Definition von Genfunktionen in der Tumorgenese durch Ex-vivo-Ablation von Flox-Allelen in bösartigen peripheren Nervenscheidentumorzellen

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll für die Durchführung von Gen-Knockouts vor, die in vivo in gentechnisch veränderten Mausmodell-abgeleiteten Tumoren embryonal tödlich sind, und bewerten dann die Wirkung, die der Knockout auf Tumorwachstum, Proliferation, Überleben, Migration, Invasion und das Transkriptom in vitro und in vivo hat.

Zusammenfassung

Die Entwicklung neuer Medikamente, die genau auf Schlüsselproteine bei menschlichen Krebserkrankungen abzielen, verändert die Krebstherapeutika grundlegend. Bevor diese Medikamente jedoch eingesetzt werden können, müssen ihre Zielproteine als therapeutische Ziele bei bestimmten Krebsarten validiert werden. Diese Validierung wird häufig durchgeführt, indem das Gen, das für das therapeutische Ziel in einem gentechnisch veränderten Mausmodell (GEM) von Krebs kodiert, ausgeschaltet und bestimmt wird, welche Auswirkungen dies auf das Tumorwachstum hat. Leider schränken technische Probleme wie die embryonale Letalität bei konventionellen Knockouts und der Mosaikismus bei bedingten Knockouts diesen Ansatz oft ein. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde ein Ansatz zur Ablation eines abgeloxierten embryonalen tödlichen Gens entwickelt, das in Kurzzeitkulturen von bösartigen peripheren Nervenscheidentumoren (MPNSTs) von Interesse ist, die in einem GEM-Modell erzeugt wurden.

Dieses Papier beschreibt, wie man ein Mausmodell mit dem entsprechenden Genotyp etabliert, kurzfristige Tumorkulturen von diesen Tieren ableitet und dann das floxierte embryonale tödliche Gen mit einem adenoviralen Vektor abträgt, der Cre-Rekombinase und verbessertes grün fluoreszierendes Protein (eGFP) exprimiert. Die Reinigung von Zellen, die mit Adenovirus transduziert wurden, mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) und die Quantifizierung der Auswirkungen, die die Genablation auf die Zellproliferation, Lebensfähigkeit, das Transkriptom und das orthotope Allotransplantatwachstum ausübt, wird dann detailliert beschrieben. Diese Methoden bieten einen effektiven und generalisierbaren Ansatz zur Identifizierung und Validierung therapeutischer Ziele in vitro und in vivo. Diese Ansätze bieten auch eine erneuerbare Quelle für von Tumoren abgeleitete Zellen mit niedriger Passage mit reduzierten In-vitro-Wachstumsartefakten. Auf diese Weise kann die biologische Rolle des Zielgens in verschiedenen biologischen Prozessen wie Migration, Invasion, Metastasierung und interzellulärer Kommunikation, die durch das Sekretom vermittelt werden, untersucht werden.

Einleitung

Vor den letzten zwei Jahrzehnten stützte sich die Behandlung von menschlichen Krebserkrankungen stark auf Strahlentherapie und Chemotherapeutika, die im Großen und Ganzen auf sich schnell vermehrende Zellpopulationen abzielten, indem sie die DNA schädigten oder die DNA-Synthese hemmten. Obwohl diese Ansätze das Wachstum von Krebszellen hemmten, hatten sie auch schädliche Nebenwirkungen auf normale, sich schnell vermehrende Zelltypen wie Darmepithelzellen und Haarfollikelzellen. In jüngerer Zeit hat die Krebstherapie begonnen, Chemotherapeutika zu verwenden, die genau auf Proteine innerhalb von Signalwegen abzielen, die für das Wachstum des Neoplasmas eines einzelnen Patienten von entscheidender Bedeutung sind. Dieser Ansatz, der gemeinhin als "Precision Medicine" bezeichnet wird, hat zur Entwicklung eines ständig wachsenden Repertoires an monoklonalen Antikörpern und kleinen molekularen Inhibitoren geführt. Diese Wirkstoffe hemmen effektiv die Proliferation und das Überleben von Tumorzellen und vermeiden gleichzeitig die schädlichen Nebenwirkungen auf normale Zelltypen, die bei herkömmlichen Chemotherapeutika und Strahlentherapie beobachtet werden. Monoklonale Antikörper, die zur Behandlung von Krebs beim Menschen eingesetzt werden, zielen am häufigsten auf Zelloberflächenmoleküle wie Wachstumsfaktorrezeptoren 1 (z. B. die große Familie membranübergreifender Rezeptor-Tyrosinkinasen) und Immunantwortmodulatoren 2 (z. B. programmiertes Zelltodprotein 1^, programmierter Todesligand¹⁾ ab. Kleine molekulare Inhibitoren können entweder Zelloberflächenproteine oder Signalproteine, die sich intrazellulär befinden, hemmen³. Um diese neuen therapeutischen Wirkstoffe effektiv einsetzen zu können, muss jedoch festgestellt werden, dass eine bestimmte Krebserkrankung von dem Molekül abhängt, auf das ein Therapiekandidat abzielt.

Obwohl diese neuen Therapeutika fokussiertere Wirkungen haben, hemmen viele von ihnen immer noch die Wirkung von mehr als einem Protein. Darüber hinaus sind oft mehrere Wirkstoffe mit unterschiedlicher Wirksamkeit und Spezifität verfügbar, um auf ein bestimmtes Protein abzuzielen. Daher ist es ratsam, bei präklinischen Studien zusätzliche Ansätze wie die genetische Ablation zu verwenden, um ein Kandidatenprotein als therapeutisches Ziel zu validieren. Ein besonders nützlicher Ansatz zur Validierung eines Proteins als therapeutisches Ziel besteht darin, das Gen, das für das Kandidatenprotein kodiert, in einem gentechnisch veränderten Tiermodell abzutragen, das die spezifische Krebsart von Interesse entwickelt. Dieser Ansatz kann relativ einfach sein, wenn Mäuse mit einer Nullmutation (entweder eine natürliche Mutation, eine gentechnisch veränderte Nullmutation [ein "Knockout") oder eine Nullmutation, die durch eine Genfalle eingeführt wurde) verfügbar sind und die Mäuse bis ins Erwachsenenalter lebensfähig sind. Leider sind Mäuse mit einer Nullmutation, die diese Kriterien erfüllen, oft nicht verfügbar, typischerweise weil die Nullmutation zum embryonalen Tod oder in den ersten Tagen des postnatalen Lebens führt. Unter diesen Umständen können Mäuse, die dazu neigen, den interessierenden Tumortyp zu entwickeln, stattdessen zu Mäusen gekreuzt werden, bei denen Schlüsselsegmente des interessierenden Gens von loxP-Stellen flankiert werden ("floxed"), wodurch das Gen abgetragen werden kann, indem eine transgenexprimierende Cre-Rekombinase in die Tumorzellen eingeführt wird (ein bedingter Knockout). Dieser Ansatz bietet mehrere Vorteile. Erstens, wenn ein Cre-Treiber verfügbar ist, der im Tumor exprimiert wird, aber nicht in dem Zelltyp, der bei herkömmlichen Knockouts zum Tod führte, kann dieser Ansatz möglicherweise das therapeutische Ziel validieren. Zweitens ermöglicht die Ablation des Gens, das für das Kandidatenprotein kodiert, in Tumorzellen, aber nicht in anderen intratumoralen Elementen wie tumorassoziierten Fibroblasten oder Immunzellen, dem Prüfarzt, zwischen zellautonomen und nicht-zellautonomen Effekten des therapeutischen Ziels zu unterscheiden. Schließlich ermöglicht ein Tamoxifen-induzierbarer Cre-Treiber (CreER^T2) dem Prüfarzt, das Gen von Interesse in verschiedenen Stadien der Tumorentwicklung zu löschen und das Fenster zu definieren, in dem der therapeutische Wirkstoffkandidat am wahrscheinlichsten wirksam ist.

Leider gibt es auch technische Probleme, die die Verwendung von bedingten Knockouts bei Tumoren, die in GEM-Modellen auftreten, einschränken können. Zum Beispiel ist ein Cre-Treiber, der in Tumorzellen exprimiert wird und Gendeletion in normalen lebensnotwendigen Zellen vermeidet, möglicherweise nicht verfügbar. Ein weiteres Problem, das unterschätzt werden kann, ist, dass Cre- und CreER^T2-Treiber oft variabel floxierte Allele in Mäusen abtragen, was zu Mosaikismus für die Nullmutation in einem GEM-Krebs führt. Wenn dies geschieht, werden Tumorzellen, in denen das Zielgen nicht abgetragen wurde, weiterhin schnell vermehren und die Tumorzellen mit abgetragenen Allelen überwuchern. Mosaikismus in Cre-Treiberlinien kann aufgrund einer nicht allgegenwärtigen Cre-Expression in der Ziellinie und durch fehlgeschlagene Rekombination in einzelnen Zellen unabhängig von der Cre-Expression^{auftreten 4}. Dies ist ein bekanntes Phänomen von Cre-Treibern, das vom Zelltyp abhängig ist und bei der Versuchsplanung und Dateninterpretation berücksichtigt werden sollte. Mosaikismus kann die Wirkung des Knockouts maskieren und einen Forscher dazu bringen, fälschlicherweise zu dem Schluss zu kommen, dass das Gen von Interesse für die Proliferation und/oder das Überleben von Tumorzellen nicht essentiell ist und somit kein gültiges therapeutisches Ziel ist.

Mehrere dieser Probleme traten in einer früheren Studie auf, in der versucht wurde zu bestimmen, ob die Rezeptor-Tyrosinkinase erbB4 ein potenzielles therapeutisches Ziel in MPNST-Zellen^{war 5}. In diesen Studien wurden Mäuse verwendet, die ein Transgen exprimieren, das für den_neuregulin-1 (NRG1) isoformen glialen Wachstumsfaktor-β3 (GGFβ3) kodiert, unter der Kontrolle des Schwann-Zell-spezifischen Myelinprotein-Nullpromotors (P 0-GGFβ3-Mäuse). P 0-GGFβ3-Mäuse entwickeln mehrere plexiforme Neurofibrome, die über einen Prozess, der die Prozesse der Neurofibrom-Pathogenese und der plexiformen Neurofibrom-MPNST-Progression rekapituliert, die bei Patienten mit dem autosomal-dominanten Tumorsuszeptibilitätssyndrom Neurofibromatose Typ 1 (NF1)⁶ beobachtet wurden, zu MPNSTs werden. Bei Kreuzung mit Mäusen mit einer Trp53-Nullmutation ergibt sich das resultierende P 0-GGFβ3; Trp53^+/- Mäuse entwickeln MPNSTs de novo, wie sie in cis-Nf1^+/-; Trp53^+/- Mäuse.

Diese MPNSTs rekapitulieren die Entwicklung von Läsionen der Weltgesundheitsorganisation (WHO) Grad II zu WHO-Grad IV, die beim Menschen beobachtet wurden⁷. Bei P 0-GGFβ3-Mäusen entstehen MPNSTs innerhalb bereits bestehender plexiformer Neurofibrome im Trigeminusnerv (58%) und spinalen dorsalen Nervenwurzeln (68%)⁷; die MPNSTs, die in P 0-GGFβ3 entstehen; Trp53^+/- Mäuse haben eine sehr ähnliche Verteilung. Beim Menschen entstehen MPNSTs am häufigsten im Ischiasnerv, gefolgt vom Plexus brachialis, den Spinalnervenwurzeln, dem Vagus, dem Femur, dem Median, dem Plexus sacralis, dem Obturator popliteus und den hinteren Tibia- und Ulnarnerven⁸. Diese Tumorverteilung in diesen GEM-Modellen unterscheidet sich etwas von dem, was beim Menschen beobachtet wird. Die MPNSTs, die in P 0-GGFβ3 und P_0-GGFβ3 auftreten; Trp53^+/- Mäuse sind histologisch identisch mit menschlichen MPNSTs, tragen viele der gleichen Mutationen, die bei menschlichen MPNSTs beobachtet wurden, und rekapitulieren den Prozess der Neurofibrom-MPNST-Progression, der bei NF1-Patienten beobachtet wurde. Die Erzeugung von P 0-GGFβ3 oder P_0-GGFβ3; Trp53^+/- Mäuse, die Erbb4-/- waren, waren nicht durchführbar, da Mäuse mit zwei Erbb4-Null-Allelen in utero am Embryonaltag 10,5 nach Herzfehlern^{starben 9}. Denn die Rettung der Erbb4-Expression im Herzen durch die Einführung eines herzspezifischen Erbb4-Transgens (α-Myosin-Schwerkette (MHC)-Erbb4) führt zu lebensfähigen Erbb4-/-^{Mäusen 10}, der Erzeugung von Mäusen mit einem komplizierten P ^0-GGFβ3; Trp53^+/-;α-MHC-Erbb4; Erbb4^-/- Genotyp wurde versucht.

Die Paarungen produzierten jedoch keine Mäuse in den erwarteten Mendelschen Verhältnissen, was darauf hindeutet, dass der gewünschte Genotyp schädlich war. Daher ist die Erzeugung von P 0-GGFβ3; Trp53^+/- Mäuse mit floxierten Erbb4-Allelen¹¹ und einem CreER^T2-Treiber wurde versucht, die Löschung von Erbb4 in den MPNSTs, die in diesen Mäusen entstehen, zu ermöglichen. Bei diesen Tieren waren noch zahlreiche Tumorzellen mit intakten Erbb4-Allelen vorhanden (Mosaikismus). Der beobachtete Mosaikismus könnte auf eine ineffiziente Tamoxifenabgabe zurückzuführen sein, die zu Unterschieden in der Rekombinationseffizienz innerhalb des Gewebes führte. Die Möglichkeit spontaner Kompensationsmechanismen könnte weiter zum Mosaikismus in der Tamoxifen-vermittelten Rekombination beitragen, indem die Anforderung an die Erbb4-Expression umgangen wird. Es ist möglich, dass der Verlust von Trp53 Tumorzellen anfällig für zusätzliche spontane "permissive" Mutationen macht, die die Interpretation der Daten verwirren könnten. Da es wahrscheinlich schien, dass die Erbb4-intakten MPNST-Zellen die Folgen der Ablagerung von Erbb4 in anderen Tumorzellen maskieren würden, wurde dieser Ansatz aufgegeben.

Diese Hindernisse führten zur Entwicklung einer Methodik zur Ablation von Erbb4 in sehr frühen Passage MPNST-Zellen unter Verwendung eines Adenovirus, das Cre-Rekombinase und eGFP exprimiert. Diese Zellen können mit FACS von nicht infizierten Zellen getrennt werden, was den Mosaikismus für das ablatierte Erbb4-Gen deutlich reduziert. Im Folgenden werden die Methoden beschrieben, die verwendet werden, um dies zu erreichen, zusammen mit den Methoden, die verwendet werden, um die Auswirkungen der Genablation in vitro und in vivo zu bewerten. Das folgende Protokoll ist ein Beispiel dafür, wie tumortragende Mäuse erzeugt werden können, die Tumore mit gefloxten Allelen embryonaler tödlicher Gene hervorbringen, die für die Ex-vivo-Exzision vor der Beurteilung des In-vivo-Allotransplantat-Tumorwachstums von Interesse sind. Dazu gehört eine Beschreibung der Ansätze, die verwendet werden, um die Wirkung zu analysieren, die die Erbb4-Ablation auf die Proliferation, das Überleben und die Genexpression von Tumorzellen in vitro sowie auf Proliferation, Überleben und Angiogenese in orthotopen Allotransplantaten ausübt.

Protokoll

Vor der Durchführung von Verfahren mit Mäusen müssen alle Verfahren vom Institutional Animal Care and Use Committee überprüft und genehmigt werden. Das in diesem Manuskript beschriebene Protokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der Medical University of South Carolina genehmigt. Dieses Protokoll wurde von ordnungsgemäß geschultem Personal gemäß den institutionellen Tierpflegerichtlinien von MUSC durchgeführt.

1. Generierung von Mäusen, die MPNSTs homozygot für Erbb4-Flox-Allele entwickeln

1. Herstellung der F1-Generation von P 0-GGFβ3; Trp53^+/-; Erbb4^fl/+ Tiere durch Paarung P 0-GGFβ3; Trp53^+/- Mäuse⁷ mit Erbb4 fl^/fl Mäuse¹¹. Verwenden Sie ein Punnett-Quadrat (Abbildung 1), um das Zuchtschema zu leiten, um sicherzustellen, dass genügend männliche und weibliche F1-Welpen mit dem gewünschten P 0-GGFβ3 erzeugt werden. Trp53^+/-; Erbb4^fl/+ Genotyp.
2. Nachkommen des Genotyps F1 durch Isolierung genomischer DNA aus einem Schwanzschnipsel, der gemäß den IACUC-Richtlinien gesammelt wurde, und anschließende Durchführung einer PCR mit zuvor beschriebenen Primern, um die P 0-GGFβ3-Transgene¹², Trp53-Wildtyp- (+) und Null- (-) Allele 7 sowie Erbb4-Flox und Erbb4-Wildtyp-Allele 13 nachzuweisen.
   1. Isolieren Sie die Schwanz-DNA mit Methoden, die auf jacks-lab.mit.edu/protocols beschrieben sind.
   2. Machen Sie die PCR-Reaktionsmischung mit 25 ng DNA, 0,25 nM dNTPs, 0,02 U / μL Taq, 0,5 μM jedes Primers und 1x PCR-Puffer. Durchführung einer PCR-Reaktion mit einer einzelnen 95 °C-Inkubation (um die genomische DNA zu schmelzen und Taq zu aktivieren) für 1 Minute, gefolgt von 35 PCR-Zyklen von 94 °C, 10 s (Schmelzen); 55 °C, 30 s (Glühen); 72 °C, 40 s (Verlängerung), gefolgt von einer einzelnen 72 °C (Verlängerung) für 5 min. Lagern Sie die Reaktionen bei 4 ° C, bis sie auf einem 1,2-1,5% igen Agarosegel einsatzbereit sind.
      HINWEIS: Die Glühtemperatur hängt vom verwendeten PCR-Puffersystem ab. Es wird empfohlen, einen Glühtemperaturgradienten durchzuführen, um die richtige Glühtemperatur zu bestimmen.
3. Herstellung der F2-Generation von P 0-GGFβ3; Trp53^+/-; Erbb4 fl^/fl Tiere durch Paarung der entsprechenden F1-Nachkommen (P 0-GGFβ3; Trp53^-/+; Erbb4^fl/+) miteinander.
   HINWEIS: Abbildung 1 zeigt die Punnet-Quadrat-Vorhersagen, die verwendet werden, um die erwartete Anzahl von F2-Nachkommen mit dem gewünschten Genotyp zu berechnen.
4. Identifizieren Sie Tiere mit dem gewünschten P 0-GGFβ3; Trp53^-/+; Erbb4 fl^/fl Genotyp, wie in Schritt 1.2 beschrieben.
5. Verbinden Sie F2-Nachkommen miteinander, um das P 0-GGFβ3 zu erhalten; Trp53^-/+; Erbb4^{fl / fl} Kolonie und Genotyp alle Welpen. Vergewissern Sie sich, dass das neu eingeführte floxierte Allel das Überleben oder die Tumorlatenz nicht beeinträchtigt. Erreichen Sie dies durch die Bildung von Kohorten (20 Mäuse/Kohorte) von P 0-GGFβ3; Trp53^+/- und P 0-GGFβ3; Trp53^+/-; Erbb4^{fl / fl-Mäuse} und verfolgen ihr Überleben und die Häufigkeit des Tumorauftretens.
6. Überwachen Sie die Tiere mehrmals pro Woche, bis der experimentelle Endpunkt erreicht ist (maximal zulässige Tumorgröße/humaner Endpunkt, der von der IAUC genehmigt wurde).
   1. Beurteilen Sie während der wöchentlichen Überwachung das Körpergewicht, das normale Sozial- und Pflegeverhalten sowie die Messung der Tumorgröße. Veranlassen Sie eine tierärztliche Untersuchung bei Gewichtsverlust von >10% des Körpergewichts, sozialer Abgeschiedenheit und Buckelung.
   2. Wenn eine tumortragende Maus identifiziert wurde und ihren humanen Endpunkt erreicht hat, euthanasieren Sie das Tier humanerweise mit Kohlendioxid-Inhalation gefolgt von Zervixdislokation und entfernen Sie den Tumor steril mit einem Skalpellmesser. Nehmen Sie Tumormessungen vor, indem Sie Länge, Breite und Tiefe mit einem Bremssattel messen und Tumor (Masse und Volumen) wiegen. Arbeiten Sie schnell, um Autolyse zu vermeiden.
7. Schneiden Sie den Tumor in drei Abschnitte unter Verwendung von Brotlaibschnitten mit einem Skalpellmesser unter sterilen Bedingungen, um Gewebesegmente für die Formalinfixierung / Paraffineinbettung (FFPE), die Erzeugung von Frühpassagekulturen und schockgefrorenes Material zu erzeugen (Abbildung 2A).
   1. Stellen Sie sicher, dass Abschnitt 1 (für die Erzeugung von Frühpassagekulturen, Schritt 1.7.2) etwa 10% des gesamten Tumorvolumens, Abschnitt 2 (für Fixierung und IHC, Schritt 1.7.3) 70% des gesamten Tumorvolumens und Abschnitt 3 (für Flash-Freeze, Schritt 1.7.4) 20% des gesamten Tumorvolumens ausmacht.
   2. Nehmen Sie Abschnitt 1 des Tumors zur Vorbereitung von frühen Passagekulturen (siehe unten).
   3. Fixieren Sie Abschnitt 2 des Tumors in 4% Paraformaldehyd über Nacht bei 4 ° C und betten Sie ihn dann in Paraffin (formalinfixiertes Paraffin-eingebettetes (FFPE) für die diagnostische Aufarbeitung ein.
   4. Flash-Freeze-Abschnitt 3 für analytische Analysen (z. B. Immunoblots zur Überprüfung, ob das vom gezielten floxierten Gen kodierte Protein angemessen exprimiert wird).
8. Färben Sie 5 μm dicke FFPE-Gewebeschnitte mit Hämatoxylin und Eosin (H & E), um die Tumordiagnose durch einen qualifizierten Pathologen zu bestätigen. Führen Sie gegebenenfalls eine immunhistochemische Färbung (IHC) durch, um die Tumordiagnose zu bestätigen.
   1. Immunflecken-MPNSTs für S100 Calcium-bindendes Protein B (S100β), Nestin und geschlechtsbestimmende Region Y (SRY)-Box Transkriptionsfaktor 10 (Sox10)-drei Marker, die sowohl in MPNSTs als auch in Schwann-Zellen exprimiert werden (Tumorzellursprung) 5,6,14,15. Färben Sie die Tumore mit Antikörpern, die erbB4 erkennen, das Protein, das von dem Gen kodiert wird, das in nachgeschalteten Schritten für die Ablation bestimmt ist.
   2. Um die Diagnose zu bestätigen, lassen Sie einen qualifizierten Tierarzt oder Humanpathologen alle gefärbten Tumorobjektträger nach den Diagnose- und Einstufungskriterien ^5,6,7,16 der WHO beurteilen.

2. Ex-vivo-Ablation von floxierten Erbb4-Allelen in MPNST-Zellen

1. Aus frisch entnommenem MPNST-Gewebe werden frühe Passagekulturen hergestellt, indem das Gewebe aus Abschnitt 1 (Schritt 1.7.3) in 10 ml eiskalter steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf Eis gelegt und dann in einen sterilen Arbeitsbereich überführt wird (Abbildung 2B)¹⁶.
   HINWEIS: Alle nachfolgenden Eingriffe sind in einer sterilen Gewebekulturhaube durchzuführen.
2. Zerkleinern Sie das Tumorgewebe in 2-4 mm große Stücke und ritugrieren Sie 8-10 Mal in einer 10 cm² behandelten Gewebekulturschale mit 10 ml Wachstumsmedium. Kultivieren Sie diese Präparate in DMEM-10-Wachstumsmedium mit hohem Glukosegehalt (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fetalem Kälberserum, 1% Glutamin, 10 μg/ml Streptomycin und 10 I.E./ml Penicillin), ergänzt mit 10 nM Neuregulin-1β (NRG1β) und 2 μM Forskolin. Fügen Sie in diesem Stadium Forskolin hinzu, um das Wachstum häufiger kontaminierender Zelltypen wie Fibroblasten zu hemmen.
3. Halten Sie das mechanisch dissoziierte Gewebe und die Zellen für bis zu 3 Tage bei 37 ° C in einer 5% CO_{2-Atmosphäre,} um eine frühe Passagekultur zu etablieren. Trennen Sie an dieser Stelle keine dispergierten Zellen und verbleibenden Gewebefragmente.
4. Erfrischen Sie die Kulturen alle 3-4 Tage mit neuem Medium. Lassen Sie die Tumorzellen proliferieren, bis sie zusammenfließen.
5. Erweitern Sie die frühen Passagekulturen, indem Sie die konfluierenden Kulturen in mehrere Gerichte aufteilen. Entfernen Sie das Wachstumsmedium und waschen Sie die Zellen mit 1x dPBS. Dann fügen Sie 1 ml 0,25% Trypsin für 2-5 min bei Raumtemperatur pro 10 cm² behandelter Zellkulturschale hinzu. Ritugrieren Sie die Kultur vorsichtig, um die Ablösung zu erleichtern und eine Einzelzellsuspension zu erzeugen.
   1. Beenden Sie die Trypsinisierung, indem Sie 2 ml DMEM-10-Wachstumsmedium hinzufügen. Sammeln Sie die trypsinisierte Zellmischung und geben Sie sie in ein steriles 5-ml-Zentrifugenröhrchen. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 500 × g bei Raumtemperatur.
   2. Resuspendiert das Zellpellet in 5 ml DMEM-10. Teilen Sie die Zellen in zwei bis vier 10 cm Zellkulturschalen auf, die jeweils 10 ml Wachstumsmedien enthalten (ca. 1 ×^{10 6} Zellen pro Schale).
6. Nach 5 Passagen (Wiederholungsschritte in 2,5) ist das Wachstumsmedium ohne NRG1β und Forskolin zu verwenden. Immunisieren Sie eine Probe der Kultur mit einem Anti-S100β-Antikörper, um zu überprüfen, ob die Kultur ausschließlich aus Tumorzellen besteht. Pflegen Sie die Zellen in DMEM-10-Wachstumsmedium in allen nachfolgenden Passagen.
7. Zählen Sie bei der nächsten Passage die Zellen und frieren Sie einen Teil von P 0-GGFβ3 ein; Trp53^+/-; Erbb4 fl^/fl MPNST-Zellen aus konfluierenden Kulturen (3 × 10 6 Zellen/Durchstechflasche^).
8. Platte P 0-GGFβ3; Trp53^+/-; Erbb4 fl^/fl frühe Passage MPNST-Zellen mit einer Dichte von 1,5 × 10⁶ Zellen pro 10 cm behandelter Zellkulturschale in DMEM-10-Wachstumsmedium.
9.  Tag 0: (ca. 12-16 h nach dem Plattieren), die adhärenten Kulturen mit 2-4 ml dPBS waschen und mit Ad5CMV-Cre/eGFP oder Ad5CMV-eGFP an ca. 400 plaquebildenden Einheiten (pfu)/Zelle in 10 ml serumfreiem DMEM (d.h. 30 μL von 2 × 10 10 pfu Virus pro¹⁰ cm Schale) infizieren. Die floxierten Erbb4-Allele mit dem Adenovirus in der maximal tolerierten Viruskonzentration (Multiplizität der Infektion, MOI) abtragen, wie empirisch bestimmt. Ein Schema des Workflows für diese Ablation finden Sie in Abbildung 2C .
10. Tag 1: Ungefähr 16 Stunden später retten Sie die Kulturen, indem Sie dem Infektionscocktail 10 ml DMEM-10 hinzufügen.
11. Tag 2 - 3: FACS sortiert infizierte Zellen nach dem empfohlenen Protokoll der Kernanlage, um eGFP-positive Zellen etwa 48 Stunden nach der Infektion zu sortieren. Überprüfen Sie vor der FACS-Sortierung die Zellen kurz auf eGFP-Signal auf einem Fluoreszenzmikroskop, um sicherzustellen, dass die Kulturen effizient infiziert wurden (~ 50-100% positive Zellen). Rückführungszellen, die nach FACS zu 10 cm Gewebekulturschalen wiederhergestellt wurden; Reservieren Sie eine Schale für die genomische DNA-Isolierung.
12. Tag 4 - 5: Lassen Sie die Zellen nach der FACS-Sortierung in einem Gewebekultur-Inkubator für mindestens 24-48 h regenerieren und bereiten Sie die Zellen dann für zellbasierte In-vitro-Analysen oder In-vivo-Transplantationen vor. Bestätigen Sie die Erbb4-Deletion per PCR mit genomischer DNA, die aus einem Teil der sortierten eGFP-positiven Zellen isoliert wurde. Stellen Sie sicher, dass eGFP-positive Zellen ErbB4-negativ sind, durch PCR oder durch Immunfärbung einer Probe der Kultur mit einem Anti-erbB4-Antikörper.
    1. Isolieren Sie genomische DNA aus den Zellen mit der Standard-Säure-Guanidinium-Phenol- und Chloroform-basierten DNA-Isolationsmethode¹⁷.
    2. Führen Sie eine Standard-PCR durch, um floxierte Erbb4-Allele und ablatierte Erbb4-Allele zu unterscheiden. Führen Sie 40 Zyklen mit 2 ng DNA, 20 μM-Primern 1 + 2 durch, um ein 250 bp Erbb4-null-Produkt und ein 350 bp floxiertes Produkt¹³ herzustellen. Führen Sie sowohl PCR- als auch Antikörper-basierte Ansätze durch, um den Knockout zu bestätigen, wenn keine zuverlässigen Antikörper verfügbar sind.
       HINWEIS: Die Zellen sind bereit für zellbasierte In-vitro-Assays, wie unten beschrieben. Viele Arten von nachgelagerten Analysen können mit auf diese Weise präparierten Zellen durchgeführt werden. Der Zweck der unten vorgestellten Protokolle besteht darin, einige Beispiele für In-vitro- und In-vivo-Anwendungen dieser Tumorzellen nach der Ablation des Erbb4-Gens zu liefern.

3. Proliferations- und Lebensfähigkeitsassays in MPNST-Zellen mit ablatierten Erbb4-Allelen

1. Führen Sie in den nächsten sieben Tagen Proliferationsassays an sortierten MPNST-Zellen durch, die mit einem bildbasierten automatisierten Zytometer in einer Multiwell-Platte plattiert sind.
   1. Tag 6: Platte 2.000 Zellen pro Vertiefung in einem Endvolumen von 150 μL (~ 13.300 Zellen / ml) Wachstumsmedium in einer 96-Well-Platte. Führen Sie Messungen in dreifacher Ausfertigung für jede experimentelle Kohorte und 4 tägliche Endpunktwerte durch (3 Replikate x 2 Bedingungen x 4 Tage).
   2. Tag 7, 9, 11, 13: Färben Sie Zellen mit Hoechst- und Propidiumiodid (PI) -Farbstoffen und stellen Sie sie auf einem automatisierten Plattenleser ab, um die Anzahl der lebenden und toten Zellen in jedem Bohrloch zu zählen. Um dies zu erreichen, färben Sie die Zellen gleichzeitig mit Hoechst-Farbstoff, um die Kerne sowohl lebender als auch toter Zellen zu färben, und mit Propidiumiodid (PI), um die toten Zellen zu markieren. Führen Sie alle Lesevorgänge jeden Tag oder jeden zweiten Tag zur gleichen Zeit durch.
      1. Geben Sie 50 μL einer 4x PI/Hoechst-Färbelösung (je 4 μg/ml) zu jedem gut quantifizierten Tag (z. B. nur Tag 7) und inkubieren Sie für 30 min bei 37 °C im Gewebekultur-Inkubator. Halten Sie die Platte vor Licht geschützt.
         HINWEIS: Die Färbekonzentration von Hoechst muss empirisch bestimmt werden und kann je nach Zelltyp zwischen 1 und 10 μg/ml liegen.
      2. Lesen Sie die gefärbten Vertiefungen nach der Inkubation mit dem entsprechenden Fluoreszenzkanal auf dem automatisierten Zell-Imager. Bringen Sie die Platte nach dem Ablesen für zukünftige Lesevorgänge an den folgenden Tagen (d. h. an den Tagen 9, 11, 13) in den Inkubator zurück.
      3. Quantifizieren Sie die Färbeintensitäten basierend auf dem verwendeten Bildgebungssystem und berechnen Sie die Anzahl der toten Zellen, lebenden Zellen und Gesamtzellen mit den folgenden Einstellungen: blauer Kanal (377/50 nm, Hoechst): Gesamtzellen (lebend und tot); roter Kanal (531/40 nm, PI): nur tote Zellen; blau - rot (total - tot) = lebende Zellen.
2. Führen Sie den Zelllebensfähigkeitstest auf Wunsch über drei Tage nach dem Protokoll der Assay-Hersteller durch.
   HINWEIS: Lebensfähigkeitsassays können mit Proliferationsassays kombiniert werden, indem eine dreifache Färbung durchgeführt wird, einschließlich Calcein AM (488/32 nm; grüner Kanal, der speziell lebende Zellen markiert), PI und Hoechst. Ein Apoptose-Assay kann auch unter Verwendung von Kulturen durchgeführt werden, die wie oben beschrieben eingerichtet sind; Das spezifische Protokoll hängt vom Bildgebungssystem ab.
   1. Tag 6: Platte 4.000 Zellen pro Well in einem Endvolumen von 150 μL in einer 96-Well-Platte in dreifacher Ausfertigung.
   2. Tage 7 - 9: Fügen Sie 2.000x biolumineszierende Zelllebensfähigkeits-Assay-Reagenzien (Table of Materials) hinzu, bringen Sie die Platte in den Inkubator zurück und lesen Sie die Platte 1 Stunde später ab. Führen Sie jeden Tag zur gleichen Zeit nachfolgende Lesevorgänge durch. Für die Biolumineszenz-Assays (MTT) führen Sie den Assay genau wie in den Herstelleranweisungen beschrieben alle 24 h für 72 h mit einem Luminometerplattenleser durch.

4. RNA-Seq-Analysen und Identifizierung von Genen, deren Expression durch Erbb4-Verlust verändert wird

1. Tag 6: Isolieren Sie die Gesamt-RNA aus sortierten MPNST-Zellen mit Standard-Säure-Guanidinium-Phenol- und Chloroform-basierten Methoden. Für Experimente zum Nachweis von Veränderungen der mRNA-Spiegel zwischen zwei Kohorten ist die Gesamt-RNA aus mindestens drei biologischen Replikaten in jeder Kohorte herzustellen.
   1. Um Ereignisse zu eliminieren, die durch den adenoviralen Vektor oder die eGFP-Expression anstelle des Erbb4-Verlusts verursacht werden, isolieren Sie RNA aus drei biologischen Replikaten von P 0-GGFβ3; Trp53^+/-; Erbb4 fl^/fl MPNST-Zellen, transduziert mit Ad5CMV-Cre/eGFP und drei biologische Replikate, die mit Ad5CMV-eGFP transduziert wurden.
      HINWEIS: Isolierte RNA muss für die RNA-Seq-Analyse einen RNA-Integritätszahlwert (RIN) ≥ 8 aufweisen. Stellen Sie sicher, dass der Sequenzierungskern die RIN aller Stichproben bestimmt, bevor Bibliotheken erstellt werden.
2. Verwenden Sie 100-200 ng hochwertige Gesamt-RNA aus jeder Probe, um RNA-Seq-Bibliotheken vorzubereiten (arbeiten Sie mit der Kernsequenzierungsfunktion für diesen Schritt). Führen Sie Hochdurchsatz-Sequenzierungen mit einem DNA-Sequenzierer der nächsten Generation durch. Führen Sie für die mRNA-Quantifizierung eine einseitige Sequenzierung durch, um Fastq-Dateien zu generieren. Stellen Sie sicher, dass für jede Probe mindestens 50 Millionen Lesevorgänge erforderlich sind.
   HINWEIS: In Abbildung 3 finden Sie einen Schaltplan, der den Workflow veranschaulicht, der zur Verarbeitung von RNA-Seq-Daten und zur Quantifizierung der Expression von differentiell exprimierten Transkripten verwendet wird. Sequenzdaten in Form von Fastq-Dateien werden einer Qualitätskontrolle unterzogen; >80% der Lesevorgänge sollten einen Phred-Wert von 30 ergeben, der für die nachfolgende Analyse als angemessen erachtet werden kann. Die Sequenzen werden auch mit Trimmomatic¹⁸ vorverarbeitet (getrimmt), um Adaptersequenzen zu entfernen und Lesevorgänge von geringer Qualität herauszufiltern.
3. Führen Sie eine RNA-Seq-Ausrichtung und -Analyse der von fastq generierten Dateien mit einem beliebigen fähigen Softwareprogramm (z. B. DNAStar^19,20 oder Partek²¹⁾ durch. Befolgen Sie die programmspezifischen Schritte mit den Standardeinstellungen, um die fastq-Dateien am Mausreferenzgenom (GRCm38/mm10) auszurichten.
   HINWEIS: Am Beispiel von DNAStar wird der allgemeine Workflow unten beschrieben (Ergänzende Abbildung 1).
   1. Wählen Sie die Analysemethode RNA-Seq.
   2. Wählen Sie das Referenzgenom Maus aus.
   3. Laden Sie die BED-Datei hoch, wenn sie vom Sequenzierungskern bereitgestellt wird.
   4. Laden Sie die fastq-Sequenzierungsdateien hoch und weisen Sie ihnen eindeutige Replikatnamen zu.
   5. Replizieren Sie die fastq-Dateien und weisen Sie sie einem Replikatsatz (d. h. GFP, CRE) zu
      HINWEIS: Jedes Ausrichtungsprogramm hat seine spezifischen Schritte, und der Benutzer muss das Programmbenutzerhandbuch für das programmspezifische Protokoll konsultieren. Das Programm generiert dann genspezifische Rohzähldaten aus diesen Fastq-Dateien.
4. Führen Sie statistische und Normalisierungsanalysen (DESeq2, EdgeR) an den Rohzähldaten mit beliebigen fähigen Softwareprogrammen durch, wie in 4.3 beschrieben, wobei der Ad5CMV-eGFP-Probensatz als Kontrolldatensatz und der Ad5CMV-Cre-Satz als Testdatensatz zur Identifizierung differentieller Genexpressionssignale mit robuster statistischer Leistung^22,23 verwendet wird.
   1. Wählen Sie GFP fastq-Dateien als Steuerdatensatz aus.
   2. Wählen Sie DESeq2 als statistische und Normalisierungsmethode aus.
   3. Starten Sie die Montage und Analyse.
      HINWEIS: Jedes Ausrichtungsprogramm hat seine spezifischen Schritte, und der Benutzer muss das Programmbenutzerhandbuch für das programmspezifische Protokoll konsultieren. Das Programm generiert dann genspezifische Rohzähldaten aus diesen Fastq-Dateien. Die statistische und Normalisierungsanalyse ist ein eingebauter Schritt in vielen Programmen, wie im Beispiel hier gezeigt, innerhalb des Sequenzausrichtungsprotokolls. Wenn eine alternative Sequenzausrichtungssoftware verwendet wird, die diesen nachfolgenden integrierten Schritt nicht bietet, führen Sie die statistische und Normalisierungsanalyse der Rohzähldaten auf Terminalebene mit den in R geschriebenen DESeq2- oder EdgeR-Codierungspaketen durch, die auf Bioconductor.org kostenlos zum Download zur Verfügung stehen.
5. Verwenden Sie diese Ansätze, um Veränderungen zu identifizieren, die eine mindestens 1,5-fache Zunahme oder Abnahme im Vergleich zur Kontrolle darstellen (in diesem Fall Zellen, die mit dem Ad5CMV-eGFP-Virus transduziert wurden). Verwenden Sie nur die differentiell exprimierten Gene (DEGs), die als statistisch signifikant eingestuft wurden und ≥1,5-fache Veränderungen und einen p-Wert von 0,05 oder ein Padj von 0,1 für die anschließende funktionelle Anreicherungsanalyse zeigen.
   HINWEIS: Dadurch wird eine Liste der DEG-Gene und ihrer statistischen Aussagekraft für die funktionelle Anreicherungsanalyse generiert.
6. Führen Sie eine funktionelle Anreicherungsanalyse der statistisch signifikanten Erbb4-vermittelten DEG durch, die in 4.4 mit einer geordneten Genlistendatei unter Verwendung eines der frei verfügbaren webbasierten Tools identifiziert wurde. Bestimmung der biologischen und Signalwegsbedeutung des Erbb4-Genverlusts durch Genontologie-Datensätze, die in diese Open-Access-Tools zur funktionellen Anreicherungsanalyse integriert sind^24,25,26,27 (siehe die Tabelle der Materialien für Beispiele und Abbildung 3 für einen Beispiel-Workflow mit Panther^).
   1. Exportieren Sie die in Schritt 4.4 erhaltenen Daten als Tabellenkalkulation.
   2. Ordnen Sie die Daten nach log2 fold change, p/padj value oder beidem.
   3. Achten Sie darauf, alle nicht statistisch signifikanten Daten zu entfernen.
   4. Exportieren Sie die Ranked-Gen-Liste mit Gen-ID nur als .txt-Datei und laden Sie sie auf die Website hoch.
      HINWEIS: Verwenden Sie nur statistisch signifikante DEG (p/padj-Werte < 0,05 bzw. 0,1), um eine geordnete Input-Genliste zu generieren, die log2-fache Änderungen (am höchsten zu niedrigsten), p/padj-Werte (am niedrigsten bis höchste) oder beides [(-log10(pval)*sign(log2FC)] verwendet. Es gibt mehrere Ansätze, um eine Ranking-Genliste zu generieren, die für den Datensatz und die gestellte Frage empirisch ermittelt wird. Der spezifische Typ des Werkzeugs zur Analyse der funktionellen Anreicherung, das verwendet wird, kann auch bei der Bestimmung des geeigneten Typs der Rang-Genliste helfen. Weitere Ressourcen zu RNA-Seq finden Sie in den folgenden Artikeln^28,29,30.

5. Orthotope Allotransplantation von MPNST-Zellen mit ablatierten Erbb4-Allelen und Analyse der Wirkungen der Erbb4-Ablation

1. Bevor Sie orthotope Allotransplantate von sortierten MPNST-Zellen durchführen, stellen Sie sicher, dass alle Verfahren vom Institutional Animal Care and Use Committee überprüft und genehmigt werden und dass alle Verfahren von ordnungsgemäß geschultem Personal durchgeführt werden.
2. Entfernen Sie am Tag der Injektion Zellen mit niedriger Passage (etwa 85% Konfluenz) aus Zellkulturplatten oder -kolben mit einer nicht-enzymatischen Zelldissoziationslösung (z. B. einer Mischung von Chelatoren; siehe Materialtabelle) und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Für orthotope Injektionen in den Ischiasnerv rekonstituieren Sie die Zellen bei 16.667 Zellen / ml (50.000 Zellen pro 3 μL für jedes Tier) in DMEM-10³¹. Halten Sie die Zellen auf Eis.
   HINWEIS: Einige Kulturen werden keine Transplantate erfolgreich etablieren, es sei denn, die Zellen werden in eine Basalmembranmatrix mit niedrigem Wachstumsfaktor injiziert. Der Bedarf an einer Basalmembranmatrix (10-50%) muss empirisch ermittelt werden.
3. Beurteilung des In-vivo-Allotransplantat-Wachstumspotenzials in postinfizierten Zellen durch Injektion von MPNST-Zellen in den Ischiasnerv von 8-10 anästhesierten Hsd: Athymische Nude-Foxn1-Nu-Mäuse pro Kohorte (im Alter von 4-8 Wochen). Zur orthotopen Injektion von Tumorzellen siehe Turk et al³¹. Hier wird eine subkutane Injektion nachgewiesen.
   HINWEIS: Um die Anzahl der Versuchstiere zu bestimmen, die für die statistische Signifikanz benötigt werden, wenden Sie sich an einen Biostatistiker oder es wird empfohlen, G*Power3, eine frei verfügbare Software³², zu verwenden.
4. Überwachen Sie die Tiere in der ersten Woche nach der Injektion zweimal täglich auf Anzeichen von Schmerzen. Danach überwachen Sie die transplantierten Mäuse dreimal pro Woche auf Bremssattelmessungen und bewerten Sie die Body Condition Scores (BCSs) wie zuvor beschrieben ^5,31. Wie in den IACUC-Richtlinien beschrieben, sollten Tiere mit einem BCS von 2 oder weniger eingeschläfert werden.
5. Wenn gepfropfte Zellen mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten wachsen, bestimmen Sie die Transplantatzeiten empirisch mit (unveränderten) Kontrollzellen, bevor Sie die in diesem Abschnitt beschriebenen Experimente durchführen. Um die Transplantate am experimentellen Endpunkt zu sammeln, euthanasieren Sie die Mäuse human mit Kohlendioxid-Inhalation, gefolgt von zervikaler Dislokation als sekundäre Maßnahme. Notieren Sie die endgültigen Volumen- und Massenmessungen jedes Transplantats.
   ANMERKUNG: In unveränderter Form P 0-GGFβ3; Trp53^+/-; Erbb4^{fl / fl} MPNST-Zellen erreichen in der Regel die von IACUC zulässige maximale Größe innerhalb von 30-45 Tagen, eine typische Zeitleiste liegt etwa 30-45 Tage nach der Injektion.
6. Isolieren und Abschnittsgewebe wie in den Schritten 1.6-1.8 beschrieben. Fixieren Sie einen Teil des Transplantatgewebes über Nacht in 4% Paraformaldehyd (Abbildung 2) und betten Sie es dann in Paraffin ein. Bereiten Sie 5 μm-Schnitte aus dem FFPE-Gewebe vor und montieren Sie sie auf Objektträgern. H & E-Färbung und andere notwendige Immunfärbungen durchführen, um zu bestätigen, dass das Transplantatgewebe aus Tumorzellen besteht, wie in 1.8.1 beschrieben. Schocken Sie den Rest des Tumorgewebes für nachgelagerte Analysen ein, z. B. um den Verlust der Erbb4-Expression zu validieren und die Auswirkungen des Erbb4-Verlusts auf die Expression anderer Erbb-Familienmitglieder zu bewerten.
   HINWEIS: Die Bestätigung von Tumorzellen im Transplantatgewebe muss erfolgen, da immundefiziente Mäuse anfällig für die Entwicklung von Neoplasmen sind. Bei kleinen Transplantaten ist es wichtig sicherzustellen, dass Narbengewebe oder Entzündungen nicht mit einem Neoplasma verwechselt werden.
   1. Führen Sie eine Standard-IHC-Färbung auf dem FFPE-Gewebe durch, um die Expression von Proteinen von Interesse in Allotransplantaten zu vergleichen, die aus Ad5CMV-eGFP- und Ad5CMV-Cre/eGFP-behandelten Zellen gezüchtet wurden. Färben Sie das ausgeschnittene Transplantatgewebe mit erbB4-spezifischen Antikörpern, um Unterschiede in der in vivo erbB4-Expression zwischen den beiden experimentellen Bedingungen zu bestätigen. Bestimmen Sie den proliferativen Index über die Ki67-Färbung und den Grad der Apoptose über die terminale Desoxynukleotidyltransferase-vermittelte dUTP-Nick-End-Labeling-Färbung (TUNEL).
      HINWEIS: Jedes Proteinziel von Interesse kann auch über IHC beurteilt werden. Bewerten Sie beispielsweise die Gefäßdichte durch immunfärbende Allotransplantate mit einem Anti-CD31-Antikörper (1:50-Verdünnung), um in vivo vaskuläre Mikroumgebungsunterschiede zu bestimmen, die durch Genablation vermittelt werden. Die Anzahl der Gefäßprofile pro 40-fachem Feld kann für die Quantifizierung gezählt werden. Befolgen Sie bei diesen IHC-basierten Assays die Standard-IHC-Protokolle für die Färbeverfahren und das Herstellerprotokoll für die TUNEL-Färbung. Verwenden Sie zur Quantifizierung von Bildern das ImageJ-Plug-in "Automatisierte Zählung von einfarbigen Bildern".

Ergebnisse

Abbildung 4 zeigt ein typisches Ergebnis, das bei der Umleitung von P 0-GGFβ3 erzielt wird; Trp53^-/+; Erbb4 fl^/fl MPNST-Zellen entweder mit dem Ad5CMV-eGFP-Adenovirus oder Ad5CMV-Cre/eGFP-Adenovirus (Abbildung 4A). Kulturen werden mit Fluoreszenzmikroskopie betrachtet, um eGFP-exprimierende Zellen zu identifizieren, und mit Phasenkontrastmikroskopie, um die Gesamtzahl der im selben Feld vorhandenen Zellen bei 1...

Diskussion

Die hier vorgestellten detaillierten Methoden wurden unter Verwendung eines GEM-Modells von MPNSTs entwickelt. Wenn das interessierende Tumorgewebe jedoch in einzelne Zellen zerstreut werden kann, sind diese Methoden leicht für verschiedene Tumorarten anpassbar, die in GEMs auftreten. Es ist wichtig sicherzustellen, dass das floxierte Allel nicht zu i) vermindertem Überleben führt, das es schwierig machen kann, genügend Mäuse zu erhalten, um nach Tumoren zu suchen, oder ii) einer erhöhten Tumorlatenz, die es schwie...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ad5CMV-eGFP	Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa	VVC-U of Iowa-4
Ad5CMVCre-eGFP	Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa	VVC-U of Iowa-1174
alexa 568 secondary antibody	Thermo/Fisher	GaR A11036
Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics	Bioconductor	http://www.bioconductor.org	alternative statistical analysis tool used for step 4.4
CD31	Abcam	ab28364
Celigo Image Cytometer	Nexcelom Bioscience	N/A
Cell Stripper	Corning	25-056-Cl	mixture of chelators
DAB staining kit	Vector Labs	MP-7800
DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery)	DAVID	https://david.ncifcrf.gov	functional enrichment analysis software used for step 4.5
DMEM	Corning	15-013-Cl
DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR)	Thermo/Fisher	EP0701 and K1072
erbB4 antibodies	Santa Cruz	sc-284
erbB4 antibodies	Abcam	ab35374
erbB4 antibodies	Millipore	HFR1: 05-1133
FACS Sorter	BD Biosciences	Aria II
Forskolin	Sigma	F6886
GenomeSpace Tools and Data Sources	GenomeSpace	https://genomespace.org/support/tools/	general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5
Glutamine	Corning	25-005-Cl
Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool	Gorilla	N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il	functional enrichment analysis software used for step 4.5
GSEA Gene Set Enrichment Analysis	Broad Institute	N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp	functional enrichment analysis software used for step 4.5
HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice	Envigo (Previously Harlan Labs)	69
Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer)	Illumina	Hi Seq 2500	DNA sequencer used for step 4.2
Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis	DNAStar LaserGene software	N/A	software statistical and normalization analysis used for step 4.4
Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly	software alignment used for step 4.3	N/A	software alignment used for step 4.3
Matrigel, low growth factor basement membrane matrix	Corning	354230
NRG1-beta	In house	Generated by SLC, also commercially available from R & D Systems(396-HB-050/CF).
Nuclear Stain Hoeschst 33342	Thermo	62249
Panther Gene Ontology Classification System	Panther	http://pantherdb.org	functional enrichment analysis software used for step 4.5
Partek (BWA aligner and analyzer)	Partek, Ver 7	N/A	software alignment and statistical/normalization used for step 4.3
Pen/Strep	Corning	30-002-Cl
Primer 1: 5′-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT GTCTG- 3′	Eurofins Genomics	Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product;
Primer 2: 5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC AGAAGC-3′	Eurofins Genomics	Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product;
Primer 3: 5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA ACCCAG-3′	Eurofins Genomics	Primer 1 + 3: 350 bp wild-type ErbB4 product.
Propidium Iodine	Fisher	51-351-0
Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays	R&D Systems	ARY003B
Real time glo	Promega	G9712	bioluminescent cell viability assay
ToppGene Suite	ToppGene	https://toppgene.cchmc.org	functional enrichment analysis software used for step 4.5
Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent)	Invitrogen	15596026
Tyramide Signal Amplification Kit	Perkin Elmer	NEL721001EA