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Method Article
Qui, presentiamo un protocollo per eseguire knockout genici che sono embrionali letali in vivo in tumori derivati da modelli murini geneticamente modificati e quindi valutare l'effetto che il knockout ha sulla crescita, proliferazione, sopravvivenza, migrazione, invasione e trascrittoma in vitro e in vivo.
Lo sviluppo di nuovi farmaci che colpiscono con precisione le proteine chiave nei tumori umani sta alterando fondamentalmente le terapie contro il cancro. Tuttavia, prima che questi farmaci possano essere utilizzati, le loro proteine bersaglio devono essere convalidate come bersagli terapeutici in specifici tipi di cancro. Questa convalida viene spesso eseguita eliminando il gene che codifica per il bersaglio terapeutico candidato in un modello di cancro del topo geneticamente modificato (GEM) e determinando quale effetto questo ha sulla crescita del tumore. Sfortunatamente, questioni tecniche come la letalità embrionale nei knockout convenzionali e il mosaicismo nei knockout condizionali spesso limitano questo approccio. Per superare queste limitazioni, è stato sviluppato un approccio per ablare un gene letale embrionale floxed di interesse in colture a breve termine di tumori maligni della guaina del nervo periferico (MPNNT) generati in un modello GEM.
Questo articolo descrive come stabilire un modello murino con il genotipo appropriato, derivare colture tumorali a breve termine da questi animali e quindi ablare il gene letale embrionale flossato utilizzando un vettore adenovirale che esprime Cre ricombinasi e proteina fluorescente verde potenziata (eGFP). Viene quindi dettagliata la purificazione delle cellule trasdotte con adenovirus utilizzando lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) e la quantificazione degli effetti che l'ablazione genica esercita sulla proliferazione cellulare, la vitalità, il trascrittoma e la crescita dell'allotrapianto ortotopico. Queste metodologie forniscono un approccio efficace e generalizzabile per identificare e convalidare bersagli terapeutici in vitro e in vivo. Questi approcci forniscono anche una fonte rinnovabile di cellule derivate da tumori a basso passaggio con artefatti di crescita in vitro ridotti. Ciò consente di studiare il ruolo biologico del gene bersaglio in diversi processi biologici come la migrazione, l'invasione, le metastasi e la comunicazione intercellulare mediata dal secretoma.
Prima degli ultimi due decenni, il trattamento dei tumori umani si basava fortemente sulla radioterapia e sugli agenti chemioterapici che miravano ampiamente alle popolazioni cellulari in rapida proliferazione danneggiando il DNA o inibendo la sintesi del DNA. Sebbene questi approcci abbiano inibito la crescita delle cellule tumorali, hanno anche avuto effetti collaterali deleteri su normali tipi di cellule in rapida proliferazione come le cellule epiteliali intestinali e le cellule del follicolo pilifero. Più recentemente, la terapia del cancro ha iniziato a utilizzare agenti chemioterapici che colpiscono con precisione le proteine all'interno delle vie di segnalazione che sono di fondamentale importanza per la crescita della neoplasia di un singolo paziente. Questo approccio, comunemente indicato come "Medicina di precisione", ha portato allo sviluppo di un repertorio in continua espansione di anticorpi monoclonali e piccoli inibitori molecolari. Questi agenti inibiscono efficacemente la proliferazione e la sopravvivenza delle cellule tumorali evitando gli effetti collaterali deleteri sui normali tipi di cellule osservati con agenti chemioterapici convenzionali e radioterapia. Gli anticorpi monoclonali utilizzati per il trattamento dei tumori umani più comunemente prendono di mira le molecole di superficie cellulare come i recettori del fattore di crescita1 (ad esempio, la grande famiglia di tirosin-chinasi del recettore di membrana) e i modulatori della risposta immunitaria2 (ad esempio, proteina di morte cellulare programmata 1, ligando di morte programmata 1). Piccoli inibitori molecolari possono inibire le proteine di superficie cellulare o le proteine di segnalazione che si trovano intracellulare3. Tuttavia, per impiegare efficacemente questi nuovi agenti terapeutici, è necessario stabilire che un particolare cancro dipende dalla molecola che viene presa di mira da un agente terapeutico candidato.
Sebbene questi nuovi agenti terapeutici abbiano effetti più mirati, molti di essi inibiscono ancora l'azione di più di una proteina. Inoltre, sono spesso disponibili più agenti con diversa efficacia e specificità per colpire una proteina specifica. Di conseguenza, durante le indagini precliniche, è consigliabile utilizzare approcci aggiuntivi come l'ablazione genetica per convalidare una proteina candidata come bersaglio terapeutico. Un approccio particolarmente utile per convalidare una proteina come bersaglio terapeutico è quello di ablare il gene che codifica la proteina candidata in un modello animale geneticamente modificato che sviluppa lo specifico tipo di cancro di interesse. Questo approccio può essere relativamente semplice se sono disponibili topi con una mutazione nulla (una mutazione naturale, una mutazione nulla geneticamente modificata [un "knockout"] o una mutazione nulla introdotta da una trappola genica) e i topi sono vitali nell'età adulta. Sfortunatamente, i topi con una mutazione nulla che soddisfano questi criteri spesso non sono disponibili, in genere perché la mutazione nulla provoca la morte embrionale o nei primi giorni di vita postnatale. In questa circostanza, i topi inclini a sviluppare il tipo di interesse tumorale possono invece essere incrociati con topi in cui segmenti chiave del gene di interesse sono affiancati da siti loxP ("floxed"), che consente al gene di essere ablato introducendo un transgene che esprime Cre ricombinasi nelle cellule tumorali (un knockout condizionale). Questo approccio offre diversi vantaggi. In primo luogo, se è disponibile un driver Cre che è espresso nel tumore ma non nel tipo di cellula che ha portato alla morte nei knockout convenzionali, questo approccio può potenzialmente convalidare il bersaglio terapeutico candidato. In secondo luogo, l'ablazione del gene che codifica per la proteina candidata nelle cellule tumorali ma non in altri elementi intratumorali come i fibroblasti associati al tumore o le cellule immunitarie consente allo sperimentatore di distinguere tra effetti autonomi delle cellule e non autonomi delle cellule del bersaglio terapeutico. Infine, un driver Cre inducibile da tamoxifene (CreERT2) consente allo sperimentatore di eliminare il gene di interesse in diverse fasi dello sviluppo del tumore e definire la finestra in cui l'agente terapeutico candidato ha maggiori probabilità di essere efficace.
Sfortunatamente, ci sono anche problemi tecnici che possono limitare l'uso di knockout condizionali nei tumori che si verificano nei modelli GEM. Ad esempio, un driver Cre che è espresso nelle cellule tumorali ed evita la delezione genica nelle cellule normali essenziali per la vita potrebbe non essere disponibile. Un altro problema, che può essere sottovalutato, è che i driver Cre e CreERT2 spesso ablano in modo variabile gli alleli floxati nei topi, con conseguente mosaicismo per la mutazione nulla in un cancro GEM. Quando ciò si verifica, le cellule tumorali in cui il gene bersaglio non è stato ablato continueranno a proliferare rapidamente, sovrascredendo le cellule tumorali con alleli ablatati. Il mosaicismo nelle linee driver cre può verificarsi a causa dell'espressione cre non onnipresente nel lignaggio mirato e della ricombinazione fallita in singole cellule indipendenti dall'espressione cre4. Questo è un fenomeno noto dei driver Cre che dipende dal tipo di cellula e dovrebbe essere considerato durante la progettazione sperimentale e l'interpretazione dei dati. Il mosaicismo può mascherare l'effetto del knockout e portare un investigatore a concludere erroneamente che il gene di interesse non è essenziale per la proliferazione e/o la sopravvivenza delle cellule tumorali e quindi non è un valido bersaglio terapeutico.
Molti di questi problemi sono stati riscontrati in uno studio precedente che ha tentato di determinare se il recettore tirosina chinasi erbB4 fosse un potenziale bersaglio terapeutico nelle cellule MPNST5. In questi studi, sono stati utilizzati topi che esprimono un transgene che codifica per il fattore di crescita gliale isoforma neuregulin-1 (NRG1) β3 (GGFβ3) sotto il controllo del promotore zero della proteina mielinica specifica della cellula di Schwann (topi P 0-GGFβ3). I topi P 0-GGFβ3 sviluppano neurofibromi plessiformi multipli che progrediscono fino a diventare MPNST attraverso un processo che ricapitola i processi di patogenesi del neurofibroma e della progressione del neurofibroma-MPNST plessiforme osservati in pazienti con la sindrome da suscettibilità tumorale autosomica dominante neurofibromatosi di tipo 1 (NF1)6. Quando incrociato a topi con una mutazione nulla Trp53, il risultante P 0-GGFβ3; I topi Trp53+/- sviluppano MPNST de novo come si vede in cis-Nf1+/-; Topi Trp53+/-.
Questi MPNNT ricapitolano la progressione dalle lesioni di grado II dell'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) a quelle di grado IV dell'OMS osservate negli esseri umani7. Nei topi P 0-GGFβ3, gli MPNNT insorgono all'interno di neurofibromi plessiformi preesistenti nel nervo trigemino (58%) e nelle radici del nervo dorsale spinale (68%)7; gli MPNST che si verificano in P 0-GGFβ3; I topi Trp53+/- hanno una distribuzione molto simile. Nell'uomo, gli MPNNT si presentano più comunemente nel nervo sciatico seguito dal plesso brachiale, dalle radici nervose spinali, dal vago, dal femore, dalla mediana, dal plesso sacrale, dall'otturatore popliteale e dai nervi tibiali e ulnari posteriori8. Questa distribuzione tumorale in questi modelli GEM è in qualche modo diversa da quella che si vede negli esseri umani. Tuttavia, gli MPNST che si presentano in P 0-GGFβ3 e P0-GGFβ3; I topi Trp53+/- sono istologicamente identici agli MPNNT umani, portano molte delle stesse mutazioni osservate negli MPNNT umani e ricapitolano il processo di progressione del neurofibroma-MPNST osservato nei pazienti NF1. La generazione di P 0-GGFβ3 o P0-GGFβ3; I topi Trp53+/- che erano Erbb4-/- non erano fattibili in quanto i topi con due alleli nulli Erbb4 muoiono in utero al giorno embrionale 10,5 secondari a difetti cardiaci9. Perché il salvataggio dell'espressione di Erbb4 nel cuore introducendo un transgene Erbb4 cardiaco-specifico (catena pesante α-miosina (MHC)-Erbb4) si traduce in topi Erbb4-/- vitali10, la generazione di topi con un complicato P 0-GGFβ3; Trp53+/-;α-MHC-Erbb4; È stato tentato il genotipo Erbb4-/-.
Tuttavia, gli accoppiamenti non hanno prodotto topi nei rapporti mendeliani attesi, indicando che il genotipo desiderato era deleterio. Pertanto, la generazione di P 0-GGFβ3; Trp53+/- topi con alleli Erbb4 floxed 11 e un driver CreERT2 è stato tentato di consentire la delezione di Erbb4 negli MPNNT che si verificano in questi topi. In questi animali erano ancora presenti numerose cellule tumorali con alleli Erbb4 intatti (mosaicismo). Il mosaicismo osservato potrebbe derivare da una somministrazione inefficiente di tamoxifene, che ha comportato differenze nell'efficienza di ricombinazione all'interno del tessuto. La possibilità di meccanismi compensativi spontanei potrebbe contribuire ulteriormente al mosaicismo nella ricombinazione mediata da tamoxifene bypassando il requisito per l'espressione di Erbb4. È possibile che la perdita di Trp53 renda le cellule tumorali suscettibili ad ulteriori mutazioni spontanee "permissive" che potrebbero confondere l'interpretazione dei dati. Poiché sembrava probabile che le cellule MPNST intatte di Erbb4 avrebbero mascherato le conseguenze dell'ablazione di Erbb4 in altre cellule tumorali, questo approccio è stato abbandonato.
Questi ostacoli hanno portato allo sviluppo di una metodologia per l'ablazione di Erbb4 in cellule MPNST a passaggio molto precoce utilizzando un adenovirus che esprime Cre ricombinasi ed eGFP. Queste cellule possono essere separate dalle cellule non infette utilizzando FACS, che riduce notevolmente il mosaicismo per il gene Erbb4 ablato. Di seguito, vengono descritti i metodi utilizzati per raggiungere questo obiettivo, insieme ai metodi utilizzati per valutare gli effetti dell'ablazione genica in vitro e in vivo. Il seguente protocollo è un esempio di come produrre topi portatori di tumore che producono tumori portatori di alleli floxed di geni letali embrionali di interesse per l'escissione ex vivo prima della valutazione della crescita tumorale allotrapianto in vivo . Ciò include una descrizione degli approcci utilizzati per analizzare l'effetto che l'ablazione di Erbb4 esercita sulla proliferazione delle cellule tumorali, sulla sopravvivenza e sull'espressione genica in vitro e sulla proliferazione, la sopravvivenza e l'angiogenesi negli alloinnesti ortotopici.
Prima di eseguire qualsiasi procedura con i topi, tutte le procedure devono essere riviste e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali. Il protocollo descritto in questo manoscritto è stato approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Medical University of South Carolina. Questo protocollo è stato eseguito da personale adeguatamente addestrato seguendo le linee guida istituzionali per la cura degli animali del MUSC.
1. Generazione di topi che sviluppano MPNST omozigoti per alleli flox Erbb4
2. Ablazione ex vivo di alleli Erbb4 floxati in cellule MPNST
3. Saggi di proliferazione e vitalità in cellule MPNST con alleli Erbb4 ablati
4. Analisi RNA-Seq e identificazione di geni la cui espressione è alterata dalla perdita di Erbb4
5. Allotrapianto ortotopico di cellule MPNST con alleli Erbb4 ablati e analisi degli effetti dell'ablazione di Erbb4
La Figura 4 illustra un risultato tipico ottenuto durante la trasduzione di P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Cellule MPNST Erbb4fl/fl con adenovirus Ad5CMV-eGFP o adenovirus Ad5CMV-Cre/eGFP (Figura 4A). Le colture vengono visualizzate con microscopia a fluorescenza per identificare le cellule che esprimono eGFP e mediante microscopia a contrasto di fase per determinare il numero totale di cellule presenti nello stesso camp...
I metodi dettagliati qui presentati sono stati sviluppati utilizzando un modello GEM di MPNST. Tuttavia, se il tessuto tumorale di interesse può essere disperso in singole cellule, queste metodologie sono facilmente adattabili a vari tipi di tumore che si presentano nei GEM. È importante assicurarsi che l'allele floxed non si traduca in i) una diminuzione della sopravvivenza che può rendere difficile ottenere topi sufficienti per lo screening dei tumori, o ii) una maggiore latenza tumorale che può rendere difficile o...
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353, R01 NS109655), del National Cancer Institute (R01 CA122804), del Dipartimento della Difesa (X81XWH-09-1-0086, W81XWH-11-1-0498, W81XWH-12-1-0164, W81XWH-14-1-0073 e W81XWH-15-1-0193) e della Children's Tumor Foundation (2014-04-001 e 2015-05-007).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ad5CMV-eGFP | Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa | VVC-U of Iowa-4 | |
Ad5CMVCre-eGFP | Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa | VVC-U of Iowa-1174 | |
alexa 568 secondary antibody | Thermo/Fisher | GaR A11036 | |
Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics | Bioconductor | http://www.bioconductor.org | alternative statistical analysis tool used for step 4.4 |
CD31 | Abcam | ab28364 | |
Celigo Image Cytometer | Nexcelom Bioscience | N/A | |
Cell Stripper | Corning | 25-056-Cl | mixture of chelators |
DAB staining kit | Vector Labs | MP-7800 | |
DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery) | DAVID | https://david.ncifcrf.gov | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
DMEM | Corning | 15-013-Cl | |
DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR) | Thermo/Fisher | EP0701 and K1072 | |
erbB4 antibodies | Santa Cruz | sc-284 | |
erbB4 antibodies | Abcam | ab35374 | |
erbB4 antibodies | Millipore | HFR1: 05-1133 | |
FACS Sorter | BD Biosciences | Aria II | |
Forskolin | Sigma | F6886 | |
GenomeSpace Tools and Data Sources | GenomeSpace | https://genomespace.org/support/tools/ | general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5 |
Glutamine | Corning | 25-005-Cl | |
Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool | Gorilla | N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
GSEA Gene Set Enrichment Analysis | Broad Institute | N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice | Envigo (Previously Harlan Labs) | 69 | |
Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer) | Illumina | Hi Seq 2500 | DNA sequencer used for step 4.2 |
Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis | DNAStar LaserGene software | N/A | software statistical and normalization analysis used for step 4.4 |
Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly | software alignment used for step 4.3 | N/A | software alignment used for step 4.3 |
Matrigel, low growth factor basement membrane matrix | Corning | 354230 | |
NRG1-beta | In house | Generated by SLC, also commercially available from R & D Systems(396-HB-050/CF). | |
Nuclear Stain Hoeschst 33342 | Thermo | 62249 | |
Panther Gene Ontology Classification System | Panther | http://pantherdb.org | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
Partek (BWA aligner and analyzer) | Partek, Ver 7 | N/A | software alignment and statistical/normalization used for step 4.3 |
Pen/Strep | Corning | 30-002-Cl | |
Primer 1: 5′-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT GTCTG- 3′ | Eurofins Genomics | Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product; | |
Primer 2: 5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC AGAAGC-3′ | Eurofins Genomics | Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product; | |
Primer 3: 5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA | Eurofins Genomics | Primer 1 + 3: 350 bp wild-type ErbB4 product. | |
Propidium Iodine | Fisher | 51-351-0 | |
Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays | R&D Systems | ARY003B | |
Real time glo | Promega | G9712 | bioluminescent cell viability assay |
ToppGene Suite | ToppGene | https://toppgene.cchmc.org | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent) | Invitrogen | 15596026 | |
Tyramide Signal Amplification Kit | Perkin Elmer | NEL721001EA |
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