗体对R-甲基肽进行免疫亲和富集（图1）。

细胞在蛋氨酸存在下生长，蛋氨酸可以是天然的（Light，L，Met-0）或同位素标记的（重，H，Met-4）。在完全同位?.......

讨论

由于存在高FDR的风险，通过全球基于MS的蛋白质组学对 体内 蛋白质/肽甲基化进行高置信度鉴定具有挑战性，在样品制备过程中会发生几种氨基酸取代和甲酯化，这些氨基酸取代和甲酯化与甲基化同量异位，并且在没有正交MS验证策略的情况下可能导致错误的分配。该PTM的亚化学计量性质使全球甲基蛋白质组学的任务进一步复杂化，但可以通过选择性富集修饰肽¹⁰来克服。<.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium Bicarbonate (AMBIC)	Sigma-Aldrich	09830
Ammonium Persulfate (APS)	Sigma-Aldrich	497363
C18 Sep-Pak columns vacc 6cc (1g)	Waters	WAT036905
Colloidal Coomassie staining Instant	Sigma-Aldrich	ISB1L-1L
cOmplete Mini, EDTA-free	Roche-Sigma Aldrich	11836170001	Protease Inhibitor
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS)	GIBCO ThermoFisher	26400-044
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	3483-12-3
DMEM Medium	GIBCO ThermoFisher	requested	with stabile glutamine and without methionine
EASY-nano LC 1200 chromatography system	ThermoFisher
EASY-Spray HPLC Columns	ThermoFisher	ES907
Glycerolo	Sigma-Aldrich	G5516
HeLa cells	ATCC	ATCC CCL-2
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Iodoacetamide (IAA)	Sigma-Aldrich	144-48-9
Jupiter C12-RP column	Phenomenex	00G-4396-E0
L-Methionine	Sigma-Aldrich	M5308	Light (L) Methionine
L-Methionine-(methyl-13C,d3)	Sigma-Aldrich	299154	Heavy (H) Methionine
LysargiNase	Merck Millipore	EMS0008
Microtip Cell Disruptor Sonifier 250	Branson
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich	T9281
Penicillin-Streptomycin	GIBCO ThermoFisher	15140122
PhosSTOP	Roche-Sigma Aldrich	4906837001	Phosphatase Inhibitor
Pierce C18 Tips	ThermoFisher	87782
Pierce  0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS Grade	ThermoFisher	85175	LC-MS Solvent B
Pierce  0.1% Formic Acid (v/v) in Water, LC-MS Grade	ThermoFisher	85170	LC-MS Solvent A
Pierce  Acetonitrile (ACN), LC-MS Grade	ThermoFisher	51101
Pierce  Water, LC-MS Grade	ThermoFisher	51140
Polyacrylamide	Sigma-Aldrich	92560
Precision Plus Protein  All Blue Prestained Protein Standards	Bio-Rad	1610373
PTMScan antibodies α-ADMA	Cell Signaling Technology	13474
PTMScan antibodies α-MMA	Cell Signaling Technology	12235
PTMScan antibodies α-SDMA	Cell Signaling Technology	13563
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer	ThermoFisher
Sequencing Grade Modified Trypsin	Promega	V5113
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	T6508
Ultimate 3000 HPLC	Dionex
Urea	Sigma-Aldrich	U5378
Vacuum Concentrator 5301	Eppendorf		Speed vac