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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per eseguire knockout genici che sono embrionali letali in vivo in tumori derivati da modelli murini geneticamente modificati e quindi valutare l'effetto che il knockout ha sulla crescita, proliferazione, sopravvivenza, migrazione, invasione e trascrittoma in vitro e in vivo.

Abstract

Lo sviluppo di nuovi farmaci che colpiscono con precisione le proteine chiave nei tumori umani sta alterando fondamentalmente le terapie contro il cancro. Tuttavia, prima che questi farmaci possano essere utilizzati, le loro proteine bersaglio devono essere convalidate come bersagli terapeutici in specifici tipi di cancro. Questa convalida viene spesso eseguita eliminando il gene che codifica per il bersaglio terapeutico candidato in un modello di cancro del topo geneticamente modificato (GEM) e determinando quale effetto questo ha sulla crescita del tumore. Sfortunatamente, questioni tecniche come la letalità embrionale nei knockout convenzionali e il mosaicismo nei knockout condizionali spesso limitano questo approccio. Per superare queste limitazioni, è stato sviluppato un approccio per ablare un gene letale embrionale floxed di interesse in colture a breve termine di tumori maligni della guaina del nervo periferico (MPNNT) generati in un modello GEM.

Questo articolo descrive come stabilire un modello murino con il genotipo appropriato, derivare colture tumorali a breve termine da questi animali e quindi ablare il gene letale embrionale flossato utilizzando un vettore adenovirale che esprime Cre ricombinasi e proteina fluorescente verde potenziata (eGFP). Viene quindi dettagliata la purificazione delle cellule trasdotte con adenovirus utilizzando lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) e la quantificazione degli effetti che l'ablazione genica esercita sulla proliferazione cellulare, la vitalità, il trascrittoma e la crescita dell'allotrapianto ortotopico. Queste metodologie forniscono un approccio efficace e generalizzabile per identificare e convalidare bersagli terapeutici in vitro e in vivo. Questi approcci forniscono anche una fonte rinnovabile di cellule derivate da tumori a basso passaggio con artefatti di crescita in vitro ridotti. Ciò consente di studiare il ruolo biologico del gene bersaglio in diversi processi biologici come la migrazione, l'invasione, le metastasi e la comunicazione intercellulare mediata dal secretoma.

Introduzione

Prima degli ultimi due decenni, il trattamento dei tumori umani si basava fortemente sulla radioterapia e sugli agenti chemioterapici che miravano ampiamente alle popolazioni cellulari in rapida proliferazione danneggiando il DNA o inibendo la sintesi del DNA. Sebbene questi approcci abbiano inibito la crescita delle cellule tumorali, hanno anche avuto effetti collaterali deleteri su normali tipi di cellule in rapida proliferazione come le cellule epiteliali intestinali e le cellule del follicolo pilifero. Più recentemente, la terapia del cancro ha iniziato a utilizzare agenti chemioterapici che colpiscono con precisione le proteine all'interno delle vie di segnalazione che sono di fondamentale importanza per la crescita della neoplasia di un singolo paziente. Questo approccio, comunemente indicato come "Medicina di precisione", ha portato allo sviluppo di un repertorio in continua espansione di anticorpi monoclonali e piccoli inibitori molecolari. Questi agenti inibiscono efficacemente la proliferazione e la sopravvivenza delle cellule tumorali evitando gli effetti collaterali deleteri sui normali tipi di cellule osservati con agenti chemioterapici convenzionali e radioterapia. Gli anticorpi monoclonali utilizzati per il trattamento dei tumori umani più comunemente prendono di mira le molecole di superficie cellulare come i recettori del fattore di crescita1 (ad esempio, la grande famiglia di tirosin-chinasi del recettore di membrana) e i modulatori della risposta immunitaria2 (ad esempio, proteina di morte cellulare programmata 1, ligando di morte programmata 1). Piccoli inibitori molecolari possono inibire le proteine di superficie cellulare o le proteine di segnalazione che si trovano intracellulare3. Tuttavia, per impiegare efficacemente questi nuovi agenti terapeutici, è necessario stabilire che un particolare cancro dipende dalla molecola che viene presa di mira da un agente terapeutico candidato.

Sebbene questi nuovi agenti terapeutici abbiano effetti più mirati, molti di essi inibiscono ancora l'azione di più di una proteina. Inoltre, sono spesso disponibili più agenti con diversa efficacia e specificità per colpire una proteina specifica. Di conseguenza, durante le indagini precliniche, è consigliabile utilizzare approcci aggiuntivi come l'ablazione genetica per convalidare una proteina candidata come bersaglio terapeutico. Un approccio particolarmente utile per convalidare una proteina come bersaglio terapeutico è quello di ablare il gene che codifica la proteina candidata in un modello animale geneticamente modificato che sviluppa lo specifico tipo di cancro di interesse. Questo approccio può essere relativamente semplice se sono disponibili topi con una mutazione nulla (una mutazione naturale, una mutazione nulla geneticamente modificata [un "knockout"] o una mutazione nulla introdotta da una trappola genica) e i topi sono vitali nell'età adulta. Sfortunatamente, i topi con una mutazione nulla che soddisfano questi criteri spesso non sono disponibili, in genere perché la mutazione nulla provoca la morte embrionale o nei primi giorni di vita postnatale. In questa circostanza, i topi inclini a sviluppare il tipo di interesse tumorale possono invece essere incrociati con topi in cui segmenti chiave del gene di interesse sono affiancati da siti loxP ("floxed"), che consente al gene di essere ablato introducendo un transgene che esprime Cre ricombinasi nelle cellule tumorali (un knockout condizionale). Questo approccio offre diversi vantaggi. In primo luogo, se è disponibile un driver Cre che è espresso nel tumore ma non nel tipo di cellula che ha portato alla morte nei knockout convenzionali, questo approccio può potenzialmente convalidare il bersaglio terapeutico candidato. In secondo luogo, l'ablazione del gene che codifica per la proteina candidata nelle cellule tumorali ma non in altri elementi intratumorali come i fibroblasti associati al tumore o le cellule immunitarie consente allo sperimentatore di distinguere tra effetti autonomi delle cellule e non autonomi delle cellule del bersaglio terapeutico. Infine, un driver Cre inducibile da tamoxifene (CreERT2) consente allo sperimentatore di eliminare il gene di interesse in diverse fasi dello sviluppo del tumore e definire la finestra in cui l'agente terapeutico candidato ha maggiori probabilità di essere efficace.

Sfortunatamente, ci sono anche problemi tecnici che possono limitare l'uso di knockout condizionali nei tumori che si verificano nei modelli GEM. Ad esempio, un driver Cre che è espresso nelle cellule tumorali ed evita la delezione genica nelle cellule normali essenziali per la vita potrebbe non essere disponibile. Un altro problema, che può essere sottovalutato, è che i driver Cre e CreERT2 spesso ablano in modo variabile gli alleli floxati nei topi, con conseguente mosaicismo per la mutazione nulla in un cancro GEM. Quando ciò si verifica, le cellule tumorali in cui il gene bersaglio non è stato ablato continueranno a proliferare rapidamente, sovrascredendo le cellule tumorali con alleli ablatati. Il mosaicismo nelle linee driver cre può verificarsi a causa dell'espressione cre non onnipresente nel lignaggio mirato e della ricombinazione fallita in singole cellule indipendenti dall'espressione cre4. Questo è un fenomeno noto dei driver Cre che dipende dal tipo di cellula e dovrebbe essere considerato durante la progettazione sperimentale e l'interpretazione dei dati. Il mosaicismo può mascherare l'effetto del knockout e portare un investigatore a concludere erroneamente che il gene di interesse non è essenziale per la proliferazione e/o la sopravvivenza delle cellule tumorali e quindi non è un valido bersaglio terapeutico.

Molti di questi problemi sono stati riscontrati in uno studio precedente che ha tentato di determinare se il recettore tirosina chinasi erbB4 fosse un potenziale bersaglio terapeutico nelle cellule MPNST5. In questi studi, sono stati utilizzati topi che esprimono un transgene che codifica per il fattore di crescita gliale isoforma neuregulin-1 (NRG1) β3 (GGFβ3) sotto il controllo del promotore zero della proteina mielinica specifica della cellula di Schwann (topi P 0-GGFβ3). I topi P 0-GGFβ3 sviluppano neurofibromi plessiformi multipli che progrediscono fino a diventare MPNST attraverso un processo che ricapitola i processi di patogenesi del neurofibroma e della progressione del neurofibroma-MPNST plessiforme osservati in pazienti con la sindrome da suscettibilità tumorale autosomica dominante neurofibromatosi di tipo 1 (NF1)6. Quando incrociato a topi con una mutazione nulla Trp53, il risultante P 0-GGFβ3; I topi Trp53+/- sviluppano MPNST de novo come si vede in cis-Nf1+/-; Topi Trp53+/-.

Questi MPNNT ricapitolano la progressione dalle lesioni di grado II dell'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) a quelle di grado IV dell'OMS osservate negli esseri umani7. Nei topi P 0-GGFβ3, gli MPNNT insorgono all'interno di neurofibromi plessiformi preesistenti nel nervo trigemino (58%) e nelle radici del nervo dorsale spinale (68%)7; gli MPNST che si verificano in P 0-GGFβ3; I topi Trp53+/- hanno una distribuzione molto simile. Nell'uomo, gli MPNNT si presentano più comunemente nel nervo sciatico seguito dal plesso brachiale, dalle radici nervose spinali, dal vago, dal femore, dalla mediana, dal plesso sacrale, dall'otturatore popliteale e dai nervi tibiali e ulnari posteriori8. Questa distribuzione tumorale in questi modelli GEM è in qualche modo diversa da quella che si vede negli esseri umani. Tuttavia, gli MPNST che si presentano in P 0-GGFβ3 e P0-GGFβ3; I topi Trp53+/- sono istologicamente identici agli MPNNT umani, portano molte delle stesse mutazioni osservate negli MPNNT umani e ricapitolano il processo di progressione del neurofibroma-MPNST osservato nei pazienti NF1. La generazione di P 0-GGFβ3 o P0-GGFβ3; I topi Trp53+/- che erano Erbb4-/- non erano fattibili in quanto i topi con due alleli nulli Erbb4 muoiono in utero al giorno embrionale 10,5 secondari a difetti cardiaci9. Perché il salvataggio dell'espressione di Erbb4 nel cuore introducendo un transgene Erbb4 cardiaco-specifico (catena pesante α-miosina (MHC)-Erbb4) si traduce in topi Erbb4-/- vitali10, la generazione di topi con un complicato P 0-GGFβ3; Trp53+/-;α-MHC-Erbb4; È stato tentato il genotipo Erbb4-/-.

Tuttavia, gli accoppiamenti non hanno prodotto topi nei rapporti mendeliani attesi, indicando che il genotipo desiderato era deleterio. Pertanto, la generazione di P 0-GGFβ3; Trp53+/- topi con alleli Erbb4 floxed 11 e un driver CreERT2 è stato tentato di consentire la delezione di Erbb4 negli MPNNT che si verificano in questi topi. In questi animali erano ancora presenti numerose cellule tumorali con alleli Erbb4 intatti (mosaicismo). Il mosaicismo osservato potrebbe derivare da una somministrazione inefficiente di tamoxifene, che ha comportato differenze nell'efficienza di ricombinazione all'interno del tessuto. La possibilità di meccanismi compensativi spontanei potrebbe contribuire ulteriormente al mosaicismo nella ricombinazione mediata da tamoxifene bypassando il requisito per l'espressione di Erbb4. È possibile che la perdita di Trp53 renda le cellule tumorali suscettibili ad ulteriori mutazioni spontanee "permissive" che potrebbero confondere l'interpretazione dei dati. Poiché sembrava probabile che le cellule MPNST intatte di Erbb4 avrebbero mascherato le conseguenze dell'ablazione di Erbb4 in altre cellule tumorali, questo approccio è stato abbandonato.

Questi ostacoli hanno portato allo sviluppo di una metodologia per l'ablazione di Erbb4 in cellule MPNST a passaggio molto precoce utilizzando un adenovirus che esprime Cre ricombinasi ed eGFP. Queste cellule possono essere separate dalle cellule non infette utilizzando FACS, che riduce notevolmente il mosaicismo per il gene Erbb4 ablato. Di seguito, vengono descritti i metodi utilizzati per raggiungere questo obiettivo, insieme ai metodi utilizzati per valutare gli effetti dell'ablazione genica in vitro e in vivo. Il seguente protocollo è un esempio di come produrre topi portatori di tumore che producono tumori portatori di alleli floxed di geni letali embrionali di interesse per l'escissione ex vivo prima della valutazione della crescita tumorale allotrapianto in vivo . Ciò include una descrizione degli approcci utilizzati per analizzare l'effetto che l'ablazione di Erbb4 esercita sulla proliferazione delle cellule tumorali, sulla sopravvivenza e sull'espressione genica in vitro e sulla proliferazione, la sopravvivenza e l'angiogenesi negli alloinnesti ortotopici.

Protocollo

Prima di eseguire qualsiasi procedura con i topi, tutte le procedure devono essere riviste e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali. Il protocollo descritto in questo manoscritto è stato approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Medical University of South Carolina. Questo protocollo è stato eseguito da personale adeguatamente addestrato seguendo le linee guida istituzionali per la cura degli animali del MUSC.

1. Generazione di topi che sviluppano MPNST omozigoti per alleli flox Erbb4

  1. Produrre la generazione F1 di P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/+ animali mediante accoppiamento P 0-GGFβ3; Trp53+/- mouse7 con mouse Erbb4fl/fl 11. Utilizzare un quadrato di Punnett (Figura 1) per guidare lo schema di allevamento per garantire che vengano generati un numero sufficiente di cuccioli di F1 maschi e femmine con il P 0-GGFβ3 desiderato; Trp53+/-; Genotipo Erbb4fl/+.
  2. Prole del genotipo F1 isolando il DNA genomico da un frammento di coda raccolto in conformità con le linee guida IACUC e quindi eseguire la PCR utilizzando primer precedentemente descritti per rilevare il transgene P 0-GGFβ312, Trp53 wild type (+) e null (-) alleli7 e Erbb4flox e Erbb4 wild-type alleli13.
    1. Isolare il DNA della coda utilizzando metodi dettagliati su jacks-lab.mit.edu/protocols.
    2. Fare la miscela di reazione PCR con 25 ng DNA, 0,25 nM dNTPs, 0,02 U / μL Taq, 0,5 μM di ciascun primer e 1x buffer PCR. Eseguire la reazione PCR con una singola incubazione a 95 °C (per fondere il DNA genomico e attivare Taq) per 1 min seguita da 35 cicli pcr di 94 °C, 10 s (fusione); 55 °C, 30 s (ricottura); 72 °C, 40 s (estensione) seguito da un singolo 72 °C (estensione) per 5 min. Conservare le reazioni a 4 °C fino a quando non sarà pronto per essere eseguito con un gel di agarosio all'1,2-1,5%.
      NOTA: la temperatura di ricottura dipende dal sistema tampone PCR utilizzato; si consiglia di eseguire un gradiente di temperatura di ricottura per determinare la corretta temperatura di ricottura.
  3. Produrre la generazione F2 di P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4 fl/fl animali accoppiando la progenie F1 appropriata (P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/+) tra loro.
    NOTA: la Figura 1 illustra le previsioni del quadrato di Punnet utilizzate per calcolare il numero previsto di prole F2 con il genotipo desiderato.
  4. Identificare gli animali con il P 0-GGFβ3 desiderato; Trp53-/+; Genotipo Erbb4fl/fl come descritto al punto 1.2.
  5. Accoppiare F2 progenie l'uno con l'altro per mantenere il P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/fl colonia e genotipo tutti i cuccioli. Confermare che l'allele floxed appena introdotto non comprometta la sopravvivenza o la latenza tumorale. Raggiungere questo obiettivo stabilendo coorti (20 topi / coorte) di P 0-GGFβ3; Trp53+/- e P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl / fl topi e seguire la loro sopravvivenza e frequenza di insorgenza del tumore.
  6. Monitorare gli animali più volte alla settimana fino al raggiungimento dell'endpoint sperimentale (dimensione massima consentita del tumore/endpoint umano approvato dalla IACUC).
    1. Durante il monitoraggio settimanale, valutare il peso corporeo, il normale comportamento sociale e di toelettatura e le misurazioni delle dimensioni del tumore. Organizzare una valutazione veterinaria in caso di perdita di peso del >10% del peso corporeo, isolamento sociale e curvatura.
    2. Quando viene identificato un topo portatore di tumore che ha raggiunto il suo endpoint umano, eutanasizzare umanamente l'animale usando l'inalazione di anidride carbonica seguita da lussazione cervicale e rimuovere sterilemente il tumore usando un coltello da bisturi. Effettuare misurazioni del tumore misurando lunghezza, larghezza e profondità utilizzando una pinza e un tumore di peso (massa e volume). Lavora rapidamente per evitare l'autolisi.
  7. Sezionare il tumore in tre sezioni utilizzando tagli in stile breadloaf con un coltello a bisturi in condizioni sterili per generare segmenti di tessuto per la fissazione della formalina / incorporamento di paraffina (FFPE), la generazione di colture a passaggio precoce e il materiale congelato con flash (Figura 2A).
    1. Assicurarsi che la Sezione 1 (per la generazione di colture a passaggio precoce, fase 1.7.2) sia circa il 10% del volume totale del tumore, la Sezione 2 (per la fissazione e l'IHC, fase 1.7.3) sia il 70% del volume totale del tumore e la Sezione 3 (per il congelamento del flash, la fase 1.7.4) sia il 20% del volume totale del tumore.
    2. Prendere la sezione 1 del tumore per la preparazione di colture di passaggio precoce (vedi sotto).
    3. Fissare la sezione 2 del tumore in paraformaldeide al 4% durante la notte a 4 °C e quindi incorporarla in paraffina (formalina fissata con paraffina incorporata (FFPE) per il workup diagnostico.
    4. Sezione 3 per le analisi analitiche (ad esempio, immunoblot per verificare che la proteina codificata dal gene floxed mirato sia espressa in modo appropriato).
  8. Colorazione di sezioni di tessuto FFPE spesse 5 μm con ematossilina ed eosina (H & E) per confermare la diagnosi del tumore da parte di un patologo qualificato. Se appropriato, eseguire la colorazione immunoistochimica (IHC) per confermare la diagnosi del tumore.
    1. MPNST immunostain per la proteina B legante il calcio S100 (S100β), la nestina e la regione che determina il sesso Y (SRY)-Box fattore di trascrizione 10 (Sox10)-tre marcatori che sono espressi sia nelle MPNST che nelle cellule di Schwann (origine delle cellule tumorali)5,6,14,15. Macchiare i tumori con anticorpi che riconoscono erbB4, la proteina codificata dal gene bersaglio per l'ablazione nelle fasi a valle.
    2. Per confermare la diagnosi, chiedi a un veterinario qualificato o a un patologo umano di valutare tutti i vetrini tumorali colorati seguendo i criteri diagnostici e di classificazione dell'OMS 5,6,7,16.

2. Ablazione ex vivo di alleli Erbb4 floxati in cellule MPNST

  1. Stabilire colture di passaggio precoce da tessuto MPNST appena raccolto posizionando il tessuto della sezione 1 (fase 1.7.3) in 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato sterile (PBS) ghiacciato su ghiaccio e quindi trasferendolo in un'area di lavoro sterile (Figura 2B)16.
    NOTA: Tutte le procedure successive devono essere eseguite in una cappa di coltura tissutale sterile.
  2. Tritare il tessuto tumorale in pezzi da 2-4 mm e triturare 8-10 volte in un piatto di coltura tissutale trattato di 10 cm2 con 10 ml di terreno di coltura. Coltivare questi preparati in mezzo di crescita DMEM-10 ad alto contenuto di glucosio (Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) contenente il 10% di siero fetale di vitello, l'1% di glutammina, 10 μg/mL di streptomicina e 10 UI/mL di penicillina) integrato con 10 nM neuregulin-1β (NRG1β) e 2 μM di forskolina. Aggiungere forskolin in questa fase per inibire la crescita di comuni tipi di cellule contaminanti come i fibroblasti.
  3. Mantenere il tessuto e le cellule meccanicamente dissociati per un massimo di 3 giorni a 37 °C in un'atmosfera di CO2 al 5% per stabilire una coltura di passaggio precoce. Non separare le cellule disperse e i frammenti di tessuto rimanenti a questo punto.
  4. Aggiorna le culture con nuovi mezzi ogni 3-4 giorni. Permettere alle cellule tumorali di proliferare fino a quando non sono confluenti.
  5. Espandi le culture di passaggio precoce dividendo le culture confluenti in diversi piatti. Rimuovere il mezzo di crescita e lavare le cellule con 1x dPBS. Quindi, aggiungere 1 mL di tripsina allo 0,25% per 2-5 minuti a temperatura ambiente per 10 cm2 piatto di coltura cellulare trattata. Triturare delicatamente la coltura per facilitare il distacco e generare una sospensione unicellulare.
    1. Terminare la tripsinizzazione aggiungendo 2 ml di terreno di crescita DMEM-10. Raccogliere la miscela di cellule tripsinizzate e trasferirla in un tubo di centrifuga sterile da 5 ml. Pellet le celle per centrifugazione per 5 min a 500 × g a temperatura ambiente.
    2. Risospesciare il pellet di cella in 5 ml di DMEM-10. Dividere le cellule in due o quattro piatti di coltura cellulare da 10 cm, ciascuno contenente 10 ml di terreno di crescita (circa 1 × 106 cellule per piatto).
  6. Dopo 5 passaggi (passaggi ripetuti in 2.5), utilizzare il mezzo di crescita senza NRG1β e forskolin. Immunostain un campione della coltura con un anticorpo anti-S100β per verificare che la coltura sia composta esclusivamente da cellule tumorali. Mantenere le cellule nel mezzo di crescita DMEM-10 in tutti i passaggi successivi.
  7. Al passaggio successivo, contare le cellule e congelare una porzione di P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/fl MPNST cellule raccolte da colture confluenti (3 × 106 cellule/flaconcino).
  8. Piastra P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/fl cellule MPNST a passaggio precoce ad una densità di 1,5 × 106 cellule per piatto di coltura cellulare trattato da 10 cm nel mezzo di crescita DMEM-10.
  9.  Giorno 0: (Circa 12-16 ore dopo la placcatura), lavare le colture aderenti con 2-4 mL di dPBS e infettare con Ad5CMV-Cre/eGFP o Ad5CMV-eGFP a circa 400 unità formanti placche (pfu)/cellula in 10 mL di DMEM senza siero (cioè 30 μL di 2 × 1010 pfu di virus per piatto di 10 cm). Ablare gli alleli floxed Erbb4 utilizzando l'adenovirus alla massima concentrazione virale tollerata (molteplicità di infezione, MOI), come determinato empiricamente. Fare riferimento alla Figura 2C per uno schema del flusso di lavoro per questa ablazione.
  10. Giorno 1: Circa 16 ore dopo, salvare le colture aggiungendo 10 ml di DMEM-10 al cocktail di infezione.
  11. Giorno 2 - 3: FACS smista le cellule infette seguendo il protocollo raccomandato dalla struttura principale per ordinare le cellule eGFP-positive circa 48 ore dopo l'infezione. Prima dello smistamento FACS, controllare brevemente le cellule per il segnale eGFP su un microscopio a fluorescenza per assicurarsi che le colture siano state infettate in modo efficiente (~ 50-100% cellule positive). Cellule di ritorno recuperate dopo FACS a piatti di coltura tissutale di 10 cm; riservare un piatto per l'isolamento del DNA genomico.
  12. Giorno 4 - 5: Dopo lo smistamento FACS, lasciare che le cellule recuperino in un incubatore di colture tissutali per almeno 24-48 ore e quindi preparare le cellule per analisi cellulari in vitro o innesti in vivo . Confermare la delezione di Erbb4 tramite PCR utilizzando DNA genomico isolato da una porzione delle cellule eGFP-positive ordinate. Verificare che le cellule eGFP-positive siano ErbB4-negative mediante PCR o immunocolorando un campione della coltura con un anticorpo anti-erbB4.
    1. Isolare il DNA genomico dalle cellule utilizzando il metodo standard di isolamento del DNA acido-guanidinio-fenolo e cloroformio17.
    2. Eseguire la PCR standard per distinguere gli alleli Erbb4 floxati e gli alleli Erbb4 ablati. Eseguire 40 cicli con 2 ng DNA, 20 μM primer 1 + 2 per produrre un prodotto Erbb4-null da 250 bp e un prodotto floxed da 350 bp13. Eseguire sia approcci basati su PCR che su anticorpi per confermare il knockout quando non sono disponibili anticorpi affidabili.
      NOTA: le cellule sono pronte per i test in vitro basati su cellule come descritto di seguito. Molti tipi di analisi a valle possono essere eseguite con cellule preparate in questo modo. Lo scopo dei protocolli presentati di seguito è quello di fornire alcuni esempi di applicazioni in vitro e in vivo di queste cellule tumorali post-ablazione del gene Erbb4 .

3. Saggi di proliferazione e vitalità in cellule MPNST con alleli Erbb4 ablati

  1. Eseguire saggi di proliferazione nei prossimi sette giorni su cellule MPNST ordinate placcate in una piastra multiwell utilizzando un citometro automatizzato basato su immagini.
    1. Giorno 6: Piastra 2.000 cellule per pozzetto in un volume finale di 150 μL (~ 13.300 cellule / mL) di terreno di coltura in una piastra a 96 pozzetti. Eseguire misurazioni in triplice copia per ogni coorte sperimentale e 4 letture giornaliere dell'endpoint (3 repliche x 2 condizioni x 4 giorni).
    2. Giorni 7, 9, 11, 13: Macchiare le cellule con coloranti Hoechst e ioduro di propidio (PI) e visualizzarle su un lettore automatico di lastre per contare il numero di cellule vive e morte in ciascun pozzetto. Per raggiungere questo obiettivo, colorare contemporaneamente le cellule con il colorante Hoechst per colorare i nuclei delle cellule viventi e morte e con lo ioduro di propidio (PI) per etichettare le cellule morte. Esegui tutte le letture alla stessa ora ogni giorno o a giorni alterni.
      1. Aggiungere 50 μL di una soluzione colorante 4x PI/Hoechst (4 μg/mL ciascuno) a ciascun pozzo quantificato quel giorno (ad esempio, solo giorno 7) e incubare per 30 minuti a 37 °C nell'incubatore di colture tissutali. Tenere la piastra protetta dalla luce.
        NOTA: La concentrazione di colorazione di Hoechst deve essere determinata empiricamente e può variare da 1 a 10 μg/mL a seconda del tipo di cellula.
      2. Leggere i pozzetti macchiati dopo l'incubazione utilizzando il canale fluorescente appropriato sull'imager cellulare automatizzato. Dopo aver letto, restituire la piastra all'incubatrice per le letture future nei giorni successivi (ad esempio, giorni 9, 11, 13).
      3. Quantificare le intensità di colorazione in base al sistema di imaging utilizzato e calcolare il numero di cellule morte, cellule viventi e cellule totali utilizzando le seguenti impostazioni: canale blu (377/50 nm, Hoechst): cellule totali (vive e morte); canale rosso (531/40 nm, PI): solo cellule morte; blu - rosso (totale - morto) = cellule vive.
  2. Eseguire il test di vitalità cellulare per tre giorni, se lo si desidera, seguendo il protocollo dei produttori del test.
    NOTA: i saggi di vitalità possono essere combinati con i saggi di proliferazione eseguendo una tripla colorazione che include calceina AM (488/32 nm; canale verde, in particolare etichette per cellule viventi), PI e Hoechst. Un test di apoptosi può anche essere eseguito utilizzando colture impostate come descritto sopra; il protocollo specifico dipenderà dal sistema di imaging.
    1. Giorno 6: Piastra 4.000 celle per pozzetto in un volume finale di 150 μL in una piastra a 96 pozzetti in triplice copia.
    2. Giorni 7 - 9: Aggiungere 2.000x reagenti per il saggio di vitalità cellulare bioluminescente (Tabella dei materiali), restituire la piastra all'incubatore e leggere la piastra 1 ora dopo. Esegui letture successive alla stessa ora ogni giorno. Per i saggi di bioluminescenza (MTT), eseguire il test esattamente come indicato nelle istruzioni del produttore ogni 24 ore per 72 ore utilizzando un lettore di piastre luminometriche.

4. Analisi RNA-Seq e identificazione di geni la cui espressione è alterata dalla perdita di Erbb4

  1. Giorno 6: Isolare l'RNA totale da cellule MPNST selezionate utilizzando metodi standard a base di acido-guanidinio-fenolo e cloroformio. Per gli esperimenti progettati per rilevare i cambiamenti nei livelli di mRNA tra due coorti, preparare l'RNA totale da almeno tre repliche biologiche in ciascuna coorte.
    1. Per eliminare gli eventi causati dal vettore adenovirale o dall'espressione di eGFP piuttosto che dalla perdita di Erbb4, isolare l'RNA da tre repliche biologiche di P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Cellule MPNST Erbb4fl/fl trasdotte con Ad5CMV-Cre/eGFP e tre repliche biologiche trasdotte con Ad5CMV-eGFP.
      NOTA: l'RNA isolato deve avere un punteggio di RNA integrity number (RIN) ≥ 8 per l'analisi RNA-Seq. Assicurarsi che il nucleo di sequenziazione determini il RIN di tutti i campioni prima di costruire librerie.
  2. Utilizzare 100-200 ng di RNA totale di alta qualità da ciascun campione per preparare le librerie RNA-Seq (lavorare con la struttura di sequenziamento del nucleo per questo passaggio). Esegui il sequenziamento ad alto rendimento utilizzando un sequenziatore di DNA di nuova generazione. Per la quantificazione dell'mRNA, eseguire il sequenziamento single-ended per generare file Fastq. Garantire un minimo di 50 milioni di letture per ogni campione.
    NOTA: fare riferimento alla Figura 3 per uno schema che illustra il flusso di lavoro utilizzato per elaborare i dati RNA-Seq e per quantificare l'espressione di trascrizioni differenzialmente espresse. I dati di sequenza, sotto forma di file Fastq, sono sottoposti a procedure di controllo qualità; >80% delle letture dovrebbe produrre un punteggio Phred di 30 per essere considerato appropriato per l'analisi successiva. Le sequenze vengono anche preelaborate (tagliate) utilizzando Trimmomatic18 per rimuovere le sequenze dell'adattatore e filtrare le letture di bassa qualità.
  3. Eseguire l'allineamento e l'analisi RNA-Seq sui file generati da fastq utilizzando qualsiasi programma software capace (ad esempio, DNAStar19,20 o Partek21). Seguire i passaggi specifici del programma utilizzando le impostazioni predefinite per allineare i file fastq al genoma di riferimento del mouse (GRCm38/mm10).
    NOTA: utilizzando DNAStar come esempio, il flusso di lavoro generale è descritto di seguito (Figura supplementare 1).
    1. Selezionare il metodo di analisi, RNA-Seq.
    2. Selezionare il genoma di riferimento, Mouse.
    3. Caricare il file BED se fornito dal nucleo di sequenziazione.
    4. Carica i file di sequenziamento fastq, assegnando loro nomi di replica univoci.
    5. Replica di gruppo dei file fastq e designarli in un set di replica (ad esempio, GFP, CRE)
      NOTA: ogni programma di allineamento ha i suoi passaggi specifici e l'utente deve consultare la guida dell'utente del programma per il protocollo specifico del programma. Il programma genererà quindi dati di conteggio grezzi specifici del gene da questi file Fastq.
  4. Eseguire analisi statistiche e di normalizzazione (DESeq2, EdgeR) sui dati di conteggio grezzi utilizzando qualsiasi programma software capace, come descritto in 4.3, con il campione Ad5CMV-eGFP impostato come set di dati di controllo e Ad5CMV-Cre impostato come set di dati di test per identificare segnali di espressione genica differenziale con una robusta potenza statistica22,23.
    1. Selezionare i file GFP fastq come set di dati di controllo.
    2. Selezionare DESeq2 come metodo statistico e di normalizzazione .
    3. Avviate l'assemblaggio e l'analisi.
      NOTA: ogni programma di allineamento ha i suoi passaggi specifici e l'utente deve consultare la guida dell'utente del programma per il protocollo specifico del programma. Il programma genererà quindi dati di conteggio grezzi specifici del gene da questi file Fastq. L'analisi statistica e di normalizzazione è un passaggio integrato in molti programmi, come mostrato nell'esempio qui, all'interno del protocollo di allineamento della sequenza. Se si utilizza un programma software alternativo di allineamento delle sequenze che non offre questo successivo passaggio integrato, eseguire l'analisi statistica e di normalizzazione sui dati di conteggio grezzi a livello di terminale utilizzando i pacchetti di codifica DESeq2 o EdgeR scritti in R, disponibili gratuitamente per il download su Bioconductor.org.
  5. Utilizzare questi approcci per identificare i cambiamenti che rappresentano almeno un aumento o una diminuzione di 1,5 volte rispetto al controllo (in questo caso, le cellule trasdotte con il virus Ad5CMV-eGFP). Utilizzare solo quei geni differenzialmente espressi (DEG) determinati per essere statisticamente significativi che mostrano cambiamenti ≥1,5 volte e un valore p 0,05 o un padj di 0,1 per la successiva analisi di arricchimento funzionale.
    NOTA: Questo genererà un elenco di geni DEG e il loro potere statistico per l'analisi dell'arricchimento funzionale.
  6. Eseguire analisi di arricchimento funzionale su DEG mediato da Erbb4 statisticamente significativo identificato in 4.4 con un file di elenco genetico classificato utilizzando uno qualsiasi degli strumenti basati sul web liberamente disponibili. Determinare il significato biologico e del percorso della perdita del gene Erbb4 attraverso set di dati di ontologia genica integrati in questi strumenti di analisi dell'arricchimento funzionale ad accesso aperto 24,25,26,27 (vedere la Tabella dei materiali per esempi e la Figura 3 per un flusso di lavoro di esempio utilizzando Panther).
    1. Esportare i dati ottenuti nel passaggio 4.4 come foglio di calcolo.
    2. Classificare i dati in base alla modifica della piega log2, al valore p/padj o a entrambi.
    3. Assicurati di rimuovere tutti i dati non statisticamente significativi.
    4. Esporta l'elenco dei geni classificati con ID gene solo come file .txt e caricalo sul sito web.
      NOTA: utilizzare solo DEG statisticamente significativi (valori p/padj < rispettivamente 0,05 o 0,1) per generare un elenco di geni di input classificato utilizzando le variazioni di piega log2 (dal più alto al più basso), i valori p/padj (dal più basso al più alto) o entrambi [(-log10(pval)*sign(log2FC)]. Esistono diversi approcci per generare un elenco di geni classificati ed è determinato empiricamente per il set di dati e la domanda posta. Il tipo specifico di strumento di analisi dell'arricchimento funzionale utilizzato può anche aiutare a determinare il tipo appropriato di elenco di geni di rango. Per ulteriori risorse su RNA-Seq, vedere i seguenti articoli 28,29,30.

5. Allotrapianto ortotopico di cellule MPNST con alleli Erbb4 ablati e analisi degli effetti dell'ablazione di Erbb4

  1. Prima di eseguire l'alloinnesto ortotopico delle cellule MPNST selezionate, assicurarsi che tutte le procedure siano esaminate e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali e che tutte le procedure siano eseguite da personale adeguatamente addestrato.
  2. Il giorno dell'iniezione, rimuovere le cellule a passaggio basso (circa l'85% di confluenza) dalle piastre di coltura cellulare o dai palloni utilizzando una soluzione di dissociazione cellulare non enzimatica (ad esempio, una miscela di chelanti; vedere la Tabella dei materiali) e contare le cellule usando un emocitometro. Per le iniezioni ortotopiche nel nervo sciatico, ricostituire le cellule a 16.667 cellule/mL (50.000 cellule per 3 μL per ogni animale) in DMEM-1031. Mantenere le cellule sul ghiaccio.
    NOTA: Alcune colture non stabiliranno con successo gli innesti a meno che le cellule non vengano iniettate nella matrice della membrana basale a basso fattore di crescita. Il requisito di una matrice di membrana basale (10-50%) deve essere determinato empiricamente.
  3. Valutare il potenziale di crescita dell'allotrapianto in vivo nelle cellule post-infette iniettando cellule MPNST nel nervo sciatico di 8-10 topi nu Hsd anestetizzati: Athymic Nude-Foxn1 nu per coorte (di età compresa tra 4-8 settimane). Per l'iniezione ortotopica di cellule tumorali, fare riferimento a Turk et al31. Qui, viene dimostrata un'iniezione sottocutanea.
    NOTA: Per determinare il numero di animali da esperimento necessari per la significatività statistica, consultare un biostatistico o si consiglia di utilizzare G*Power3, un softwaredisponibile gratuitamente 32.
  4. Monitorare attentamente gli animali due volte al giorno per la prima settimana dopo l'iniezione per eventuali segni di dolore. Successivamente, monitorare i topi innestati tre volte alla settimana per le misurazioni della pinza e valutare i punteggi delle condizioni corporee (BCS) come precedentemente descritto 5,31. Come indicato nelle linee guida IACUC, l'eutanasia degli animali con un BCS di 2 o meno.
  5. Man mano che le cellule innestate crescono a velocità diverse, determinare empiricamente i tempi di innesto utilizzando cellule di controllo (non modificate) prima di eseguire gli esperimenti descritti in questa sezione. Per raccogliere gli innesti all'endpoint sperimentale, eutanasizzare i topi in modo umano usando l'inalazione di anidride carbonica seguita dalla lussazione cervicale come misura secondaria. Registrare le misurazioni finali del volume e della massa di ciascun innesto.
    NOTA: Come P 0-GGFβ3 non modificato; Trp53+/-; Le cellule MPNST Erbb4fl/fl raggiungono tipicamente la dimensione massima consentita dalla IACUC entro 30-45 giorni, una tempistica tipica è di circa 30-45 giorni dopo l'iniezione.
  6. Isolare e sezionare il tessuto come descritto nei passaggi 1.6-1.8. Fissare parte del tessuto dell'innesto durante la notte in paraformaldeide al 4% (Figura 2) e quindi incorporarlo nella paraffina. Preparare sezioni da 5 μm dal tessuto FFPE e montarle su vetrini. Eseguire la colorazione H&E e altre immunocolorazioni necessarie per confermare che il tessuto dell'innesto è composto da cellule tumorali come descritto al punto 1.8.1. Snap-freeze il resto del tessuto tumorale per analisi a valle, come la convalida della perdita di espressione di Erbb4 e la valutazione degli effetti della perdita di Erbb4 sull'espressione di altri membri della famiglia Erbb .
    NOTA: La conferma delle cellule tumorali nel tessuto dell'innesto deve essere fatta perché i topi immunodeficienti sono inclini a sviluppare neoplasie. Nel caso di piccoli innesti, è importante assicurarsi che il tessuto cicatriziale o l'infiammazione non vengano scambiati per una neoplasia.
    1. Eseguire la colorazione IHC standard sul tessuto FFPE per confrontare l'espressione di proteine di interesse in alloinnesti coltivati da cellule trattate con Ad5CMV-eGFP e Ad5CMV-Cre/eGFP. Colorare il tessuto dell'innesto asportato utilizzando anticorpi specifici di erbB4 per confermare le differenze nell'espressione di erbB4 in vivo tra le due condizioni sperimentali. Determinare l'indice proliferativo tramite la colorazione Ki67 e il livello di apoptosi tramite colorazione terminale di dUTP nick-end labeling (TUNEL) mediata dalla deossinucleotidiltransferasi.
      NOTA: Qualsiasi bersaglio proteico di interesse può anche essere valutato tramite IHC. Ad esempio, valutare la densità vascolare immunocolorando gli alloinnesti con un anticorpo anti-CD31 (diluizione 1:50) per determinare le differenze in vivo del microambiente vascolare mediate dall'ablazione genica. Il numero di profili vascolari per campo 40x può essere contato per la quantificazione. Per questi test basati su IHC, seguire i protocolli IHC standard per le procedure di colorazione e il protocollo del produttore per la colorazione TUNEL. Per la quantificazione delle immagini, utilizzare il plug-in ImageJ "conteggio automatico dell'immagine a colore singolo".

Risultati

La Figura 4 illustra un risultato tipico ottenuto durante la trasduzione di P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Cellule MPNST Erbb4fl/fl con adenovirus Ad5CMV-eGFP o adenovirus Ad5CMV-Cre/eGFP (Figura 4A). Le colture vengono visualizzate con microscopia a fluorescenza per identificare le cellule che esprimono eGFP e mediante microscopia a contrasto di fase per determinare il numero totale di cellule presenti nello stesso camp...

Discussione

I metodi dettagliati qui presentati sono stati sviluppati utilizzando un modello GEM di MPNST. Tuttavia, se il tessuto tumorale di interesse può essere disperso in singole cellule, queste metodologie sono facilmente adattabili a vari tipi di tumore che si presentano nei GEM. È importante assicurarsi che l'allele floxed non si traduca in i) una diminuzione della sopravvivenza che può rendere difficile ottenere topi sufficienti per lo screening dei tumori, o ii) una maggiore latenza tumorale che può rendere difficile o...

Divulgazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353, R01 NS109655), del National Cancer Institute (R01 CA122804), del Dipartimento della Difesa (X81XWH-09-1-0086, W81XWH-11-1-0498, W81XWH-12-1-0164, W81XWH-14-1-0073 e W81XWH-15-1-0193) e della Children's Tumor Foundation (2014-04-001 e 2015-05-007).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Ad5CMV-eGFPGene Transfer Vector Core, Univ of IowaVVC-U of Iowa-4
Ad5CMVCre-eGFPGene Transfer Vector Core, Univ of IowaVVC-U of Iowa-1174
alexa 568 secondary antibodyThermo/FisherGaR A11036
Bioconductor Open Source Software for BioninformaticsBioconductorhttp://www.bioconductor.orgalternative statistical analysis tool used for step 4.4
CD31Abcamab28364
Celigo Image CytometerNexcelom BioscienceN/A
Cell StripperCorning25-056-Clmixture of chelators
DAB staining kitVector LabsMP-7800
DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery)DAVIDhttps://david.ncifcrf.govfunctional enrichment analysis software used for step 4.5
DMEMCorning15-013-Cl
DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR)Thermo/FisherEP0701 and K1072
erbB4 antibodiesSanta Cruzsc-284
erbB4 antibodiesAbcamab35374
erbB4 antibodiesMilliporeHFR1: 05-1133
FACS SorterBD BiosciencesAria II
ForskolinSigmaF6886
GenomeSpace Tools and Data SourcesGenomeSpacehttps://genomespace.org/support/tools/general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5
GlutamineCorning25-005-Cl
Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion toolGorillaN/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.ilfunctional enrichment analysis software used for step 4.5
GSEA Gene Set Enrichment AnalysisBroad InstituteN/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jspfunctional enrichment analysis software used for step 4.5
HSD: Athymic Nude-FOxn1nu miceEnvigo (Previously Harlan Labs)69
Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer)IlluminaHi Seq 2500DNA sequencer used for step 4.2
Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysisDNAStar LaserGene softwareN/Asoftware statistical and normalization analysis used for step 4.4
Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assemblysoftware alignment used for step 4.3N/Asoftware alignment used for step 4.3
Matrigel, low growth factor basement membrane matrixCorning354230
NRG1-betaIn houseGenerated by SLC, also commercially available from R & D Systems(396-HB-050/CF).
Nuclear Stain Hoeschst 33342Thermo62249
Panther Gene Ontology Classification SystemPantherhttp://pantherdb.orgfunctional enrichment analysis software used for step 4.5
Partek (BWA aligner and analyzer)Partek, Ver 7N/Asoftware alignment and statistical/normalization used for step 4.3
Pen/StrepCorning30-002-Cl
Primer 1: 5′-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT
GTCTG- 3′		Eurofins GenomicsPrimer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product;
Primer 2: 5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC
AGAAGC-3′		Eurofins GenomicsPrimer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product;

Primer 3: 5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA
ACCCAG-3′

Eurofins GenomicsPrimer 1 + 3: 350 bp wild-type ErbB4 product.
Propidium IodineFisher51-351-0
Proteom Profiler Phospho-Kinase ArraysR&D SystemsARY003B
Real time gloPromegaG9712bioluminescent cell viability assay
ToppGene SuiteToppGenehttps://toppgene.cchmc.orgfunctional enrichment analysis software used for step 4.5
Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent)Invitrogen15596026
Tyramide Signal Amplification KitPerkin ElmerNEL721001EA

Riferimenti

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