JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע נוקאאוטים של גנים שהם in vivo קטלניים עובריים בגידולים שמקורם במודלים של עכברים מהונדסים גנטית, ולאחר מכן מעריכים את ההשפעה שיש לנוקאאוט על צמיחת הגידול, התפשטותו, הישרדותו, הגירה, פלישה, והתעתיק in vitro ו- in vivo.

Abstract

פיתוח תרופות חדשות המכוונות במדויק לחלבונים מרכזיים בסרטן האדם משנה באופן יסודי את הטיפולים בסרטן. עם זאת, לפני שניתן יהיה להשתמש בתרופות אלה, חלבוני המטרה שלהן חייבים להיות מאומתים כמטרות טיפוליות בסוגי סרטן ספציפיים. אימות זה מבוצע לעתים קרובות על ידי דחיקת הגן המקודד את המטרה הטיפולית המועמדת במודל עכבר מהונדס גנטית (GEM) של סרטן וקביעת איזו השפעה יש לכך על צמיחת הגידול. למרבה הצער, סוגיות טכניות כמו קטלניות עוברית בנוקאאוטים קונבנציונליים ופסיפסיזם בנוקאאוטים מותנים מגבילים לעתים קרובות את הגישה הזו. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פותחה גישה לניצול גן קטלני עוברי מרופט בעל עניין בתרביות קצרות טווח של גידולי מעטפת עצבים היקפיים ממאירים (MPNSTs) שנוצרו במודל GEM.

מאמר זה מתאר כיצד לבסס מודל עכברים עם הגנוטיפ המתאים, להפיק תרביות גידול קצרות טווח מבעלי חיים אלה, ולאחר מכן להפוך את הגן הקטלני העוברי הפגום באמצעות וקטור אדנובירלי המבטא את Cre recombinase וחלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (eGFP). לאחר מכן מפורט טיהור של תאים שעברו התמרה באמצעות אדנו-וירוס באמצעות מיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנציה (FACS) וכימות ההשפעות שאבלציה גנטית מפעילה על התפשטות התאים, הכדאיות, השעתוק וצמיחת האלוגרפט האורתוטופי. מתודולוגיות אלה מספקות גישה יעילה וניתנת להכללה לזיהוי ואימות של מטרות טיפוליות במבחנה וב-in vivo. גישות אלה מספקות גם מקור מתחדש של תאים שמקורם בגידולים בעלי מעבר נמוך עם תוצרי גדילה מופחתים במבחנה . זה מאפשר לחקור את התפקיד הביולוגי של הגן הממוקד בתהליכים ביולוגיים מגוונים כמו הגירה, פלישה, גרורות ותקשורת בין-תאית המתווכת על ידי הסוד.

Introduction

לפני שני העשורים האחרונים, הטיפול בסרטן אנושי הסתמך במידה רבה על הקרנות וחומרים כימותרפיים שהתמקדו באופן נרחב באוכלוסיות תאיות המתרבות במהירות על ידי פגיעה בדנ"א או עיכוב סינתזת DNA. אף על פי שגישות אלה אכן עיכבו את צמיחת התאים הסרטניים, היו להן גם תופעות לוואי מזיקות על סוגי תאים נורמליים המתרבים במהירות, כגון תאי אפיתל במעיים ותאי זקיק שיער. לאחרונה, הטיפול בסרטן החל להשתמש בחומרים כימותרפיים המכוונים במדויק לחלבונים בתוך מסלולי איתות שהם בעלי חשיבות קריטית לצמיחת הניאופלזמה של המטופל הבודד. גישה זו, המכונה בדרך כלל "רפואה מדויקת", הובילה לפיתוח רפרטואר הולך ומתרחב של נוגדנים חד שבטיים ומעכבים מולקולריים קטנים. חומרים אלה מעכבים ביעילות את התפשטותם והישרדותם של תאי הגידול תוך הימנעות מתופעות הלוואי המזיקות על סוגי תאים תקינים הנראים בחומרים כימותרפיים קונבנציונליים ובהקרנות. נוגדנים חד-שבטיים המשמשים לטיפול בסרטן אנושי מתמקדים בדרך כלל במולקולות של פני השטח של התא, כגון קולטני גורם גדילה1 (למשל, המשפחה הגדולה של קולטן טירוזין קינאזות המשתרעות על פני ממברנה) ומודולטורים של תגובה חיסונית2 (למשל, חלבון מוות תאי מתוכנת 1, ליגנדת מוות מתוכנתת 1). מעכבים מולקולריים קטנים יכולים לעכב חלבונים על פני התא או חלבוני איתות הממוקמים בתוך התא3. עם זאת, כדי להשתמש ביעילות בחומרים טיפוליים חדשים אלה, יש לקבוע כי סרטן מסוים תלוי במולקולה הממוקדת על ידי סוכן טיפולי מועמד.

למרות שלסוכנים טיפוליים חדשים אלה יש השפעות ממוקדות יותר, רבים מהם עדיין מעכבים את פעולתו של יותר מחלבון אחד. בנוסף, סוכנים מרובים עם יעילות וספציפיות משתנות זמינים לעתים קרובות כדי להתמקד בחלבון מסוים. כתוצאה מכך, במהלך חקירות פרה-קליניות, כדאי להשתמש בגישות נוספות כגון אבלציה גנטית כדי לאמת חלבון מועמד כמטרה טיפולית. גישה שימושית במיוחד לאימות חלבון כמטרה טיפולית היא לנטרל את הגן המקודד את החלבון המועמד במודל חייתי מהונדס גנטית המפתח את סוג העניין הספציפי של הסרטן. גישה זו יכולה להיות פשוטה יחסית אם עכברים עם מוטציה אפסית (או מוטציה טבעית, מוטציה null מהונדסת גנטית ["נוקאאוט"], או מוטציה null שהוכנסה על ידי מלכודת גנים) זמינים, והעכברים הם בני קיימא לבגרות. למרבה הצער, עכברים עם מוטציה אפסית העונים על קריטריונים אלה לרוב אינם זמינים, בדרך כלל משום שמוטציית האפס גורמת למוות באופן עוברי או בימים הראשונים של החיים שלאחר הלידה. בנסיבות אלה, עכברים הנוטים לפתח את סוג העניין של הגידול עשויים במקום זאת להיות מוצלבים לעכברים שבהם מקטעים מרכזיים של הגן המעניין מוקפים על ידי אתרי loxP ("floxed"), מה שמאפשר לגן להיות אבלציה על ידי החדרת טרנסגן המבטא Cre רקומבינאז לתוך תאי הגידול (נוקאאוט מותנה). גישה זו מספקת מספר יתרונות. ראשית, אם קיים נהג Cre זמין המתבטא בגידול אך לא בסוג התא שהוביל למוות בנוקאאוטים קונבנציונליים, גישה זו יכולה לאמת את המטרה הטיפולית המועמדת. שנית, ניתוק הגן המקודד את החלבון המועמד בתאי הגידול, אך לא באלמנטים תוך-סרטניים אחרים כגון פיברובלסטים הקשורים לגידול או תאי חיסון, מאפשר לחוקר להבחין בין השפעות אוטונומיות של התאים לבין השפעות לא-אוטונומיות-תאיות של המטרה הטיפולית. לבסוף, נהג Cre (CreERT2) הניתן להשראה של טמוקסיפן מאפשר לחוקר למחוק את הגן המעניין בשלבים שונים בהתפתחות הגידול ולהגדיר את החלון שבו הסוכן הטיפולי המועמד הוא בעל הסבירות הגבוהה ביותר להיות יעיל.

למרבה הצער, יש גם בעיות טכניות שיכולות להגביל את השימוש בנוקאאוטים מותנים בגידולים הנובעים במודלים של GEM. לדוגמה, ייתכן שנהג Cre המתבטא בתאי הגידול ונמנע ממחיקת גנים בתאים תקינים החיוניים לחיים אינו זמין. בעיה נוספת, שניתן לזלזל בה, היא שנהגי Cre ו-CreERT2 לעתים קרובות מתבלים באופן משתנה אללים מרופטים בעכברים, וכתוצאה מכך נוצר פסיפס למוטציה האפסית בסרטן GEM. כאשר זה קורה, תאים סרטניים שבהם הגן הממוקד לא היה אבלציה ימשיכו להתרבות במהירות, להגדיל את תאי הגידול עם אללים אבלים. פסיפס בקווי הנהג של Cre יכול להתרחש עקב ביטוי Cre שאינו בכל מקום בשושלת הממוקדת ועל ידי רקומבינציה כושלת בתאים בודדים ללא תלות בביטוי Cre4. זוהי תופעה ידועה של נהגי Cre התלויה בסוג התא ויש לקחת אותה בחשבון במהלך תכנון הניסוי ופרשנות הנתונים. פסיפסיזם יכול להסוות את השפעת הנוקאאוט ולהוביל חוקר למסקנה שגויה כי הגן המעניין אינו חיוני להתרבות ו/או להישרדות של תאי הגידול ולכן אינו מטרה טיפולית תקפה.

כמה מהבעיות הללו נתקלו במחקר קודם שניסה לקבוע אם הקולטן טירוזין קינאז erbB4 היה מטרה טיפולית פוטנציאלית בתאי MPNST5. במחקרים אלה נעשה שימוש בעכברים המבטאים טרנסגן המקודד את גורם הגדילה האיזופורמי של הנוירגולין-1 (NRG1) β3 (GGFβ3) תחת שליטתו של מקדם האפס של חלבון המיאלין הספציפי לתאי שוואן (P 0-GGFβ3). עכברי P 0-GGFβ3 מפתחים נוירופיברומות פלקסיפורמיות מרובות שמתקדמות והופכות ל- MPNSTs באמצעות תהליך המשחזר את התהליכים של נוירופיברומה פתוגנזה והתקדמות נוירופיברומה-MPNST פרספקסית שנראית בחולים עם תסמונת רגישות הגידול האוטוזומלית הדומיננטית נוירופיברומטוזיס סוג 1 (NF1)6. כאשר נחצה לעכברים עם מוטציה אפסית Trp53, וכתוצאה מכך P 0-GGFβ3; Trp53+/- עכברים מפתחים MPNSTs דה נובו כפי שניתן לראות ב- cis-Nf1+/-; Trp53+/- עכברים.

MPNSTs אלה מסכמים את ההתקדמות מארגון הבריאות העולמי (WHO) דרגה II לנגעים בדרגה IV של ארגון הבריאות העולמי שנראו בבני אדם7. בעכברי P 0-GGFβ3, MPNSTs מופיעים בתוך נוירופיברומות פרספקס קיימות בעצב הטריגמינלי (58%) ובשורשי העצב הגבי בעמוד השדרה (68%)7; ה- MPNSTs הנובעים מ- P 0-GGFβ3; לעכברים Trp53+/- יש התפלגות דומה מאוד. בבני אדם, MPNSTs מופיעים בדרך כלל בעצב הסיאטי ואחריו מקלעת הברכיאל, שורשי העצבים בעמוד השדרה, הוואגוס, הירך, החציון, מקלעת העצה, האובטורטור הפופליטי, והעצבים הטיביאליים והאולנאריים האחוריים8. התפלגות גידול זו במודלים אלה של GEM שונה במקצת ממה שרואים בבני אדם. עם זאת, ה- MPNSTs המתעוררים ב- P 0-GGFβ3 ו- P0-GGFβ3; עכברי Trp53+/- זהים מבחינה היסטולוגית ל-MPNSTs אנושיים, נושאים רבות מאותן מוטציות שנראו ב-MPNSTs אנושיים, ומשחזרים את תהליך התקדמות הנוירופיברומה-MPNST שנראה בחולי NF1. הדור של P 0-GGFβ3 או P0-GGFβ3; Trp53+/- עכברים שהיו Erbb4-/- לא היה אפשרי מכיוון שעכברים עם שני אללים ריקים של Erbb4 מתים ברחם ביום העוברי 10.5 משני למומים לבביים9. מכיוון שהצלת ביטוי Erbb4 בלב על ידי החדרת טרנסגן Erbb4 ספציפי ללב (שרשרת כבדה α-מיוזין (MHC)-Erbb4) גורמת לעכברים Erbb4-/- 10 בני קיימא, דור העכברים עם P 0-GGFβ3 מסובך; Trp53+/-;α-MHC-Erbb4; Erbb4-/- ניסה גנוטיפ.

עם זאת, ההזדווגויות לא הניבו עכברים ביחסים המנדליאניים הצפויים, מה שמעיד על כך שהגנוטיפ הרצוי היה מזיק. לכן, הדור של P 0-GGFβ3; Trp53+/- עכברים עם אללים Erbb4 11 ונהג CreERT2 ניסה לאפשר את המחיקה של Erbb4 ב- MPNSTs הנובעים מעכברים אלה. בבעלי חיים אלה, תאי גידול רבים עם אללים שלמים Erbb4 עדיין היו נוכחים (פסיפס). הפסיפס שנצפה יכול לנבוע ממתן טמוקסיפן לא יעיל, מה שהביא להבדלים ביעילות הרקומבינציה בתוך הרקמה. האפשרות של מנגנוני פיצוי ספונטניים עשויה לתרום עוד יותר לפסיפסיזם ברקומבינציה בתיווך טמוקסיפן על ידי עקיפת הדרישה לביטוי Erbb4. זה אפשרי כי אובדן של Trp53 הופך את תאי הגידול רגישים למוטציות "מתירניות" ספונטניות נוספות שעלולות לבלבל את הפרשנות של הנתונים. מכיוון שנראה היה סביר שתאי ה-MPNST השלמים של Erbb4 יסתירו את ההשלכות של התבלטות Erbb4 בתאי גידול אחרים, גישה זו נזנחה.

מכשולים אלה הובילו לפיתוח מתודולוגיה להפלת Erbb4 בתאי MPNST במעבר מוקדם מאוד באמצעות אדנו-וירוס המבטא Cre רקומבינאז ו- eGFP. ניתן להפריד בין תאים אלה לבין תאים שאינם נגועים באמצעות FACS, מה שמפחית במידה ניכרת את הפסיפסיות של הגן Erbb4 האבל. להלן מתוארות השיטות המשמשות להשגת מטרה זו, יחד עם השיטות המשמשות להערכת ההשפעות של אבלציה גנטית במבחנה וב - in vivo. הפרוטוקול הבא הוא דוגמה כיצד לייצר עכברים נושאי גידול המניבים גידולים הנושאים אללים מרופטים של גנים קטלניים עובריים בעלי עניין לכריתת ex vivo לפני הערכת גדילת הגידול in vivo allograft. זה כולל תיאור של הגישות המשמשות לניתוח ההשפעה שאבלציה Erbb4 מפעילה על התפשטות תאי הגידול, הישרדותם וביטוי גנים במבחנה והתפשטות, הישרדות ואנגיוגנזה באלוגרפטים אורתוטופיים.

Protocol

לפני ביצוע הליכים כלשהם עם עכברים, כל ההליכים חייבים להיבדק ולאשר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים. הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית של דרום קרוליינה. פרוטוקול זה בוצע על ידי צוות מיומן כראוי בהתאם להנחיות המוסדיות של MUSC לטיפול בבעלי חיים.

1. דור של עכברים שמפתחים MPNSTs הומוזיגוטיים עבור אללים Erbb4 flox

  1. לייצר את הדור F1 של P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/+ בעלי חיים על ידי הזדווגות P 0-GGFβ3; Trp53+/- עכברים7 עם עכברי Erbb4fl/fl 11. השתמשו בריבוע Punnett (איור 1) כדי להנחות את ערכת הרבייה כדי להבטיח שמספיק גורי F1 זכרים ונקבות ייווצרו עם P 0-GGFβ3 הרצוי; Trp53+/-; Erbb4fl/+ גנוטיפ.
  2. צאצאי גנוטיפ F1 על ידי בידוד דנ"א גנומי מחיתוך זנב שנאסף בהתאם להנחיות IACUC ולאחר מכן לבצע PCR באמצעות פריימרים שתוארו קודם לכן כדי לזהות את האללים מסוג P 0-GGFβ3טרנסג'ין 12, Trp53 מסוג בר (+) ו-null (-) אללים7, ו-Erbb4flox ו-Erbb4 אללים מסוג בר13.
    1. לבודד דנ"א זנב בשיטות המפורטות על jacks-lab.mit.edu/protocols.
    2. צור את תערובת תגובת ה-PCR עם דנ"א של 25 ננוגרם, 0.25 ננומטר dNTPs, 0.02 U/μL Taq, 0.5 μM של כל פריימר ו-1x PCR buffer. בצע תגובת PCR עם דגירה אחת של 95 °C (כדי להמיס את הדנ"א הגנומי ולהפעיל את Taq) במשך דקה אחת ואחריה 35 מחזורי PCR של 94 °C ( 94 ° C, 10 s (התכה); 55 מעלות צלזיוס, 30 שניות (חישול); 72 מעלות צלזיוס, 40 שניות (הרחבה) ואחריה 72 מעלות צלזיוס (הרחבה) אחת למשך 5 דקות. אחסנו את התגובות ב-4 מעלות צלזיוס עד שיהיו מוכנים להפעלה על ג'ל אגרוז 1.2-1.5%.
      הערה: טמפרטורת החישול תלויה במערכת מאגר PCR המשמשת; מומלץ לבצע שיפוע טמפרטורת חישול כדי לקבוע את טמפרטורת החישול המתאימה.
  3. לייצר את דור F2 של P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/fl animals על ידי הזדווגות של צאצאי F1 המתאימים (P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/+) אחד עם השני.
    הערה: איור 1 ממחיש את התחזיות הריבועיות של Punnet המשמשות לחישוב המספר הצפוי של צאצאי F2 עם הגנוטיפ הרצוי.
  4. זהה בעלי חיים עם P 0-GGFβ3 הרצוי; Trp53-/+; Erbb4fl/fl גנוטיפ כמתואר בשלב 1.2.
  5. צאצאי Mate F2 זה לזה כדי לשמור על P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/fl colony וגנוטיפ כל הגורים. אשרו כי האלל החדש שהוצג אינו פוגע בהישרדות או בהשהיית הגידול. השג זאת על ידי הקמת קבוצות (20 עכברים/קוהורטות) של P 0-GGFβ3; Trp53+/- ו-P 0-GGFβ3; Trp53+/-; עכברי Erbb4fl/fl ועוקבים אחר הישרדותם ותדירות התרחשות הגידול שלהם.
  6. עקוב אחר בעלי חיים מספר פעמים בשבוע עד להגעה לנקודת הקצה הניסויית (גודל הגידול המרבי המותר / נקודת הקצה ההומאנית שאושרה על ידי IACUC).
    1. במהלך הניטור השבועי, העריכו את משקל הגוף, התנהגות חברתית וטיפוח תקינה ומדידות גודל הגידול. ארגן הערכה וטרינרית במקרה של ירידה במשקל של >10% ממשקל הגוף, בידוד חברתי וחיבוק.
    2. כאשר עכבר נושא גידול מזוהה והגיע לנקודת הקצה ההומאנית שלו, הרדימו את החיה באופן הומאני באמצעות שאיפת פחמן דו חמצני ולאחר מכן נקע צוואר הרחם והסירו את הגידול באופן סטרילי באמצעות סכין אזמל. קח מדידות גידול על ידי מדידת אורך, רוחב ועומק באמצעות גידול קליפר ומשקל (מסה ונפח). עבוד במהירות כדי למנוע אוטוליזה.
  7. חתכו את הגידול לשלושה חלקים תוך שימוש בחיתוכים בסגנון לחם עם סכין אזמל בתנאים סטריליים כדי ליצור מקטעי רקמה לקיבוע פורמלין/הטבעת פרפין (FFPE), יצירת תרביות מעבר מוקדמות וחומר קפוא הבזק (איור 2A).
    1. ודא כי סעיף 1 (ליצירת תרביות מעבר מוקדמות, שלב 1.7.2) הוא כ -10% מנפח הגידול הכולל, סעיף 2 (עבור קיבוע ו- IHC, שלב 1.7.3) הוא 70% מנפח הגידול הכולל, וסעיף 3 (עבור הקפאת הבזק, שלב 1.7.4) הוא 20% מנפח הגידול הכולל.
    2. קח את סעיף 1 של הגידול להכנת תרביות מעבר מוקדמות (ראה להלן).
    3. תקן את סעיף 2 של הגידול ב 4% paraformaldehyde לילה ב 4 ° C ולאחר מכן להטביע פרפין (פורמלין קבוע פרפין מוטבע (FFPE) לעבודה אבחון.
    4. החלק 3 של הקפאת הבזק לניתוחים אנליטיים (למשל, אימונובלוטים כדי לוודא שחלבון המקודד על ידי הגן הממוקד של פלוקס מבוטא כראוי).
  8. כתם 5 מיקרומטר מקטעי רקמת FFPE בעובי של 5 מיקרומטר עם המטוקסילין ואוזין (H&E) כדי לאשר את אבחנת הגידול על ידי פתולוג מוסמך. במידת הצורך, בצע צביעה אימונוהיסטוכימית (IHC) כדי לאשר את אבחנת הגידול.
    1. MPNSTs של אימונוסטין עבור S100 חלבון קושר סידן B (S100β), נסטין ואזור קביעת מין Y (SRY)-גורם שעתוק תיבה 10 (Sox10)-שלושה סמנים המתבטאים הן ב- MPNSTs והן בתאי שוואן (מקור תאי הגידול)5,6,14,15. הכתימו את הגידולים בנוגדנים המזהים את erbB4, החלבון המקודד על ידי הגן המיועד לאבלציה במדרגות במורד הזרם.
    2. כדי לאשר את האבחנה, בקשו מווטרינר מוסמך או פתולוג אנושי להעריך את כל שקופיות הגידול המוכתמות בהתאם לקריטריונים לאבחון ודירוג של ארגון הבריאות העולמי 5,6,7,16.

2. אבלציה Ex vivo של אללים Erbb4 מפוקסלים בתאי MPNST

  1. צרו תרביות מעבר מוקדמות מרקמת MPNST שזה עתה נאספה על ידי הנחת הרקמה ממקטע 1 (שלב 1.7.3) ב-10 מ"ל של מלח סטרילי עם חציצת פוספט (PBS) קר כקרח על קרח, ולאחר מכן העברתה לאזור עבודה סטרילי (איור 2B)16.
    הערה: כל ההליכים הבאים יבוצעו במכסה מנוע של תרבית רקמה סטרילית.
  2. מצמצמים את רקמת הגידול לחתיכות של 2-4 מ"מ ומקצינים 8-10 פעמים בצלחת תרבית רקמה מטופלת של 10 ס"מעם 10 מ"ל של מדיום גדילה. תרבית תכשירים אלה במדיום גדילה DMEM-10 עתיר גלוקוז (מדיום הנשר המהונדס של דולבקו (DMEM) המכיל 10% סרום עגל עוברי, 1% גלוטמין, סטרפטומיצין של 10 מיקרוגרם/מ"ל ו-10 יב"ל/מ"ל פניצילין) בתוספת 10 ננומטר נוירגולין-1β (NRG1β) ו-2 מיקרומטר פורסקולין. הוסף פורסקולין בשלב זה כדי לעכב את הצמיחה של סוגי תאים מזהמים נפוצים כגון פיברובלסטים.
  3. שמור על הרקמה והתאים המנותקים מכנית עד 3 ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספרה של 5% CO2 כדי ליצור תרבית מעבר מוקדמת. אין להפריד בין תאים מפוזרים לבין שברי רקמות שנותרו בשלב זה.
  4. רענן את התרבויות עם מדיום חדש כל 3-4 ימים. אפשרו לתאי הגידול להתרבות עד שהם נפגשים.
  5. הרחב את תרבויות המעבר המוקדמות על ידי פיצול תרבויות המפגש למספר מנות. הסר את מדיום הגדילה ושטפו תאים עם 1x dPBS. לאחר מכן, הוסיפו 1 מ"ל של 0.25% טריפסין למשך 2-5 דקות בטמפרטורת החדר לכל צלחת תרבית תאים מטופלת של 10 ס"מ2 . בצעו טריטורציה עדינה של התרבית כדי להקל על הניתוק וליצור תרחיף חד-תאי.
    1. סיים את הטריפסיניזציה על ידי הוספת 2 מ"ל של מדיום הצמיחה DMEM-10. לאסוף את תערובת התאים tripsinized ולהעביר אותו לצינור צנטריפוגה סטרילית 5 מ"ל. גלול את התאים על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 500 × גרם בטמפרטורת החדר.
    2. החייאת גלולת התא ב-5 מ"ל של DMEM-10. פצלו את התאים לשתיים עד ארבע מנות תרבית תאים בקוטר 10 ס"מ, שכל אחת מהן מכילה 10 מ"ל של מדיית גדילה (כ-1 ×-106 תאים בכל מנה).
  6. לאחר 5 קטעים (חזרה על שלבים ב-2.5), השתמש במדיום גדילה ללא NRG1β ופורסקולין. Immunostain דגימה של התרבית עם נוגדן anti-S100β כדי לוודא שהתרבית מורכבת אך ורק מתאי הגידול. שמור על התאים במדיום הגדילה DMEM-10 בכל המעברים הבאים.
  7. בקטע הבא, ספרו את התאים והקפיאו חלק מ-P 0-GGFβ3; Trp53+/-; תאי Erbb4fl/fl MPNST שנאספו מתרביות מפגש (3 × 106 תאים/בקבוקון).
  8. לוח P 0-GGFβ3; Trp53+/-; תאי MPNST במעבר מוקדם של Erbb4fl/fl בצפיפות של 1.5 × 106 תאים לכל צלחת תרבית תאים מטופלת של 10 ס"מ במדיום גדילה DMEM-10.
  9.  יום 0: (כ-12-16 שעות לאחר הציפוי), שטפו את תרביות הדבק עם 2-4 מ"ל של dPBS והזיקו ב-Ad5CMV-Cre/eGFP או Ad5CMV-eGFP בכ-400 יחידות יוצרות פלאק (pfu)/תא ב-10 מ"ל של DMEM ללא סרום (כלומר, 30 μL של 2 × 1010 pfu של וירוס לכל מנה של 10 ס"מ). בטל את אללי Erbb4 המנומרים באמצעות אדנו-וירוס בריכוז הנגיף המרבי הנסבל (ריבוי זיהום, MOI), כפי שנקבע באופן אמפירי. עיין באיור 2C לקבלת שרטוט של זרימת העבודה עבור אבלציה זו.
  10. יום 1: כ-16 שעות לאחר מכן, הצילו את התרביות על ידי הוספת 10 מ"ל של DMEM-10 לקוקטייל ההדבקה.
  11. יום 2 - 3: FACS ממיין תאים נגועים בהתאם לפרוטוקול המומלץ ממתקן הליבה כדי למיין תאים חיוביים ל-eGFP כ-48 שעות לאחר ההדבקה. לפני מיון ה-FACS, בדקו לזמן קצר את אות ה-eGFP במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לוודא שהתרביות נדבקו ביעילות (כ-50-100% תאים חיוביים). תאים חוזרים שהתאוששו לאחר FACS למנות תרבית רקמה של 10 ס"מ; שמור מנה אחת לבידוד דנ"א גנומי.
  12. יום 4 - 5: לאחר מיון FACS, תנו לתאים להתאושש באינקובטור תרבית רקמה למשך 24-48 שעות לפחות, ולאחר מכן הכינו את התאים לניתוחים מבוססי תאים במבחנה או להשתלת in vivo . אשר את מחיקת Erbb4 באמצעות PCR באמצעות דנ"א גנומי שבודד מחלק מהתאים החיוביים ל-eGFP הממוינים. ודא שתאים חיוביים ל-eGFP הם שליליים ל-ErbB4 על ידי PCR או על ידי חיסון דגימה של התרבית עם נוגדן נגד erbB4.
    1. בודדו את הדנ"א הגנומי מהתאים באמצעות שיטת בידוד DNA סטנדרטית של חומצה-גואנידיניום-פנול ושיטת בידוד DNA מבוססת כלורופורם17.
    2. בצע PCR סטנדרטי כדי להבחין בין אללים Erbb4 מרופדים לבין אללים Erbb4 עם אבלציה. בצע 40 מחזורים עם דנ"א של 2 ננוגרם, 20 פריימרים של μM 1 + 2 כדי לייצר מכפלה של 250 bp Erbb4-null ותוצר של 350 bp floxed13. בצע גם גישות PCR וגם גישות מבוססות נוגדנים כדי לאשר נוקאאוט כאשר אין נוגדנים אמינים זמינים.
      הערה: תאים מוכנים לבדיקות מבוססות תאים במבחנה כמתואר להלן. סוגים רבים של ניתוחים במורד הזרם יכולים להתבצע עם תאים מוכנים באופן זה. מטרת הפרוטוקולים המוצגים להלן היא לספק כמה דוגמאות ליישומי in vitro ו- in vivo של תאי הגידול הללו לאחר אבלציה של הגן Erbb4 .

3. מבחני התפשטות וכדאיות בתאי MPNST עם אללים Erbb4 עם אבלציה

  1. בצע מבחני התפשטות במהלך שבעת הימים הבאים על תאי MPNST ממוינים המצופים בלוח מולטיוול באמצעות ציטומטר אוטומטי מבוסס תמונה.
    1. יום 6: צלחת 2,000 תאים לבאר בנפח סופי של 150 μL (כ-13,300 תאים/מ"ל) של מדיום גדילה בצלחת של 96 בארות. בצע מדידות במשולש עבור כל קבוצת ניסוי ו-4 קריאות יומיות של נקודות קצה (3 שכפולים x 2 תנאים x 4 ימים).
    2. ימים 7, 9, 11, 13: מכתימים את התאים בצבעי Hoechst ו-propidium iodide (PI) ומדמיינים אותם על קורא צלחות אוטומטי כדי לספור את מספר התאים החיים והמתים בכל באר. כדי להשיג זאת, הכתימו בו זמנית את התאים בצבע Hoechst כדי להכתים את הגרעינים של תאים חיים ומתים כאחד ועם פרופידיום יודיד (PI) כדי לתייג את התאים המתים. בצע את כל הקריאות באותה השעה בכל יום או בכל יום אחר.
      1. הוסיפו 50 μL של תמיסת צביעה של 4x PI/Hoechst (4 מיקרוגרם/מ"ל כל אחד) לכל תמיסת צביעה של 4x PI/Hoechst (4 מיקרוגרם/מ"ל כל אחד) לכל באר שכמתה באותו יום (למשל, יום 7 בלבד), ודגרו למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרביות הרקמה. שמור על הצלחת מוגנת מפני אור.
        הערה: ריכוז הכתם של Hoechst צריך להיות מוגדר באופן אמפירי ויכול לנוע בין 1 ל-10 מיקרוגרם/מ"ל בהתאם לסוג התא.
      2. קרא את הבארות המוכתמות לאחר הדגירה באמצעות הערוץ הפלואורסצנטי המתאים במצלמת התא האוטומטית. לאחר הקריאה, החזירו את הצלחת לחממה לקריאה עתידית בימים שלאחר מכן (כלומר, ימים 9, 11, 13).
      3. לכמת את עוצמות הכתם בהתבסס על מערכת ההדמיה שבה נעשה שימוש וחשב את מספר התאים המתים, התאים החיים וסך התאים באמצעות ההגדרות הבאות: תעלה כחולה (377/50 ננומטר, Hoechst): סך התאים (חיים ומתים); ערוץ אדום (531/40 ננומטר, PI): תאים מתים בלבד; כחול - אדום (סה"כ - מת) = תאים חיים.
  2. בצע את בדיקת הכדאיות של התא במשך שלושה ימים, אם תרצה בכך, בהתאם לפרוטוקול של יצרני הבדיקה.
    הערה: ניתן לשלב מבחני כדאיות עם מבחני התפשטות על ידי ביצוע כתם משולש הכולל קלצין AM (488/32 ננומטר; תעלה ירוקה, במיוחד תוויות תאים חיים), PI ו- Hoechst. בדיקת אפופטוזיס עשויה להתבצע גם באמצעות תרביות שהוגדרו כמתואר לעיל; הפרוטוקול הספציפי יהיה תלוי במערכת ההדמיה.
    1. יום 6: צלחת 4,000 תאים לבאר בנפח סופי של 150 μL בצלחת של 96 בארות במשולש.
    2. ימים 7 - 9: הוסיפו 2,000 ריאגנטים לבדיקת כדאיות של תאים ביולומינסנטיים (טבלת חומרים), החזירו את הצלחת לחממה וקראו את הצלחת כעבור שעה. בצע את הקריאות הבאות באותה השעה בכל יום. עבור מבחני bioluminescence (MTT), בצע את הבדיקה בדיוק כפי שמתואר בהוראות היצרן כל 24 שעות במשך 72 שעות באמצעות קורא לוחות לומינומטר.

4. ניתוח RNA-Seq וזיהוי של גנים שהביטוי שלהם משתנה על ידי אובדן Erbb4

  1. יום 6: בודדו את הרנ"א הכולל מתאי MPNST ממוינים באמצעות שיטות סטנדרטיות המבוססות על חומצה-גואנידיניום-פנול וכלורופורם. לניסויים שנועדו לזהות שינויים ברמות ה-mRNA בין שתי קבוצות, הכינו רנ"א כולל משלושה שכפולים ביולוגיים לפחות בכל קבוצה.
    1. כדי למנוע אירועים הנגרמים על ידי וקטור אדנו-ויראלי או ביטוי eGFP ולא על ידי אובדן Erbb4, לבודד RNA משלושה שכפולים ביולוגיים של P 0-GGFβ3; Trp53+/-; תאי MPNST מסוג Erbb4fl/fl הומרו עם Ad5CMV-Cre/eGFP ושלושה שכפולים ביולוגיים שעברו טרנספורמציה עם Ad5CMV-eGFP.
      הערה: רנ"א מבודד חייב להיות בעל ציון של מספר שלמות RNA (RIN) ≥ 8 לניתוח RNA-Seq. ודא שליבת הריצוף קובעת את ה- RIN של כל הדגימות לפני בניית ספריות.
  2. השתמש ב- 100-200 ננוגרם של RNA כולל באיכות גבוהה מכל דגימה כדי להכין ספריות RNA-Seq (עבוד עם מתקן ריצוף הליבה עבור שלב זה). בצע ריצוף בתפוקה גבוהה באמצעות רצף דנ"א מהדור הבא. עבור כימות mRNA, בצע ריצוף חד-צדדי כדי ליצור קבצי Fastq. הבטיחו מינימום של 50 מיליון קריאות עבור כל דגימה.
    הערה: עיין באיור 3 לקבלת שרטוט הממחיש את זרימת העבודה המשמשת לעיבוד נתוני RNA-Seq ולכימות הביטוי של תעתיקים המבוטאים באופן דיפרנציאלי. נתוני רצף, בצורה של קבצי Fastq, כפופים להליכי בקרת איכות; >80% מהקריאות אמורות להניב ציון Phred של 30 כדי להיחשב מתאים לניתוח הבא. הרצפים גם מעובדים מראש (גזומים) באמצעות Trimmomatic18 כדי להסיר רצפי מתאמים ולסנן קריאות באיכות נמוכה.
  3. בצע יישור וניתוח של RNA-Seq על הקבצים שנוצרו על ידי fastq באמצעות כל תוכנה בעלת יכולת (לדוגמה, DNAStar19,20 או Partek21). בצע את השלבים הספציפיים לתוכנית באמצעות הגדרות ברירת המחדל כדי ליישר את קבצי fastq לגנום הפניה לעכבר (GRCm38/mm10).
    הערה: באמצעות DNAStar כדוגמה, זרימת העבודה הכללית מתוארת להלן (איור משלים 1).
    1. בחר את שיטת הניתוח, RNA-Seq.
    2. בחר את גנום הייחוס, עכבר.
    3. העלה את קובץ BED אם הוא מסופק על-ידי ליבת הריצוף.
    4. העלה את קבצי הריצוף של fastq, והקצה להם שמות ייחודיים המשוכפלים.
    5. שכפול קבוצתי של קבצי fastq וייעד אותם לקבוצת שכפול (כלומר, GFP, CRE)
      הערה: לכל תוכנית יישור יש את השלבים הספציפיים שלה, ועל המשתמש להתייעץ עם מדריך למשתמש בתוכנית עבור הפרוטוקול הספציפי לתוכנית. לאחר מכן, התוכנית תיצור נתוני ספירת גלם ספציפיים לגנים מקבצי Fastq אלה.
  4. בצע ניתוח סטטיסטי וסלמול (DESeq2, EdgeR) על נתוני הספירה הגולמית באמצעות כל תוכנה בעלת יכולת, כמתואר ב- 4.3, כאשר הדגימה Ad5CMV-eGFP מוגדרת כמערכת נתוני הבקרה ו- Ad5CMV-Cre מוגדרת כנתוני הבדיקה כדי לזהות אותות ביטוי גנים דיפרנציאליים עם הספק סטטיסטי חזק 22,23.
    1. בחר קבצי GFP fastq כמערכת נתוני הבקרה.
    2. בחר DESeq2 כשיטת הסטטיסטיקה והנורמליזציה .
    3. התחל הרכבה וניתוח.
      הערה: לכל תוכנית יישור יש את השלבים הספציפיים שלה, ועל המשתמש להתייעץ עם מדריך למשתמש בתוכנית עבור הפרוטוקול הספציפי לתוכנית. לאחר מכן, התוכנית תיצור נתוני ספירת גלם ספציפיים לגנים מקבצי Fastq אלה. הניתוח הסטטיסטי והנורמליזציה הוא שלב מובנה בתוכניות רבות, כפי שמוצג בדוגמה כאן, בתוך פרוטוקול יישור הרצף. אם נעשה שימוש בתוכנת יישור רצף חלופית שאינה מציעה את השלב המובנה הבא, בצע את הניתוח הסטטיסטי והנורמליזציה על נתוני הספירה הגולמית ברמת המסוף באמצעות חבילות הקידוד DESeq2 או EdgeR שנכתבו ב- R, הזמינות באופן חופשי להורדה ב- Bioconductor.org.
  5. השתמש בגישות אלה כדי לזהות שינויים המייצגים עלייה או ירידה של פי 1.5 לפחות ביחס לבקרה (במקרה זה, תאים שעברו טרנספורמציה עם נגיף Ad5CMV-eGFP). השתמש רק באותם גנים המבוטאים באופן דיפרנציאלי (DEGs) שנקבעו כמובהקים סטטיסטית המראים שינויים ≥ פי 1.5 וערך p 0.05 או padj של 0.1 לניתוח העשרה תפקודית לאחר מכן.
    הערה: פעולה זו תיצור רשימה של גנים של DEG והכוח הסטטיסטי שלהם לניתוח העשרה תפקודי.
  6. בצע ניתוח העשרה תפקודי על DEG בתיווך Erbb4 בעל מובהקות סטטיסטית המזוהה ב-4.4 עם קובץ רשימת גנים מדורג באמצעות כל אחד מהכלים מבוססי האינטרנט הזמינים באופן חופשי. קביעת משמעות ביולוגית ומסלולית של אובדן גנים Erbb4 באמצעות מערכי נתונים אונטולוגיים של גנים המשולבים בכלי ניתוח העשרה פונקציונליים בגישה פתוחה אלה 24,25,26,27 (ראו לדוגמה את טבלת החומרים ואת איור 3 לזרימת עבודה לדוגמה באמצעות Panther).
    1. ייצא את הנתונים שהתקבלו בשלב 4.4 כגיליון אלקטרוני.
    2. דרג את הנתונים לפי שינוי קיפול log2, ערך p/padj או שניהם.
    3. הקפד להסיר את כל הנתונים שאינם מובהקים סטטיסטית.
    4. ייצא את רשימת הגנים המדורגים עם מזהה גנים רק כקובץ .txt והעלה אותה לאתר האינטרנט.
      הערה: השתמש רק ב- DEG מובהק סטטיסטית (ערכי p/padj < 0.05 או 0.1, בהתאמה) כדי ליצור רשימת גנים של קלט מדורג באמצעות שינויים בקיפול log2 (הגבוה ביותר עד הנמוך ביותר), ערכי p/padj (הנמוך ביותר לגבוה ביותר) או שניהם [(-log10(pval)*sign(log2FC)]. ישנן מספר גישות ליצירת רשימת גנים מדורגת והיא נקבעת באופן אמפירי עבור מערך הנתונים והשאלה הנשאלת. הסוג הספציפי של כלי ניתוח העשרה תפקודי שבו נעשה שימוש יכול גם לסייע בקביעת הסוג המתאים של רשימת הגנים בדרגה. לקבלת משאבים נוספים על RNA-Seq, ראה את המאמרים הבאים 28,29,30.

5. אלוגרציה אורתוטופית של תאי MPNST עם אללים Erbb4 אבלציה וניתוח של ההשפעות של אבלציה Erbb4

  1. לפני ביצוע אלגרינג אורתוטופי של תאי MPNST ממוינים, ודא שכל ההליכים נבדקים ומאושרים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים, וכי כל ההליכים מבוצעים על ידי כוח אדם מיומן כראוי.
  2. ביום ההזרקה, הסר תאי מעבר נמוכים (כ-85% מפגש) מלוחות תרבית תאים או צלוחיות באמצעות תמיסת דיסוציאציה של תאים שאינם אנזימטיים (למשל, תערובת של כלאטורים; ראו טבלת החומרים) וספור את התאים באמצעות המוציטומטר. עבור זריקות אורתוטופיות לתוך העצב הסיאטי, שחזרו את התאים ב-16,667 תאים/מ"ל (50,000 תאים ל-3 מיקרול' לכל חיה) ב-DMEM-1031. שמור את התאים על קרח.
    הערה: תרביות מסוימות לא יצליחו ליצור שתלים אלא אם כן התאים מוזרקים במטריצת קרום מרתף של גורם גדילה נמוך. הדרישה למטריצת קרום מרתף (10-50%) חייבת להיקבע באופן אמפירי.
  3. הערך את פוטנציאל הגדילה של in vivo allograft בתאים שלאחר ההדבקה על ידי הזרקת תאי MPNST לתוך העצב הסיאטי של 8-10 Hsd מורדם : Athymic Nude-Foxn1nu עכברים לכל קבוצה (בגילאי 4-8 שבועות). להזרקה אורתוטופית של תאי גידול, עיין Turk et al31. כאן, הזרקה תת עורית הוא הוכיח.
    הערה: כדי לקבוע את מספר בעלי החיים הניסיוניים הדרושים למובהקות סטטיסטית, התייעץ עם ביו-סטטיסטיקאי או שמומלץ להשתמש ב-G*Power3, תוכנה זמינה באופן חופשי32.
  4. עקוב מקרוב אחר בעלי החיים פעמיים ביום במשך השבוע הראשון שלאחר ההזרקה עבור כל סימן של כאב. לאחר מכן, עקוב אחר העכברים המושתלים שלוש פעמים בשבוע לצורך מדידות קליפר והערך את ציוני מצב הגוף (BCSs) כפי שתואר קודם לכן 5,31. כפי שמתואר בהנחיות IACUC, המתת בעלי חיים עם BCS של 2 או פחות.
  5. כאשר תאים מושתלים גדלים בקצבים שונים, קבעו את זמני השתל באופן אמפירי באמצעות תאי בקרה (ללא שינוי) לפני ביצוע ניסויים המתוארים בסעיף זה. כדי לאסוף את השתלים בנקודת הקצה הניסיונית, הרדים את העכברים באופן הומני באמצעות שאיפת פחמן דו-חמצני ולאחריה נקע צוואר הרחם כאמצעי משני. רשום את מדידות הנפח והמסה הסופיות של כל שתל.
    הערה: כ- P 0-GGFβ3 ללא שינוי; Trp53+/-; תאי Erbb4fl/fl MPNST מגיעים בדרך כלל לגודל המרבי המותר על ידי IACUC תוך 30-45 יום, ציר זמן טיפוסי הוא בסביבות 30-45 יום לאחר ההזרקה.
  6. לבודד ולחלק רקמה כמתואר בשלבים 1.6-1.8. קבעו חלק מרקמת השתל למשך הלילה ב-4% פרפורמלדהיד (איור 2) ואז הטמיעו אותו בפרפין. הכינו מקטעים של 5 מיקרומטר מרקמת ה-FFPE והרכיבו אותם על שקופיות. בצע צביעת H&E ומחלות חיסון נחוצות אחרות כדי לאשר כי רקמת השתל מורכבת מתאי הגידול כמתואר ב- 1.8.1. הקפיאו את שאר רקמת הגידול לצורך ניתוחים במורד הזרם, כגון אימות אובדן ביטוי Erbb4 והערכת ההשפעות של אובדן Erbb4 על הביטוי של בני משפחת ארב אחרים.
    הערה: אישור של תאי הגידול ברקמת השתל חייב להיעשות מכיוון שעכברים בעלי השפעה חיסונית נוטים לפתח גידולים. במקרה של שתלים קטנים, חשוב לוודא כי רקמת צלקת או דלקת אינה טועה עבור neoplasm.
    1. בצע צביעת IHC סטנדרטית על רקמת ה-FFPE כדי להשוות את הביטוי של חלבונים בעלי עניין בתאים המטופלים ב-Allografts שגדלו מ-Ad5CMV-eGFP ומ-Ad5CMV-Cre/eGFP שטופלו. הכתימו את רקמת השתל שנכרתה באמצעות נוגדנים ספציפיים ל-erbB4 כדי לאשר את ההבדלים בביטוי in vivo erbB4 בין שני מצבי הניסוי. קבעו את מדד ההתפשטות באמצעות צביעת Ki67 ואת רמת האפופטוזיס באמצעות צביעת dUTP dUTP בתיווך טרנספראז (TUNEL) בתיווך דאוקסינוקלאוטידיל טרנספראז בתיווך DUTP.
      הערה: כל יעד חלבון בעל עניין יכול להיות מוערך גם באמצעות IHC. לדוגמה, הערך את צפיפות כלי הדם על ידי חיסון allografts עם נוגדן anti-CD31 (דילול 1:50) כדי לקבוע הבדלים במיקרו-סביבה של כלי דם in vivo המתווכים על ידי אבלציה של גנים. ניתן לספור את מספר פרופילי כלי הדם לכל שדה 40x לצורך כימות. עבור מבחנים מבוססי IHC אלה, יש לעקוב אחר פרוטוקולי IHC סטנדרטיים עבור נהלי הכתם ופרוטוקול היצרן לצביעת TUNEL. לכימות תמונות, השתמש בתוסף ImageJ "ספירה אוטומטית של תמונה בצבע יחיד".

תוצאות

איור 4 ממחיש תוצאה אופיינית המתקבלת בעת התמרות P 0-GGFβ3; Trp53-/+; תאי MPNST מסוג Erbb4fl/fl עם אדנו-וירוס Ad5CMV-eGFP או אדנו-וירוס Ad5CMV-Cre/eGFP (איור 4A). תרביות נצפות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לזהות תאים המבטאים eGFP ועל ידי מיקרוסקופיה של ניג...

Discussion

השיטות המפורטות שהוצגו כאן פותחו באמצעות מודל GEM של MPNSTs. עם זאת, אם ניתן לפזר את רקמת הגידול המעניינת לתאים בודדים, מתודולוגיות אלה ניתנות להתאמה בקלות לסוגי גידולים שונים הנובעים מ- GEMs. חשוב לוודא כי אלל floxed לא לגרום i) ירידה בהישרדות שיכולה להקשות על השגת עכברים מספיקים כדי לסנן גידולים, או...

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי למחלות נוירולוגיות ושבץ מוחי (R01 NS048353, R01 NS109655), המכון הלאומי לסרטן (R01 CA122804), משרד ההגנה (X81XWH-09-1-0086, W81XWH-11-1-0498, W81XWH-12-1-0164, W81XWH-14-1-0073, ו- W81XWH-15-1-0193), והקרן לגידול ילדים (2014-04-001 ו-2015-05-007).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Ad5CMV-eGFPGene Transfer Vector Core, Univ of IowaVVC-U of Iowa-4
Ad5CMVCre-eGFPGene Transfer Vector Core, Univ of IowaVVC-U of Iowa-1174
alexa 568 secondary antibodyThermo/FisherGaR A11036
Bioconductor Open Source Software for BioninformaticsBioconductorhttp://www.bioconductor.orgalternative statistical analysis tool used for step 4.4
CD31Abcamab28364
Celigo Image CytometerNexcelom BioscienceN/A
Cell StripperCorning25-056-Clmixture of chelators
DAB staining kitVector LabsMP-7800
DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery)DAVIDhttps://david.ncifcrf.govfunctional enrichment analysis software used for step 4.5
DMEMCorning15-013-Cl
DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR)Thermo/FisherEP0701 and K1072
erbB4 antibodiesSanta Cruzsc-284
erbB4 antibodiesAbcamab35374
erbB4 antibodiesMilliporeHFR1: 05-1133
FACS SorterBD BiosciencesAria II
ForskolinSigmaF6886
GenomeSpace Tools and Data SourcesGenomeSpacehttps://genomespace.org/support/tools/general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5
GlutamineCorning25-005-Cl
Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion toolGorillaN/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.ilfunctional enrichment analysis software used for step 4.5
GSEA Gene Set Enrichment AnalysisBroad InstituteN/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jspfunctional enrichment analysis software used for step 4.5
HSD: Athymic Nude-FOxn1nu miceEnvigo (Previously Harlan Labs)69
Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer)IlluminaHi Seq 2500DNA sequencer used for step 4.2
Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysisDNAStar LaserGene softwareN/Asoftware statistical and normalization analysis used for step 4.4
Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assemblysoftware alignment used for step 4.3N/Asoftware alignment used for step 4.3
Matrigel, low growth factor basement membrane matrixCorning354230
NRG1-betaIn houseGenerated by SLC, also commercially available from R & D Systems(396-HB-050/CF).
Nuclear Stain Hoeschst 33342Thermo62249
Panther Gene Ontology Classification SystemPantherhttp://pantherdb.orgfunctional enrichment analysis software used for step 4.5
Partek (BWA aligner and analyzer)Partek, Ver 7N/Asoftware alignment and statistical/normalization used for step 4.3
Pen/StrepCorning30-002-Cl
Primer 1: 5′-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT
GTCTG- 3′		Eurofins GenomicsPrimer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product;
Primer 2: 5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC
AGAAGC-3′		Eurofins GenomicsPrimer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product;

Primer 3: 5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA
ACCCAG-3′

Eurofins GenomicsPrimer 1 + 3: 350 bp wild-type ErbB4 product.
Propidium IodineFisher51-351-0
Proteom Profiler Phospho-Kinase ArraysR&D SystemsARY003B
Real time gloPromegaG9712bioluminescent cell viability assay
ToppGene SuiteToppGenehttps://toppgene.cchmc.orgfunctional enrichment analysis software used for step 4.5
Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent)Invitrogen15596026
Tyramide Signal Amplification KitPerkin ElmerNEL721001EA

References

  1. Ricciuti, B., et al. Antibody-drug conjugates for lung cancer in the era of personalized oncology. Seminars in Cancer Biology. 69, 268-278 (2019).
  2. Litak, J., Mazurek, M., Grochowski, C., Kamieniak, P., Rolinski, J. PD-L1/PD-1 axis in glioblastoma multiforme. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5347 (2019).
  3. Roskoski, R. Properties of FDA-approved small molecule protein kinase inhibitors. Pharmacological Research. 144, 19-50 (2019).
  4. Heffner, C. S., et al. Supporting conditional mouse mutagenesis with a comprehensive cre characterization resource. Nature Communications. 3, 1218 (2012).
  5. Longo, J. F., et al. ErbB4 promotes malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis via Ras-independent mechanisms. Cell Communication and Signaling. 17 (1), 74 (2019).
  6. Kazmi, S. J., et al. Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis. American Journal of Pathology. 182 (3), 646-667 (2013).
  7. Brosius, S. N., et al. Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis. Acta Neuropatholica. 127 (4), 573-591 (2014).
  8. Ducatman, B. S., Scheithauer, B. W., Piepgras, D. G., Reiman, H. M., Ilstrup, D. M. Malignant peripheral nerve sheath tumors. A clinicopathologic study of 120 cases. Cancer. 57 (10), 2006-2021 (1986).
  9. Gassmann, M., et al. Aberrant neural and cardiac development in mice lacking the ErbB4 neuregulin receptor. Nature. 378 (6555), 390-394 (1995).
  10. Tidcombe, H., et al. Neural and mammary gland defects in ErbB4 knockout mice genetically rescued from embryonic lethality. Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 100 (14), 8281-8286 (2003).
  11. Golub, M. S., Germann, S. L., Lloyd, K. C. Behavioral characteristics of a nervous system-specific erbB4 knock-out mouse. Behavioral Brain Research. 153 (1), 159-170 (2004).
  12. Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells. Journal of Neuroscience. 23 (19), 7269-7280 (2003).
  13. Jackson-Fisher, A. J., et al. Formation of Neu/ErbB2-induced mammary tumors is unaffected by loss of ErbB4. Oncogene. 25 (41), 5664-5672 (2006).
  14. Byer, S. J., et al. Tamoxifen inhibits malignant peripheral nerve sheath tumor growth in an estrogen receptor-independent manner. Neuro-oncology. 13 (1), 28-41 (2011).
  15. Kang, Y., Pekmezci, M., Folpe, A. L., Ersen, A., Horvai, A. E. Diagnostic utility of SOX10 to distinguish malignant peripheral nerve sheath tumor from synovial sarcoma, including intraneural synovial sarcoma. Modern Pathology. 27 (1), 55-61 (2014).
  16. Longo, J. F., et al. Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line. Scientific Reports. 11 (1), 5690 (2021).
  17. Chomczynski, P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).
  18. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  19. Grozdanov, P. N., Li, J., Yu, P., Yan, W., MacDonald, C. C. Cstf2t regulates expression of histones and histone-like proteins in male germ cells. Andrology. 6 (4), 605-615 (2018).
  20. Kaur, S., et al. CD63, MHC class 1, and CD47 identify subsets of extracellular vesicles containing distinct populations of noncoding RNAs. Scientific Reports. 8 (1), 2577 (2018).
  21. Avraham, O., et al. Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons. Nature Communications. 11 (1), 4891 (2020).
  22. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
  23. Lin, Y., et al. Comparison of normalization and differential expression analyses using RNA-Seq data from 726 individual Drosophila melanogaster. BMC Genomics. 17, 28 (2016).
  24. Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists. BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).
  25. Huang, D. W., et al. The DAVID Gene Functional Classification Tool: a novel biological module-centric algorithm to functionally analyze large gene lists. Genome Biology. 8 (9), 183 (2007).
  26. Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system. Nature Protocols. 8 (8), 1551-1566 (2013).
  27. Subramanian, A., et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proceedings of the Nationall Academy of the Sciences of the United States of America. 102 (43), 15545-15550 (2005).
  28. Merico, D., Isserlin, R., Stueker, O., Emili, A., Bader, G. D. Enrichment map: a network-based method for gene-set enrichment visualization and interpretation. PLoS One. 5 (11), 13984 (2010).
  29. Yoon, S., Kim, S. Y., Nam, D. Improving gene-set enrichment analysis of RNA-Seq data with small replicates. PLoS One. 11 (11), 0165919 (2016).
  30. Koch, C. M., et al. A beginner's guide to analysis of RNA sequencing data. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 59 (2), 145-157 (2018).
  31. Turk, A. N., Byer, S. J., Zinn, K. R., Carroll, S. L. Orthotopic xenografting of human luciferase-tagged malignant peripheral nerve sheath tumor cells for in vivo testing of candidate therapeutic agents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2558 (2011).
  32. Faul, F. E., Lang, A. G., Buchner, A. G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences. Behavior Research Methods. 39 (2), 175 (2007).
  33. Chen, Z., et al. Cells of origin in the embryonic nerve roots for NF1-associated plexiform neurofibroma. Cancer Cell. 26 (5), 695-706 (2014).
  34. Mo, J., et al. Humanized neurofibroma model from induced pluripotent stem cells delineates tumor pathogenesis and developmental origins. Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139807 (2021).
  35. Chau, V., et al. Preclinical therapeutic efficacy of a novel pharmacologic inducer of apoptosis in malignant peripheral nerve sheath tumors. Cancer Research. 74 (2), 586-597 (2014).
  36. Dodd, R. D., et al. NF1(+/-) Hematopoietic cells accelerate malignant peripheral nerve sheath tumor development without altering chemotherapy response. Cancer Research. 77 (16), 4486-4497 (2017).
  37. Eckert, J. M., Byer, S. J., Clodfelder-Miller, B. J., Carroll, S. L. Neuregulin-1 beta and neuregulin-1 alpha differentially affect the migration and invasion of malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Glia. 57 (14), 1501-1520 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

174CreRNA Seq

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved