悪性末梢神経鞘腫瘍細胞におけるフロックス対立遺伝子の Ex vivo アブレーションによる腫瘍形成における遺伝子機能の定義

要約

ここでは、遺伝子操作されたマウスモデル由来腫瘍において、インビボで胚致死性である遺伝子ノックアウトを行い、そのノックアウトが腫瘍の成長、増殖、生存、遊走、浸潤、およびトランスクリプトームに及ぼす影響をインビトロおよびインビボで評価するためのプロトコルを提示する。

要約

ヒトがんの主要タンパク質を正確に標的とする新薬の開発は、がん治療薬を根本的に変えています。しかし、これらの薬剤を使用する前に、それらの標的タンパク質を特定のがんタイプの治療標的として検証する必要があります。この検証は、多くの場合、がんの遺伝子操作マウス(GEM)モデルで治療標的候補をコードする遺伝子をノックアウトし、これが腫瘍増殖にどのような影響を与えるかを決定することによって行われます。残念なことに、従来のノックアウトにおける胚致死性や条件付きノックアウトにおけるモザイク性などの技術的問題により、このアプローチが制限されることがよくあります。これらの制限を克服するために、GEMモデルで生成された悪性末梢神経鞘腫瘍(MPNST)の短期培養において、目的のフロックス胚致死遺伝子を切除するアプローチが開発された。

この論文では、適切な遺伝子型を持つマウスモデルを確立し、これらの動物から短期間の腫瘍培養物を導き出し、Creリコンビナーゼと増強緑色蛍光タンパク質(eGFP)を発現するアデノウイルスベクターを使用して、フロックス胚致死遺伝子をアブレーションする方法を説明します。蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いたアデノウイルスを導入した細胞の精製、および遺伝子アブレーションが細胞増殖、生存率、トランスクリプトーム、および同所性同種移植片増殖に及ぼす影響の定量化が詳述される。これらの方法論は、イン ビトロおよびインビボで 治療標的を同定および検証するための効果的かつ一般化可能なアプローチを提供する 。 これらのアプローチはまた、 インビトロ 増殖アーチファクトを減少させた低継代腫瘍由来細胞の再生可能な供給源を提供する。これにより、セクレトームによって媒介される遊走、浸潤、転移、細胞間通信などの多様な生物学的プロセスにおける標的遺伝子の生物学的役割を研究することができる。

概要

過去20年以前、ヒトのがんの治療は、DNAを損傷したり、DNA合成を阻害したりすることによって急速に増殖する細胞集団を広く標的とする放射線療法および化学療法剤に大きく依存していました。これらのアプローチは癌細胞の増殖を阻害したが、腸上皮細胞や毛包細胞などの正常な急速に増殖する細胞型にも有害な副作用をもたらした。より最近では、がん治療は、個々の患者の新生物の増殖にとって決定的に重要なシグナル伝達経路内のタンパク質を正確に標的とする化学療法剤を利用し始めている。一般に「プレシジョンメディシン」と呼ばれるこのアプローチは、モノクローナル抗体と小分子阻害剤のレパートリーの拡大を続ける開発につながっています。これらの薬剤は、腫瘍細胞の増殖および生存を効果的に阻害する一方で、従来の化学療法剤および放射線療法で見られる正常な細胞型に対する有害な副作用を回避する。ヒト癌の治療に使用されるモノクローナル抗体は、最も一般的には、成長因子受容体1(例えば、膜貫通受容体チロシンキナーゼの大ファミリー)および免疫応答モジュ^{レーター2}(例えば、プログラム細胞死タンパク質¹、プログラム死リガンド1)などの細胞表面分子を標的とする。小分子阻害剤は、細胞内に位置する細胞表面タンパク質またはシグナル伝達タンパク質のいずれかを阻害することができる³。しかしながら、これらの新しい治療薬を効果的に採用するためには、特定の癌が候補治....

プロトコル

マウスで処置を行う前に、すべての処置は、施設動物管理および使用委員会によって検討および承認されなければならない。この原稿に記載されているプロトコルは、サウスカロライナ医科大学の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。このプロトコルは、MUSCの施設動物ケアガイドラインに従って、適切に訓練された人員によって実施されました。

1. Erbb4 ^flox 対立遺伝子に対してホモ接合型のMPNSTを発育するマウスの作製

1. P0-GGFβ3のF1世代を産生する;Trp53^+/-;P0-GGFβ3を交配させることによるErbb4^fl/+動物;Trp53^+/-マウス⁷とErbb4 fl^/flマウス¹¹。Punnettの正方形(図1)を使用して、所望のP 0-GGFβ3で十分な雄および雌のF1子犬が生成されるように繁殖計画を導く。Trp53^+/-;Erbb4^fl/....

結果

図4は、P0-GGFβ3を形質導入するときに得られる典型的な結果を示す;Trp53^-/+;Ad5CMV-eGFPアデノウイルスまたはAd5CMV-Cre/eGFPアデノウイルスのいずれかを有するErbb4^fl/fl MPNST細胞(図4A)。培養物を蛍光顕微鏡で観察してeGFP発現細胞を同定し、位相差顕微鏡で10倍(上)と40倍(下)で同じフィールドに存在する細胞の総数を決定?.......

ディスカッション

ここで紹介する詳細な方法は、MPNSTのGEMモデルを使用して開発されました。しかしながら、目的の腫瘍組織を個々の細胞に分散させることができる場合、これらの方法論は、GEMSにおいて生じる様々な腫瘍タイプに容易に適応可能である。フロックス対立遺伝子が、i)腫瘍をスクリーニングするのに十分なマウスを得ることを困難にする生存率の低下、またはii)十分な担癌マウスを得ることを?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ad5CMV-eGFP	Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa	VVC-U of Iowa-4
Ad5CMVCre-eGFP	Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa	VVC-U of Iowa-1174
alexa 568 secondary antibody	Thermo/Fisher	GaR A11036
Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics	Bioconductor	http://www.bioconductor.org	alternative statistical analysis tool used for step 4.4
CD31	Abcam	ab28364
Celigo Image Cytometer	Nexcelom Bioscience	N/A
Cell Stripper	Corning	25-056-Cl	mixture of chelators
DAB staining kit	Vector Labs	MP-7800
DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery)	DAVID	https://david.ncifcrf.gov	functional enrichment analysis software used for step 4.5
DMEM	Corning	15-013-Cl
DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR)	Thermo/Fisher	EP0701 and K1072
erbB4 antibodies	Santa Cruz	sc-284
erbB4 antibodies	Abcam	ab35374
erbB4 antibodies	Millipore	HFR1: 05-1133
FACS Sorter	BD Biosciences	Aria II
Forskolin	Sigma	F6886
GenomeSpace Tools and Data Sources	GenomeSpace	https://genomespace.org/support/tools/	general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5
Glutamine	Corning	25-005-Cl
Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool	Gorilla	N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il	functional enrichment analysis software used for step 4.5
GSEA Gene Set Enrichment Analysis	Broad Institute	N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp	functional enrichment analysis software used for step 4.5
HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice	Envigo (Previously Harlan Labs)	69
Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer)	Illumina	Hi Seq 2500	DNA sequencer used for step 4.2
Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis	DNAStar LaserGene software	N/A	software statistical and normalization analysis used for step 4.4
Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly	software alignment used for step 4.3	N/A	software alignment used for step 4.3
Matrigel, low growth factor basement membrane matrix	Corning	354230
NRG1-beta	In house	Generated by SLC, also commercially available from R & D Systems(396-HB-050/CF).
Nuclear Stain Hoeschst 33342	Thermo	62249
Panther Gene Ontology Classification System	Panther	http://pantherdb.org	functional enrichment analysis software used for step 4.5
Partek (BWA aligner and analyzer)	Partek, Ver 7	N/A	software alignment and statistical/normalization used for step 4.3
Pen/Strep	Corning	30-002-Cl
Primer 1: 5′-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT GTCTG- 3′	Eurofins Genomics	Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product;
Primer 2: 5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC AGAAGC-3′	Eurofins Genomics	Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product;
Primer 3: 5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA ACCCAG-3′	Eurofins Genomics	Primer 1 + 3: 350 bp wild-type ErbB4 product.
Propidium Iodine	Fisher	51-351-0
Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays	R&D Systems	ARY003B
Real time glo	Promega	G9712	bioluminescent cell viability assay
ToppGene Suite	ToppGene	https://toppgene.cchmc.org	functional enrichment analysis software used for step 4.5
Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent)	Invitrogen	15596026
Tyramide Signal Amplification Kit	Perkin Elmer	NEL721001EA