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Resumo

A proteína arginina (R)-metilação é uma modificação pós-translacional generalizada que regula múltiplas vias biológicas. A espectrometria de massas é a melhor tecnologia para traçar globalmente o perfil do R-metil-proteoma, quando acoplada a abordagens bioquímicas para enriquecimento peptídico modificado. O fluxo de trabalho projetado para a identificação de alta confiança da R-metilação global em células humanas é descrito aqui.

Resumo

A proteína arginina (R)-metilação é uma modificação pós-traducional (PTM) generalizada de proteínas envolvida na regulação de várias vias celulares, incluindo processamento de RNA, transdução de sinal, resposta a danos no DNA, biogênese de miRNA e tradução.

Nos últimos anos, graças aos desenvolvimentos bioquímicos e analíticos, a proteômica baseada em espectrometria de massa (EM) emergiu como a estratégia mais eficaz para caracterizar o metilproteoma celular com resolução de sítio único. No entanto, a identificação e o perfil da R-metilação da proteína in vivo pela EM continuam a ser desafiantes e propensos a erros, principalmente devido à natureza subestequiométrica desta modificação e à presença de várias substituições de aminoácidos e metil-esterificação química de resíduos ácidos que são isobáricos à metilação. Assim, são necessários métodos de enriquecimento para melhorar a identificação de peptídeos-R-metil e estratégias de validação ortogonal para reduzir as Taxas de Falsa Descoberta (FDR) em estudos de metilproteômica.

Aqui, um protocolo projetado especificamente para identificação e quantificação de peptídeos R-metil de alta confiança a partir de amostras celulares é descrito, que combina marcação metabólica de células com metionina codificada em isótopos pesados (hmSILAC) e digestão em solução de protease dupla de extrato de célula inteira, seguida por fracionamento de cromatografia off-line de fase reversa de pH alto (HpH-RP) e enriquecimento de afinidade de peptídeos R-metil usando anticorpos anti-pan-R-metil. Após a análise de MS de alta resolução, os dados brutos são primeiro processados com o pacote de software MaxQuant e os resultados são então analisados pelo hmSEEKER, um software projetado para a pesquisa aprofundada de pares de pico MS correspondentes ao peptídeo metil leve e pesado dentro dos arquivos de saída MaxQuant.

Introdução

A arginina (R)-metilação é uma modificação pós-translacional (PTM) que decora cerca de 1% do proteomade mamíferos 1. A proteína arginina metiltransferases (PRMTs) são as enzimas que catalisam a reação de R-metilação pela deposição de um ou dois grupos metil aos átomos de nitrogênio (N) do grupo guanidino da cadeia lateral de R de maneira simétrica ou assimétrica. Em mamíferos, os PRMTs podem ser agrupados em três classes - tipo I, tipo II e tipo III - dependendo de sua capacidade de depositar monometilação (MMA) e dimetilação assimétrica (ADMA), MMA e dimetilação simétrica (SDMA) ou apenas MMA, respectivamente 2,3. Os PRMTs visam principalmente resíduos de R localizados em regiões ricas em glicina e arginina, conhecidos como motivos GAR, mas alguns PRMTs, como PRMT5 e CARM1, podem metilar motivos ricos em prolina-glicina-metionina (PGM)4. A R-metilação emergiu como um modulador de proteínas de vários processos biológicos, como o splicing de RNA 5, o reparo de DNA6, a biogênesede miRNA7 e a tradução2, fomentando a pesquisa sobre esse PTM.

A espectrometria de massa (EM) é reconhecida como a tecnologia mais eficaz para estudar sistematicamente a R-metilação global na resolução de proteínas, peptídeos e locais. No entanto, este PTM requer algumas precauções particulares para a sua identificação de alta confiança pela EM. Primeiro, a R-metilação é subestequiométrica, com a forma não modificada dos peptídeos sendo muito mais abundante do que os modificados, de modo que os espectrômetros de massa que operam no modo de Aquisição Dependente de Dados (DDA) fragmentarão peptídeos não modificados de alta intensidade com mais frequência do que suas contrapartes metiladas de baixa intensidade8. Além disso, a maioria dos fluxos de trabalho baseados em EM para identificação de locais R-metilados sofre de limitações no nível de análise bioinformática. De fato, a identificação computacional de metilpeptídeos é propensa a altas Taxas de Falsa Descoberta (FDR), porque esse PTM é isobárico a várias substituições de aminoácidos (por exemplo, glicina em alanina) e modificações químicas, como metilesterificação de aspartato e glutamato9. Assim, métodos baseados na marcação isotópica de grupos metil, como o Heavy Methyl Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell culture (hmSILAC), têm sido implementados como estratégias ortogonais para a identificação confiante de MS de metilações in vivo , reduzindo significativamente a taxa de anotações falso-positivas10.

Recentemente, vários protocolos de proteoma para estudar proteínas R-metiladas foram otimizados. O desenvolvimento de estratégias baseadas em anticorpos para o enriquecimento por imunoafinidade de peptídeos-R-metil levou à anotação de várias centenas de sítios R-metilados em células humanas11,12. Além disso, muitos estudos 3,13 relataram que o acoplamento do enriquecimento baseado em anticorpos com técnicas de separação peptídica, como o fracionamento por cromatografia HpH-RP, pode aumentar o número total de metilpeptídeos identificados.

Este artigo descreve uma estratégia experimental desenhada para a identificação sistemática e de alta confiança de sítios R-metilados em células humanas, com base em várias etapas bioquímicas e analíticas: extração de proteínas de células marcadas com hmSILAC, digestão enzimática dupla paralela com proteases de tripsina e lisarginase, seguida de fracionamento cromatográfico de peptídeos digeridos por HpH-RP, juntamente com enriquecimento de imuno-afinidade baseado em anticorpos de MMA-, SDMA-, e peptídeos contendo ADMA. Todos os peptídeos enriquecidos com afinidade são então analisados por cromatografia líquida de alta resolução (LC)-MS/MS no modo DDA, e os dados brutos de MS são processados pelo algoritmo MaxQuant para identificação de peptídeos R-metil. Finalmente, os resultados de saída do MaxQuant são processados com o hmSEEKER, uma ferramenta de bioinformática desenvolvida internamente para pesquisar pares de metilpeptídeos pesados e leves. Resumidamente, o hmSEEKER lê e filtra as identificações de metilpeptídeos do arquivo msms, depois combina cada peptídeo de metila com seu pico MS1 correspondente no arquivo allPeptides e, finalmente, procura o pico da contraparte de peptídeo pesado / leve. Para cada suposto par de pesos pesados, os parâmetros Log2 H/L ratio (LogRatio), Retention Time difference (dRT) e Mass Error (ME) são calculados e os doublets localizados dentro de pontos de corte definidos pelo usuário são rotulados como verdadeiros positivos. O fluxo de trabalho do protocolo bioquímico está descrito na Figura 1.

Protocolo

1. Cultura celular e extração de proteínas (tempo: 3 - 4 semanas necessárias)

  1. Cultivar células HeLa em paralelo em meios fornecidos com metionina leve (L) ou pesada (H), respectivamente (ver Tabela 1 para composição de meios). Após pelo menos oito divisões celulares, coletar uma alíquota de células de cada canal SILAC e realizar o teste de incorporação.
    NOTA: Para verificar a eficiência de incorporação, teste por análise LC-MS/MS que a porcentagem de metionina pesada (Met-4) no canal pesado é o mais próximo possível de 100%. Analise uma alíquota de células fortemente marcadas por LC-MS/MS (para configurações, consulte a Tabela 2) e, em seguida, processe os dados do MS com MaxQuant usando os parâmetros indicados na Tabela 3. Para verificar a incorporação do Met-4, um script desenvolvido internamente está disponível em https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/.
  2. Considere a incorporação pesada de metionina como completa quando atingir >97%. Quando cada canal atingir um número total de cerca de 60 x 106 de células (correspondendo a cerca de 40 pratos de 15 cm cada um com 85% de confluência para células HeLa, com variações dependendo do tipo de célula) colhe-os. Conte-os cuidadosamente, misture na proporção de 1:1 e o pellet por centrifugação a 335 x g durante 5 min a 4 °C.
    NOTA: Para avaliar a mistura adequada de 1:1 L/H, mantenha uma alíquota e execute-a em uma fatia de um gel que é conhecido por conter uma alta abundância e proteína fortemente metilada por R (por exemplo, fibrilarina). Se a marcação tiver sido bem sucedida e a mistura de 1:1 tiver sido alcançada, deve haver uma proporção de 1:1 de versões leves e pesadas dos peptídeos R-metilados presentes na amostra. Alternativamente, mantenha uma alíquota de amostra mista a ser analisada por LC-MS/MS, em seguida, processe os dados de MS com MaxQuant usando os parâmetros indicados na Tabela 3 e plote a distribuição da relação H/L Log2 conforme mostrado na Figura 2C. O protocolo pode ser interrompido aqui congelando o pellet e armazenando-o a -80 °C.
  3. Ressuspeite o pellet celular em quatro volumes de tampão de lise (ver Tabela 1 para a composição do tampão de lise) em relação ao volume do pellet celular. Por exemplo, use 6 mL de tampão de lise para um pellet de 120 x 10 6 células Hela (60 x 10 6 Light + 60 x 106 Heavy) correspondendo a 1,5 mL de volume.
    NOTA: A extração de proteínas deve ser realizada à temperatura ambiente (RT) porque o tampão de lise contém o agente caotrópico 9 M de ureia que se precipita à temperatura do gelo; portanto, a adição de um amplo espectro de inibidores da serina e da cisteína protease é importante, bem como o inibidor de fosfatases, para proteger simultaneamente as proteínas contra a degradação proteolítica e a desfosforilação, coquetel de inibidores de protease e fosfatase estão comercialmente disponíveis como pequenos comprimidos, ver Tabela 1 e Tabela de Materiais.
  4. Sonicate a amostra com um sonicator disruptor de células de microponta por pelo menos cinco ciclos de 15 s ON e 30 s OFF, para garantir a quebra eficiente das membranas celulares e liberação de DNA e cisalhamento. Verifique a viscosidade do extrato pipetando a solução para cima e para baixo. Se for muito viscoso devido ao cisalhamento incompleto do DNA e à solubilização da membrana, repita os ciclos de sonicação.
    NOTA: Certifique-se de que a amostra não superaquece durante a sonicação, porque a alta temperatura pode danificar as proteínas. No entanto, não é possível colocar a amostra no gelo entre os ciclos de sonicação, devido à presença de ureia 9M; portanto, é aconselhável pausar por 60 s OFF entre diferentes ciclos de sonicação. Além disso, evite a formação de bolhas de ar durante a sonicação, porque eles reduzem a eficácia da sonicação.
  5. Centrifugar o extrato a 3.000 x g por 10 min no RT para peletizar os detritos e transferir o sobrenadante em um novo tubo de 15 mL.
  6. Medir o teor de proteína do extrato com um ensaio colorimétrico, como Bradford ou ácido bicinchonínico (BCA)14,15. Uma quantidade inicial ideal de extrato de proteína para este protocolo é entre 20-30 mg.
    NOTA: Os tampões de lise contendo ureia de alta concentração são compatíveis tanto com o ensaio de quantificação de Bradford quanto com o BCA; outros tipos de tampão de lise, como aqueles que incluem alta concentração de dodecil sulfato de sódio (SDS), não são compatíveis com Bradford.

2.Digestão  do lisado (tempo indicativo necessário 2 horas)

  1. Realizar a redução do grupo tiol (-SH) de proteínas utilizando uma solução-mãe de ditiotreitol (TDT) dissolvida em água ultrapura a uma concentração final de 4,5 mM e deixar a reação ir por 30 min a 55 °C.
    NOTA: É possível preparar 1 M de solução de TDT de reserva e armazená-la a -20 °C durante um período máximo de 1 mês, descongelando apenas as alíquotas necessárias para cada experiência. Alternativamente, o redutor de sulfidrila tris-(2-carboxietil)-fosfina (TCEP) pode ser usado para realizar a redução de grupos -SH; especialmente para o armazenamento prolongado de proteínas, a TCEP é significativamente mais estável do que a TDT sem quelatos metálicos, como EGTA no tampão, enquanto a TDT é mais estável se os quelatos metálicos estiverem presentes16.
  2. Realizar alquilação do grupo tiol (-SH) de proteínas adicionando iodoacetamida (IAA) a uma concentração de 10 mM e incubar por 15 min no RT no escuro. Realizar a incubação de proteínas extraídas com solução de IAA no escuro porque o IAA é fotossensível.
    NOTA: A solução-mãe IAA a 100 mM deve ser preparada fresca antes de cada experiência. Alternativamente, a cloroacetamida poderia ser usada para realizar alquilação de grupos -SH, especialmente se o objetivo do experimento for analisar a conversa cruzada entre metilação e ubiquitinação, pois o artefato induzido por IAA imita a ubiquitinação17.
  3. Antes de prosseguir com a etapa de digestão de proteínas, salve uma alíquota de extrato proteico (1/1.000 de lisado não digerido inicial) para análise subsequente em gel corado com Coomassie SDS-PAGE e comparação com uma quantidade correspondente de amostra após a digestão; este ensaio serve para verificar a eficiência da proteólise (ver ponto 4).
  4. Diluir o extrato proteico restante com quatro volumes de 20 mM HEPES pH 8,0, para atingir uma concentração final de ureia de 2 M (que é a concentração compatível com a atividade enzimática das proteases). Dividir a amostra em duas partes: na primeira adicionar tripsina modificada de grau de sequenciação e, na segunda, adicionar protease lisarginase (ver Tabela de materiais) na proporção de 1:100 (p/p) em relação ao mg de matéria-prima. Deixar pernoitar a 37 °C numa termómera a 600 rpm, para permitir a digestão enzimática.
    NOTA: A tripsina, a enzima de digestão mais comum na proteômica, cliva-se no terminal C de R e lisina (K), gerando peptídeos com uma distribuição de carga que resulta em espectros de fragmentação dominados por íons do tipo y após dissociação induzida por colisão (CID). A lisargiNase cliva-se no N-terminal de R e K, portanto, espelhando a especificidade da clivagem da tripsina e gerando peptídeos que liberam principalmente íons do tipo b após a fragmentação da CID. Essa análise combinada leva a uma cobertura muito maior da sequência peptídica e a uma maior confiança na identificação sítio-específica das R-metilações18.

3. Purificação do peptídeo (tempo indicativo necessário 1 hora)

  1. Manter uma alíquota de péptidos digeridos de ambas as reacções, recolhendo os mesmos volumes que no ponto 2.3 para a comparação com o gel corado com Coomastie SDS-PAGE para avaliar a eficiência da digestão das proteases (ver ponto 4).
  2. Parar a digestão acidificando as amostras com a adição de ácido trifluoroacético (TFA) a uma concentração final de 5%. Misture bem e meça o pH das amostras com um papel de tornassol (o pH deve ser em torno de 3). Vórtice brevemente e gire as amostras acidificadas antes de transferi-las para novos tubos de 15 mL.
  3. Limpar as amostras através de dois cartuchos de vácuo C18 (peso sorvente de 1 g, ver Tabela de Materiais), um para a amostra digerida com tripsina e outro para a amostra digerida com LysargiNase. Prepare o solvente A, o solvente B e o tampão de lavagem (consulte a Tabela 1 para a composição do tampão).
  4. Usando pipetas de vidro, reidratar cada cartucho com 6 mL de ACN 100% por 3 vezes. Depois disso, equilibre cada cartucho sequencialmente com 3-9-18 mL de Solvente A. Carregue as amostras (as resinas devem ficar amarelas). Lave novamente sequencialmente com 3-9-18 mL de solvente A e, em seguida, adicione 6 mL de tampão de lavagem. Transfira cada coluna para tubos limpos de 15 mL e elua as amostras com 7 mL de Solvente B. Repita a etapa de eluição com 7 mL de Solvente B, para um volume final de 14 mL.
    NOTA: Execute todas essas etapas deixando os buffers e a solução passarem pelas colunas por gravidade. Para favorecer o fluxo dos tampões através da coluna, empurre cada solução lentamente com uma seringa, para imitar o vácuo.
  5. Guardar 50 μL de péptidos eluídos, 50 μL de fluxo (FT), 50 μL da lavagem com solvente A e 50 μL da última lavagem para a subsequente avaliação peptídica pela SDS-PAGE (ver ponto 4).

4. Gel SDS-PAGE corado com Coomassie (tempo indicativo necessário 2 horas)

  1. Execute as alíquotas coletadas em um gel SDS-PAGE de 17,5% e core com coloração Instant-Blu Coomassie (consulte Tabela de Materiais). O resultado esperado está representado na Figura 2A.

5. Liofilização peptídica (tempo indicativo de 2 dias)

  1. Cubra os tubos de 15 mL contendo os peptídeos eluídos com filme de parafina, que é então perfurado com uma agulha de 20 G para criar 3-5 orifícios. Coloque os tubos em gelo seco por pelo menos 30 min, até que as amostras estejam completamente congeladas.
  2. Liofilizar as frações congeladas por 48 h, intervalo de tempo tipicamente suficiente para garantir uma liofilização completa das amostras, mesmo que possa ocorrer alguma variabilidade, devido ao desempenho do liofilizador.
    NOTA: O experimento pode ser pausado aqui, armazenando as amostras liofilizadas a -80 °C.

6. Fracionamento cromatográfico off-line de peptídeos HpH-RP (tempo indicativo de 4 dias)

  1. Para fracionar os peptídeos em 60 frações, utilizar cromatografia líquida HpH-RP, utilizando sistema de HPLC equipado por coluna de HPLC C12-RP (250 x 4,6 mm, 4 μm Proteo 90A).
  2. Antes da execução, prepare o Buffer A e o Buffer B frescos (a composição dos Buffers é descrita na Tabela 1).
  3. Filtrar toda a solução com um filtro de 0,22 μm e desgaseificá-las num banho sonicator durante, pelo menos, 30 min.
  4. Dissolva os peptídeos liofilizados em 1 mL de Tampão A. Filtre os peptídeos através de um filtro de politetrafluoroetileno (PTFE) de 0,45 μm, usando uma seringa.
  5. Definir a taxa de fracionamento em fluxo de 1 mL/min e coletar 1 mL de frações, utilizando o seguinte gradiente cromatográfico: 5% B a 30% B em 60 min; 30% B a 60% em 2 min; 70% B por 3 min.
  6. Defina a HPLC de modo que, neste ponto, a coleta de frações seja interrompida e o gradiente mantido no Buffer B de 70% por 5 min antes de uma lavagem extensiva da coluna com um gradiente rápido de até 100% Buffer B, seguido por uma lavagem final (100% Buffer B por 10 min).
    NOTA: No final de cada execução cromatográfica, equilibre sempre a coluna com 100% de tampão A durante 20 min.
  7. Fracionar ambas as amostras digeridas separadamente com tripsina e lisargiNase por gradientes cromatográficos Off-Line HpH RP, conforme descrito no ponto 6.5.
  8. Para cada gradiente cromatográfico, recolher todas as fracções numa placa profunda de 96 poços.
  9. Agrupe as frações coletadas antes do gradiente em uma única fração chamada PRE. Concatenar as 60 frações do gradiente de cromatografia líquida (LC) de HpH-RP, agrupando-as de forma não contígua em 14 frações finais. Para obter essa concatenação não contígua, agrupe as frações HpH-RP de acordo com o esquema a seguir.
    1. Fração 1 (volume final 5 mL): Pool 1-15-29-43-57
    2. Fração 2 (volume final 5 mL): Pool 2-16-30-44-58
    3. Fração 3 (volume final 5 mL): Pool 3-17-31-45-59
    4. Fração 4 (volume final 5 mL): Pool 4-18-32-46-60
    5. Fração 5 (volume final 4 mL): Pool 5-19-33-47
    6. Fração 6 (volume final 4 mL): Pool 6-20-34-48
    7. Fração 7 (volume final 4 mL): Pool 7-21-35-49
    8. Fração 8 (volume final 4 mL): Pool 8-22-36-50
    9. Fração 9 (volume final 4 mL): Pool 9-23-37-51
    10. Fração 10 (volume final 4 mL): Pool 10-24-38-52
    11. Fração 11 (volume final 4 mL): Pool 11-25-39-53
    12. Fração 12 (volume final 4 mL): Pool 12-26-40-54
    13. Fração 13 (volume final 4 mL): Pool 13-27-41-55
    14. Fração 14 (volume final 4 mL): Pool 14-28-42-56
      NOTA: A concatenação não contígua consiste na combinação de frações de eluição precoce, média e tardia, o que permite aumentar a heterogeneidade na composição peptídica dentro das frações agrupadas. Consequentemente, a mistura peptídica de cada fração agrupada é eficientemente separada, com co-eluição limitada, na cromatografia subsequente de nano-fluxo de baixo pH-RP-LC diretamente acoplada ao espectrômetro de massa.
  10. Agrupe as frações coletadas após o gradiente em uma fração exclusiva, chamada POST.
    NOTA: Incluindo as frações PRE e gradiente POST, obtém-se um total de 16 frações, em tubos de 15 mL (ver Figura 3A).
  11. Cubra os tubos de 15 mL com filme de parafina e perfure-o com uma agulha de 20 G para gerar 3-5 furos. Congele-os incubando os tubos de centrífuga em gelo seco até que cada fração esteja completamente congelada.
  12. Liofilizar as frações por cerca de 48 h. Certifique-se de que cada amostra está completamente seca antes de parar o liofilizador.
    NOTA: O experimento pode ser pausado aqui, armazenando as amostras liofilizadas a -80 °C.

7. Enriquecimento por imuno-afinidade do peptídeo R-metilado (tempo indicativo de 2 dias)

  1. Realizar o enriquecimento sequencial de imuno-afinidade do peptídeo modificado com anticorpos anti-pan-R-metilação em paralelo, mas separadamente para as duas amostras das digestões de tripsina e lisargiNase, respectivamente. O tampão de purificação de imuno-afinidade (IAP) é fornecido pela empresa que compra os anticorpos anti-pan-R-metil para enriquecimento de afinidade peptídica modificada (os detalhes estão na Tabela Material e Reagentes). O tampão IAP é concentrado 10x e deve ser diluído 10 vezes antes do uso.
    NOTA: O buffer IAP 1x pode ser armazenado a -20 °C até 1 ano.
  2. Centrifugar os peptídeos liofilizados a 2.000 x g por 5 min no RT para girar os peptídeos até o fundo do tubo de 15 mL. Ressuspeite os peptídeos liofilizados com 250 μL de 1x tampão IAP por tubo de 15 mL e transfira em um tubo de baixa ligação de 1,5 mL. Verifique usando um papel decisivo se o pH é >6.
  3. Mantenha uma pequena alíquota (cerca de 5% do volume) de cada fração como entrada para a análise subsequente do MS.
  4. Dividir cada fração em duas alíquotas, a fim de realizar o imunoenriquecimento de peptídeos assimetricamente di-metilados (ADMA) e simetricamente di-metilados (SDMA) em paralelo.
  5. Use três frascos para injetáveis dos anticorpos anti-pan-R-metilados selecionados conjugados com esferas de agarose de proteína A por 10 mg do extrato proteico inicial.
  6. Preparar a quantidade correta de anticorpos conjugados a grânulos de agarose, centrifugando cada frasco para injetáveis a 2.000 x g durante 30 s e removendo o tampão das contas. Lave as contas três vezes com 1 mL de PBS 1x sempre centrifugando-as a 2.000 x g por 30 s.
  7. Após a última lavagem, ressuspender as esferas em 40 μL 1x PBS para cada frasco para injetáveis; agrupá-los e, finalmente, dividi-los igualmente em 16 frações (de modo que 2,5 μL de contas de anticorpos são adicionados a cada fração).
  8. Adicionar 250 μL de 1x tampão IAP a cada tubo, misturar invertendo e deixar incubar numa roda rotativa durante 2 h a 4 °C.
    NOTA: Misture as amostras invertendo os tubos de 1,5 mL em vez de pipetá-los com micropontas, o que poderia danificar as contas ou resultar em perdê-las.
  9. Após 2 h de incubação, centrifugar os tubos de 1,5 mL contendo peptídeos e grânulos conjugados com pan-R-metil-anticorpo a 2.000 x g por 30 s para pellet as contas; transferir o FT de cada fração para tubos limpos de 1,5 mL de baixa ligação.
  10. Adicionar as esferas conjugadas a anticorpos contra a R-monometilação (MMA) aos FTs e repetir os passos 7.7 a 7.9.
  11. Durante a incubação das amostras peptídicas com os grânulos MMA, lavar duas vezes as frações previamente imunoprecipitadas com anti-ADMA e SDMA com tampão IAP de 250 μL (inversão e não pipetagem) e descartar o sobrenadante a cada lavagem.
  12. Repetir a lavagem com LC-MS grau H2O três vezes.
  13. Eluir os peptídeos R-di-metilados enriquecidos com afinidade simétrica e assimétrica das esferas de agarose adicionando 50 μL de TFA a 0,15% a cada tubo (condições ácidas fortes, de fato, desnaturam o epítopo levando à liberação dos antígenos dos anticorpos). Deixe esta solução 10 min em RT, invertendo os tubos a cada 2-3 min.
  14. Transfira a primeira eluição para tubos limpos de 1,5 mL de baixa ligação e repita a eluição com 50 μL de TFA a 0,15%; agrupe as 2 frações em um tubo.
  15. Repita os passos de 7,11 a 7,14 para os peptídeos R-mono-metilados que foram incubados com as esferas de anticorpos anti-MMA.

8. Dessalinização e concentração de metilpeptídeos enriquecidos com afinidade por microcolunas C18 (tempo indicativo necessário de 30 minutos)

  1. Equilibrar com metanol as microcolunas C18-RP confeccionadas com cartuchos de extração 3M Solid Phase para dessalinização e concentração de peptídeos antes da análise de MS19.
  2. Carregar as amostras (correspondentes às fracções enriquecidas com imuno-afinidade separadas e fracções de entrada) nas microcolunas C18 em duas etapas (50 μL + 50 μL em cada microcoluna C18) por centrifugação a 600 x g durante 6 min.
  3. Lavar as microcolunas com tampão A de 55 μL (ver quadro 1 para a composição do tamponamento), sempre por centrifugação a cerca de 900 x g durante 5 minutos.
    NOTA: O experimento pode ser pausado aqui, deixando as microcolunas C18-RP a 4 °C, onde podem ser armazenadas até 2 semanas.

9. Segunda digestão enzimática (tempo indicativo necessário 3 horas)

  1. Lavar as microcolunas C18-RP com 55 μL de tampão A (ver quadro 1 para a composição do tampão) durante duas vezes, por centrifugação a cerca de 850 x g durante 5 minutos.
  2. Elimine os péptidos duas vezes com 20 μL de tampão B (ver Tabela 1 para a composição do tampão) e agrupe as duas fracções.
  3. Secar os péptidos eluídos num concentrador de vácuo (ver Tabela Material e Reagentes para mais pormenores). Entretanto, preparar a solução de digestão que consiste em bicarbonato de amónio 50 mM que é diluído a partir de uma solução-mãe de 1 M acabada de fabrico (ver quadro 1).
  4. Adicionar tripsina ou lisargiNase às respectivas amostras, até uma concentração final de 25 ng/μL. Incubar cada amostra a 37 °C durante 2 h.
  5. Adicione 1 μL de 5% de TFA para parar a digestão; vórtice e girar para baixo as amostras.
    NOTA: A clivagem enzimática pela tripsina pode ser inibida no terminal C de R e K metilados, causando clivagens perdidas que aumentam o comprimento e a carga do peptídeo, que por sua vez produzem espectros de fragmentação complexos e incompletos, dificultando a identificação de peptídeos e a atribuição sítio-específica de locais de metilação. Demonstrou-se que uma segunda digestão enzimática pode reduzir a frequência dessas clivagens perdidas, com melhor cobertura de sequência e atribuição de sítio20.

10. Dessalinização de peptídeos (tempo indicativo necessário 30 minutos)

  1. Carregar as soluções peptídicas acidificadas em novas microcolunas de C18-RP previamente equilibradas seguindo os mesmos passos descritos no ponto 8.
  2. O peptídeo carregado nas microcolunas C18-RP pode ser armazenado a 4 °C até a eluição para análise LC-MS/MS.

11. Cromatografia líquida-espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS) análise (tempo indicativo de 5 dias)

  1. Eluir os peptídeos das microcolunas C18-RP passando 10μL de tampão B, centrifugando a 615 x g por 5min no RT. Repita esta etapa duas vezes e combine os eluatos.
  2. Reduza o volume dos eluídos em um concentrador a vácuo até que estejam quase secos, evitando a secagem excessiva.
  3. Ressuspender os peptídeos em 10 μL de tampão A para análise LC-MS/MS.
  4. Analisar cada fração de peptídeos R-metil por cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) em um Espectrômetro de Massa de alta resolução (ver Tabela de Materiais), acoplado a um sistema de cromatografia líquida de ultra-alta eficiência (UHPLC) de nano-fluxo. Defina os parâmetros do instrumento conforme descrito na Tabela 2.
  5. Carregar 2 μL de cada amostra numa coluna nanoanalítica (coluna de pulverização fácil com 75 μm de diâmetro interior, 25 cm de comprimento), embalada com resina C18-RP (tamanho de partícula de 2 μm).
  6. As amostras são passadas através da nanocoluna C18 RP a uma vazão de 300 nL/min, com o seguinte gradiente linear: 3%-30% B por 89 min, 30%-60% B por 5 min, 60%-95% B por 1 min e 95% B por 5 min.
  7. O espectrômetro de massa opera no modo de aquisição dependente de dados (DDA) para alternar automaticamente entre a verificação completa do MS e a aquisição do MS/MS. Defina o MS de varredura completa de pesquisa a ser analisado no detector espectrômetro com resolução R = 70.000. Os quinze íons peptídicos mais intensos são isolados sequencialmente a um valor-alvo de 3 x 106 e fragmentados por energia de colisão relativa de 28%. Defina os tempos máximos de acumulação de íons permitidos para 20 ms para varreduras completas e 50 ms para MS/MS e fixe o valor alvo para MSMS para 1 x 106. O tempo de exclusão dinâmica é definido como 20 s.

12. Executando a análise de dados MaxQuant e hmSEEKER

  1. Após a conclusão das execuções LC-MS/MS, importe os dados brutos do MS para um mecanismo de pesquisa de peptídeos para identificar os metilpeptídeos por abordagem baseada em probabilidade em relação ao banco de dados de referência. Neste protocolo, o MaxQuant versão 1.6.2.10 foi utilizado para nossa análise. MaxQuant requer um mínimo de 2 GB de RAM para ser executado, bem como espaço em disco suficiente para armazenar todos os dados brutos e todos os arquivos de saída.
    NOTA: Consulte a documentação oficial em https://www.maxquant.org para obter todos os detalhes sobre a instalação e os requisitos de hardware e software.
  2. Duplique cada arquivo de dados brutos. Renomeie os originais acrescentando "_light" ao seu nome e, em seguida, renomeie as cópias acrescentando "_heavy".
    NOTA: hmSEEKER, o script para análise a jusante, diferencia maiúsculas de minúsculas.
  3. Inicie a pesquisa MaxQuant/Andromeda para identificação de peptídeos com as configurações indicadas na Tabela 3. Dos vários dados de saída produzidos pelo MaxQuant, apenas os arquivos allPeptides.txt e msms.txt (localizados na subpasta combined/txt) são necessários para a etapa de pós-processamento.
  4. O pós-processamento dos dados de saída MaxQuant é realizado pelo algoritmo hmSEEKER. Faça o download de hmSEEKER de: https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/. O script está disponível como um bloco de anotações Jupyter escrito em Python 3.7 e vem com um conjunto de dados de exemplo para fins de teste. Para novos usuários, é aconselhável baixar e instalar a plataforma Anaconda (https://www.anaconda.com/products/individual). A versão mais recente inclui, por padrão, Python 3.8, Jupyter e todos os pacotes necessários para executar o hmSEEKER (por exemplo, Scikit-learn 0.23.1).
  5. Crie uma pasta e armazene os arquivos allPeptides.txt e msms.txt da saída MaxQuant nela.
  6. Inicie o Jupyter (a partir da linha de comando ou do navegador Anaconda).
  7. Navegue até a pasta hmSEEKER e abra hmSEEKER.ipynb.
  8. Na seção Parâmetros de Entrada do bloco de anotações, indique os caminhos para o banco de dados FASTA e para a(s) pasta(s) que contém os arquivos de texto MaxQuant.
  9. Execute o código dentro de cada célula selecionando a célula e clicando no botão Reproduzir na parte superior da interface do Jupyter.
  10. O script produz um arquivo de saída separado por vírgulas para cada conjunto de dados analisado, além de um arquivo combinado. A lista final de dubletos pode ser encontrada no arquivo chamado "[date]-[time]-combined_hmSILAC_doublets_HxL_summary.csv"
    (A Tabela 4 inclui uma breve descrição das colunas na tabela de saída).

Resultados

O artigo descreve um fluxo de trabalho para a identificação de alta confiança da proteína R-metilação global, que se baseia na combinação da digestão enzimática do extrato proteico com duas proteases distintas em paralelo, seguida pelo fracionamento por cromatografia líquida de peptídeos proteolíticos HpH-RP e enriquecimento por imuno-afinidade de peptídeos R-metil com anticorpos anti-pan-R-metil (Figura 1).

As células foram cultivadas na presença ...

Discussão

A identificação de alta confiança da metilação de proteínas/peptídeos in vivo por proteômica global baseada em EM é um desafio, devido ao risco de alta FDR, com várias substituições de aminoácidos e metilesterificação ocorrendo durante o preparo da amostra que são isobáricas à metilação e podem causar atribuições erradas na ausência de estratégias ortogonais de validação da EM. A natureza subestequiométrica desse PTM complica ainda mais a tarefa da metilproteômica global, mas pode ser...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

MM e EM são estudantes de doutoramento da Escola Europeia de Medicina Molecular (SEMM). O EM é o destinatário de uma bolsa FIRC-AIRC de 3 anos (Código do Projeto: 22506). As análises globais de R-metil-proteomas no grupo TB são apoiadas pelo AIRC IG Grant (Código do Projeto: 21834).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Ammonium Bicarbonate (AMBIC)Sigma-Aldrich09830
Ammonium Persulfate (APS)Sigma-Aldrich497363
C18 Sep-Pak columns vacc 6cc (1g)WatersWAT036905
Colloidal Coomassie staining InstantSigma-AldrichISB1L-1L
cOmplete Mini, EDTA-freeRoche-Sigma Aldrich11836170001Protease Inhibitor
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS)GIBCO ThermoFisher26400-044
DL-Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich3483-12-3
DMEM MediumGIBCO ThermoFisherrequested with stabile glutamine and without methionine
EASY-nano LC 1200 chromatography systemThermoFisher
EASY-Spray HPLC ColumnsThermoFisherES907
GlyceroloSigma-AldrichG5516
HeLa cellsATCCATCC CCL-2
HEPESSigma-AldrichH3375
Iodoacetamide (IAA)Sigma-Aldrich144-48-9
Jupiter C12-RP columnPhenomenex00G-4396-E0
L-MethionineSigma-AldrichM5308Light (L) Methionine
L-Methionine-(methyl-13C,d3)Sigma-Aldrich299154Heavy (H) Methionine
LysargiNaseMerck MilliporeEMS0008
Microtip Cell Disruptor Sonifier 250Branson
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED)Sigma-AldrichT9281
Penicillin-StreptomycinGIBCO ThermoFisher15140122
PhosSTOPRoche-Sigma Aldrich4906837001Phosphatase Inhibitor
Pierce C18 TipsThermoFisher87782
Pierce  0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS GradeThermoFisher85175LC-MS Solvent B
Pierce  0.1% Formic Acid (v/v) in Water, LC-MS GradeThermoFisher85170LC-MS Solvent A
Pierce  Acetonitrile (ACN), LC-MS GradeThermoFisher51101
Pierce  Water, LC-MS GradeThermoFisher51140
PolyacrylamideSigma-Aldrich92560
Precision Plus Protein  All Blue Prestained Protein StandardsBio-Rad1610373
PTMScan antibodies α-ADMACell Signaling Technology13474
PTMScan antibodies α-MMACell Signaling Technology12235
PTMScan antibodies α-SDMACell Signaling Technology13563
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass SpectrometerThermoFisher
Sequencing Grade Modified TrypsinPromegaV5113
Trifluoroacetic acidSigma-AldrichT6508
Ultimate 3000 HPLCDionex
UreaSigma-AldrichU5378
Vacuum Concentrator 5301EppendorfSpeed vac

Referências

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