Definindo funções genéticas em Tumorigênese por Ex vivo Ablaation of Floxed Alleles in Maligna Periférico Nerve Hemato Tumor Cells

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para a realização de nocautes genéticos que são embrionários letais in vivo em tumores derivados de camundongos geneticamente modificados e, em seguida, avaliando o efeito que o nocaute tem sobre o crescimento do tumor, proliferação, sobrevivência, migração, invasão e a transcrição in vitro e in vivo.

Resumo

O desenvolvimento de novas drogas que visam precisamente proteínas-chave em cânceres humanos está alterando fundamentalmente a terapêutica do câncer. No entanto, antes que essas drogas possam ser usadas, suas proteínas-alvo devem ser validadas como alvos terapêuticos em tipos específicos de câncer. Essa validação é frequentemente realizada derrubando o gene que codifica o alvo terapêutico candidato em um modelo de câncer de camundongo geneticamente modificado (GEM) e determinando que efeito isso tem no crescimento do tumor. Infelizmente, questões técnicas como a letalidade embrionária em nocautes convencionais e o mosaico em nocautes condicionalmente muitas vezes limitam essa abordagem. Para superar essas limitações, desenvolveu-se uma abordagem para ablação de um gene letal embrionário floxed de interesse em culturas de curto prazo de tumores malignos de bainha periférica (MPNSTs) gerados em um modelo GEM.

Este artigo descreve como estabelecer um modelo de camundongo com o genótipo apropriado, derivar culturas tumorais de curto prazo desses animais e, em seguida, ablate o gene letal embrionário floxed usando um vetor adenoviral que expressa Cre recombinase e proteína fluorescente verde aprimorada (eGFP). Purificação de células transduzidas com adenovírus usando classificação celular ativada por fluorescência (FACS) e a quantificação dos efeitos que a ablação genética exerce sobre a proliferação celular, viabilidade, o crescimento de andoenxertos transcritos e ortotópicos é então detalhado. Essas metodologias fornecem uma abordagem eficaz e generalizável para identificar e validar alvos terapêuticos in vitro e in vivo. Essas abordagens também fornecem uma fonte renovável de células derivadas de tumores de baixa passagem com artefatos de crescimento in vitro reduzidos. Isso permite que o papel biológico do gene-alvo seja estudado em diversos processos biológicos, como migração, invasão, metástase e comunicação intercelular mediada pelo secretome.

Introdução

Antes das últimas duas décadas, o tratamento dos cânceres humanos dependia fortemente de radioterapia e agentes quimioterápicos que visavam rapidamente proliferar populações celulares, danificando o DNA ou inibindo a síntese de DNA. Embora essas abordagens tenham inibido o crescimento de células cancerosas, elas também tiveram efeitos colaterais deletérios em tipos celulares normais que proliferam rapidamente, como células epiteliais intestinais e células folículos capilares. Mais recentemente, a terapia oncológica começou a utilizar agentes quimioterápicos que visam precisamente proteínas dentro de vias de sinalização que são criticamente importantes para o crescimento da neoplasia de um paciente individual. Essa abordagem, comumente referida como "Medicina de Precisão", levou ao desenvolvimento de um repertório cada vez maior de anticorpos monoclonais e pequenos inibidores moleculares. Esses agentes efetivamente inibem a proliferação e a sobrevivência das células tumorais, evitando os efeitos colaterais deletérios em tipos celulares normais vistos com agentes quimioterápicos convencionais e radioterapia. Anticorpos monoclonais usados para o tratamento de cânceres humanos mais comumente visam moléculas de superfície celular, como receptores de fator de crescimento¹ (por exemplo, a grande família de quinases receptoras de membrana) e moduladores de resposta imune² (por exemplo, proteína de morte celular programada 1, liga-morte programada 1). Pequenos inibidores moleculares podem inibir proteínas da superfície celular ou proteínas de sinalização que estão localizadas intracelularmente³. No entanto, para efetivamente empregar esses novos agentes terapêuticos, deve-se estabelecer que um determinado câncer depende da molécula que está sendo alvo de um agente terapêutico candidato.

Embora esses novos agentes terapêuticos tenham efeitos mais focalizadas, muitos deles ainda inibem a ação de mais de uma proteína. Além disso, vários agentes com eficácia e especificidade variadas estão frequentemente disponíveis para atingir uma proteína específica. Consequentemente, durante investigações pré-clínicas, é prudente usar abordagens adicionais, como a ablação genética para validar uma proteína candidata como alvo terapêutico. Uma abordagem especialmente útil para validar uma proteína como alvo terapêutico é ablate o gene codificando a proteína candidata em um modelo animal geneticamente modificado que desenvolve o tipo específico de câncer de interesse. Essa abordagem pode ser relativamente simples se ratos com uma mutação nula (ou uma mutação natural, uma mutação nula geneticamente modificada [um "nocaute"], ou uma mutação nula introduzida por uma armadilha genética) estiverem disponíveis, e os camundongos forem viáveis até a idade adulta. Infelizmente, camundongos com uma mutação nula que atendem a esses critérios muitas vezes não estão disponíveis, tipicamente porque a mutação nula resulta em morte embrionária ou nos primeiros dias de vida pós-natal. Nesta circunstância, camundongos propensos a desenvolver o tipo de interesse tumoral podem, em vez disso, ser cruzados para camundongos nos quais segmentos-chave do gene de interesse são flanqueados por locais loxP ("floxed"), o que permite que o gene seja ablado introduzindo um transgene expressando Cre recombinase nas células tumorais (um nocaute condicional). Essa abordagem oferece várias vantagens. Primeiro, se um driver Cre estiver disponível que seja expresso no tumor, mas não no tipo celular que levou à morte em nocautes convencionais, essa abordagem pode potencialmente validar o alvo terapêutico do candidato. Em segundo lugar, a ablação do gene que codifica a proteína candidata em células tumorais, mas não em outros elementos intratumorais, como fibroblastos ou células imunes associadas ao tumor, permite ao pesquisador distinguir entre efeitos célula-autônomos e não-células-autônomas do alvo terapêutico. Finalmente, um driver Cre indutível de tamoxifen (CreER^T2) permite que o investigador exclua o gene de interesse em diferentes estágios no desenvolvimento do tumor e defina a janela em que o agente terapêutico candidato é mais provável que seja eficaz.

Infelizmente, há também questões técnicas que podem limitar o uso de nocautes condicionais em tumores surgidos em modelos GEM. Por exemplo, um driver Cre que é expresso em células tumorais e evita a exclusão genética em células normais essenciais para a vida pode não estar disponível. Outra questão, que pode ser subestimada, é que os drivers Cre e CreER^T2 muitas vezes variavelmente ablatam alelos floxed em camundongos, resultando em mosaico para a mutação nula em um câncer GEM. Quando isso ocorrer, as células tumorais nas quais o gene alvo não foi ablado continuarão a proliferar rapidamente, superculcendo as células tumorais com alelos ablados. O mosaicismo nas linhas de driver cre pode ocorrer devido à expressão cre não onipresente na linhagem direcionada e pela recombinação fracassada em células individuais independentes da expressão Cre⁴. Este é um fenômeno conhecido dos drivers Cre que é dependente do tipo celular e deve ser considerado durante o desenho experimental e interpretação de dados. O mosaico pode mascarar o efeito do nocaute e levar um investigador a concluir erroneamente que o gene de interesse não é essencial para a proliferação e/ou sobrevivência das células tumorais e, portanto, não é um alvo terapêutico válido.

Vários desses problemas foram encontrados em um estudo anterior que tentou determinar se o receptor tyrosine quinase erbB4 era um alvo terapêutico potencial nas células MPNST⁵. Nesses estudos, foram utilizados camundongos que expressam um transgene codificando o fator de crescimento gliano isoforme-β3 (GGFβ3) sob o controle do promotor zero de proteína de mielina específico da célula Schwann (camundongos P 0-GGFβ3). Os camundongos P 0-GGFβ3 desenvolvem neurofibromas plexiformes múltiplos que avançam para se tornarem MPNSTs através de um processo que recapitula os processos de patogênese neurofibroma e progressão neurofibroma-MPNST plexiforme observada em pacientes com a síndrome de susceptibilidade do tumor autossômico dominante neurofibromatose tipo 1 (NF1)⁶. Quando atravessado para camundongos com uma mutação nula Trp53, o P 0-GGFβ3 resultante; Os camundongos Trp53^+/- desenvolvem MPNSTs de novo como é visto no cis-Nf1^+/-; Trp53^+/- ratos.

Esses MPNSTs recapitulam a progressão das lesões grau II da Organização Mundial da Saúde (OMS) para a OMS, observadas em humanos⁷. Em_camundongos P 0-GGFβ3, os MPNSTs surgem dentro de neurofibromas plexiformes pré-existentes no nervo trigêmeo (58%) e raízes do nervo dorsal espinhal (68%)⁷; os MPNSTs surgidos em P 0-GGFβ3; Os ratos Trp53^+/- têm uma distribuição altamente semelhante. Em humanos, os MPNSTs mais comumente surgem no nervo ciático seguido pelo plexo braquial, raízes nervosas espinhais, vagus, femoral, mediana, plexo sacral, obturador popliteal e nervos tibiais e ulnar posteriores⁸. Esta distribuição de tumores nesses modelos GEM é um pouco diferente do que é visto em humanos. No entanto, os MPNSTs que surgem em P 0-GGFβ3 e P_0-GGFβ3; Os camundongos trp53^+/- são histologicamente idênticos aos MPNSTs humanos, carregam muitas das mesmas mutações vistas nos MPNSTs humanos e recapitulam o processo de progressão neurofibroma-MPNST observado em pacientes NF1. A geração de P 0-GGFβ3 ou P_0-GGFβ3; Trp53^+/- camundongos que eram Erbb4^-/- não eram viáveis, pois camundongos com dois alelos nulos Erbb4 morrem no útero no dia embrionário 10,5 secundários a defeitos cardíacos⁹. Porque resgatar a expressão Erbb4 no coração introduzindo um transgene Erbb4 específico para o coração (cadeia pesada de α-miosina (MHC)-Erbb4) resulta em erbb4^-/- camundongos¹⁰ viáveis, a geração de ratos com um complicado P 0-GGFβ3; Trp53^+/-;α-MHC-Erbb4; Erbb4^-/- genótipo foi tentado.

No entanto, os acasalamentos não produziram camundongos nas razões mendelianas esperadas, indicando que o genótipo desejado era deletério. Portanto, a geração de P 0-GGFβ3; Trp53^+/- ratos com alelos Erbb4 floxed¹¹ e um driver CreER^T2 foi tentado para permitir a exclusão de Erbb4 nos MPNSTs surgidos nestes ratos. Nesses animais, numerosas células tumorais com alelos Erbb4 intactos ainda estavam presentes (mosaico). O mosaico observado pode resultar da entrega ineficiente de tamoxifen, que resultou em diferenças na eficiência de recombinação dentro do tecido. A possibilidade de mecanismos compensatórios espontâneos poderia contribuir ainda mais para o mosaico na recombinação mediada pelo tamoxifen, ignorando a exigência de expressão de Erbb4. É viável que a perda de Trp53 torne as células tumorais suscetíveis a mutações espontâneas adicionais "permissivas" que possam confundir a interpretação dos dados. Como parecia provável que as células MPNST intactas Erbb4 mascarassem as consequências de ablar Erbb4 em outras células tumorais, essa abordagem foi abandonada.

Esses obstáculos levaram ao desenvolvimento de uma metodologia para ablação de células MPNST de passagem muito precoce usando um adenovírus expressando Cre recombinase e eGFP. Essas células podem ser separadas de células não infectadas usando FACS, o que reduz significativamente o mosaico para o gene Erbb4 ablado. Abaixo, são descritos os métodos utilizados para isso, juntamente com os métodos utilizados para avaliar os efeitos da ablação genética in vitro e in vivo. O protocolo a seguir é um exemplo de como produzir camundongos portadores de tumores que produzem tumores portadores de alelos floxados de genes letais embrionários de interesse para ex vivo excisão antes da avaliação de crescimento do tumor in vivo a allograft. Isso inclui uma descrição das abordagens usadas para analisar o efeito que a ablação de Erbb4 exerce sobre a proliferação de células tumorais, sobrevivência e expressão genética in vitro e proliferação, sobrevivência e angiogênese em alóxeris ortotópicos.

Protocolo

Antes de realizar qualquer procedimento com camundongos, todos os procedimentos devem ser revistos e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais. O protocolo descrito neste manuscrito foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica da Carolina do Sul. Este protocolo foi realizado por pessoal devidamente treinado seguindo as diretrizes institucionais de cuidados com animais do MUSC.

1. Geração de camundongos que desenvolvem MPNSTs homozigos para alelos erbb4 ^flox

1. Produzir a geração F1 de P 0-GGFβ3; Trp53^+/-; Erbb4^fl/+ animais acasalando P 0-GGFβ3; Trp53^+/- ratos⁷ com ratos Erbb4^{fl/fl 11}. Use um quadrado punnett (Figura 1) para orientar o esquema de reprodução para garantir que filhotes de F1 machos e fêmeas suficientes sejam gerados com o P 0-GGFβ3 desejado; Trp53^+/-; Genótipo Erbb4^fl/+.
2. Genótipo F1 prole isolando DNA genômico de um corte de cauda coletado de acordo com as diretrizes da IACUC e, em seguida, executar PCR usando primers descritos anteriormente para detectar o P 0-GGFβ3 transgene¹², Trp53 tipo selvagem (+) e alelos nus (-)^{alelos 7}, e Erbb4^flox e Erbb4 alelos tipo selvagem¹³.
   1. Isole o DNA da cauda usando métodos detalhados em jacks-lab.mit.edu/protocols.
   2. Faça a mistura de reação pcr com DNA de 25 ng, 0,25 nM dNTPs, 0,02 U/μL Taq, 0,5 μM de cada primer e 1x tampão PCR. Realize a reação pcr com uma única incubação de 95 °C (para derreter o DNA genômico e ativar o Taq) por 1 min seguido por 35 ciclos pcr de 94 °C, 10 s (derretimento); 55 °C, 30 s (ressar; 72 °C, 40 s (extensão) seguido de um único 72 °C (extensão) por 5 min. Armazene as reações a 4 °C até estar pronto para funcionar em um gel de 1,2-1,5%.
      NOTA: A temperatura de ressarcimento depende do sistema tampão PCR utilizado; a realização de um gradiente de temperatura de retalagem para determinar a temperatura adequada de ressarcimento é recomendada.
3. Produzir a geração F2 de P 0-GGFβ3; Trp53^+/-; Erbb4^fl/fl animais acasalando a prole F1 apropriada (P 0-GGFβ3; Trp53^-/+; Erbb4^fl/+) um com o outro.
   NOTA: A Figura 1 ilustra as previsões quadradas de Punnet usadas para calcular o número esperado de descendentes de F2 com o genótipo desejado.
4. Identificar animais com o P 0-GGFβ3 desejado; Trp53^-/+; Genótipo erbb4^fl/fl como descrito na etapa 1.2.
5. Mate F2 progênere um para o outro para manter o P 0-GGFβ3; Trp53^-/+; Erbb4^fl/fl colônia e genótipo todos os filhotes. Confirme que o alelo floxed recém-introduzido não compromete a sobrevivência ou latência tumoral. Conseguir isso estabelecendo coortes (20 ratos/coorte) de P 0-GGFβ3; Trp53^+/- e P 0-GGFβ3; Trp53^+/-; Erbb4^fl/fl camundongos e seguem sua sobrevivência e frequência de ocorrência de tumor.
6. Monitore os animais várias vezes por semana até que o ponto final experimental seja atingido (tamanho máximo permitido do tumor/ponto final humano aprovado pela IACUC).
   1. Durante o monitoramento semanal, avalie o peso corporal, o comportamento social e de preparo normal e as medidas do tamanho do tumor. Providencie a avaliação veterinária em caso de perda de peso de >10% do peso corporal, reclusão social e corcunda.
   2. Quando um camundongo portador de tumor é identificado e atingiu seu ponto final humano, eutanize humanamente o animal usando inalação de dióxido de carbono seguido de luxação cervical e remova estérilmente o tumor usando uma faca de bisturi. Faça as medidas do tumor medindo o comprimento, largura e profundidade usando um tumor de pinça e peso (massa e volume). Trabalhe rapidamente para evitar a autolise.
7. Sele o tumor em três seções usando cortes no estilo breadloaf com uma faca de bisturi em condições estéreis para gerar segmentos de tecido para fixação de formalina/incorporação de parafina (FFPE), geração de cultura de passagem precoce e material congelado em flash (Figura 2A).
   1. Certifique-se de que a Seção 1 (para geração de cultura de passagem precoce, etapa 1.7.2) é aproximadamente 10% do volume total do tumor, a Seção 2 (para fixação e IHC, etapa 1,7.3) é de 70% do volume total do tumor, e a Seção 3 (para congelamento de flash, etapa 1,7,4) é de 20% do volume total do tumor.
   2. Pegue a seção 1 do tumor para a preparação de culturas de passagem precoce (veja abaixo).
   3. Corrija a seção 2 do tumor em 4% de paraformaldeído durante a noite a 4 °C e, em seguida, incorpore em parafina (formalina-fixa-fixa-embedded (FFPE) para o trabalho diagnóstico.
   4. Seção de congelamento flash 3 para análises analíticas (por exemplo, imunoblots para verificar se a proteína codificada pelo gene floxed alvo é adequadamente expressa).
8. Manchas 5 μm-thick FFPE seções de tecido com hematoxilina e eosina (H&E) para confirmar o diagnóstico do tumor por um patologista qualificado. Se for o caso, realize a coloração imunohistoquímica (IHC) para confirmar o diagnóstico do tumor.
   1. Imunostain MPNSTs para proteína de ligação de cálcio S100 B (S100β), nestin e região determinante sexual Y (SRY)-Fator de transcrição da caixa 10 (Sox10)-três marcadores que são expressos em células MPNSTs e Schwann (origem celular tumoral)5,6,14,15. Manche os tumores com anticorpos reconhecendo o erbB4, a proteína codificada pelo gene alvo da ablação em degraus a jusante.
   2. Para confirmar o diagnóstico, um patologista veterinário ou humano qualificado avalie todos os slides tumorais manchados seguindo os critérios de diagnóstico e classificação da OMS 5,6,7,16.

2. Ablação ex vivo de alelos Erbb4 floxed em células MPNST

1. Estabeleça culturas de passagem precoce a partir de tecido MPNST recém-coletado, colocando o tecido da seção 1 (etapa 1.7.3) em 10 mL de soro fisiológico estéril estéril (PBS) no gelo e, em seguida, transferindo-o para uma área de trabalho estéril (Figura 2B)¹⁶.
   NOTA: Todos os procedimentos subsequentes devem ser realizados em uma capa de cultura tecidual estéril.
2. Pique o tecido tumoral em pedaços de 2-4 mm e triturar 8-10 vezes em um prato de cultura de tecido tratado de 10 cm² com 10 mL de meio de crescimento. Cultura essas preparações em médio de crescimento DMEM-10 de alta glicose (o meio de crescimento da Águia modificada de Dulbecco (DMEM) contendo 10% de soro fetal do bezerro, 1% de glutamina, 10 μg/mL estreptomicina e 10 UI/mL penicilina) suplementada com 10 nM neuregulina-1β (NRG1β) e 2 μM forskolin. Adicione forskolina nesta fase para inibir o crescimento de tipos de células contaminantes comuns, como os fibroblastos.
3. Mantenha o tecido e as células mecanicamente dissociados por até 3 dias a 37 °C em uma atmosfera de CO₂ de 5% para estabelecer uma cultura de passagem precoce. Não separe células dispersas e fragmentos de tecido restantes neste momento.
4. Refrescar as culturas com novo meio a cada 3-4 dias. Permita que as células tumorais se proliferem até que sejam confluentes.
5. Expanda as culturas de passagem precoce dividindo as culturas confluentes em vários pratos. Remova o meio de crescimento e lave as células com 1x dPBS. Em seguida, adicione 1 mL de 0,25% de trippsina para 2-5 min à temperatura ambiente por 10 cm² prato de cultura celular tratada. Triturar suavemente a cultura para facilitar o desprendimento e gerar uma suspensão unicelular.
   1. Termine a trypsinização adicionando 2 mL de meio de crescimento DMEM-10. Colete a mistura celular experimentpsinizada e transfira-a para um tubo de centrífuga estéril de 5 mL. Pelota as células por centrifugação por 5 min a 500 × g à temperatura ambiente.
   2. Resuspende a pelota de célula em 5 mL de DMEM-10. Divida as células em pratos de cultura celular de 2 a 4 cm, cada um contendo 10 mL de mídia de crescimento (aproximadamente 1 × 10⁶ células por prato).
6. Após 5 passagens (repetindo passos em 2,5), use meio de crescimento sem NRG1β e forskolin. Imunostain uma amostra da cultura com um anticorpo anti-S100β para verificar se a cultura é composta unicamente de células tumorais. Manter as células no meio de crescimento DMEM-10 em todas as passagens subsequentes.
7. Na próxima passagem, conte as células e congele uma porção de P 0-GGFβ3; Trp53^+/-; Células MPNST erbb4^fl/fl coletadas de culturas confluentes (3 × 10⁶ células/frasco).
8. Placa P 0-GGFβ3; Trp53^+/-; Erbb4^fl/fl passagem precoce células MPNST a uma densidade de 1,5 × 10⁶ células por prato de cultura celular tratada de 10 cm em meio de crescimento DMEM-10.
9.  Dia 0: (Aproximadamente 12-16 h após o emplacamento), lave as culturas aderentes com 2-4 mL de dPBS e infecte com Ad5CMV-Cre/eGFP ou Ad5CMV-eGFP em aproximadamente 400 unidades formadoras de placas (pfu)/célula em 10 mL de DMEM sem soro (i.e., 30 μL de 2 × 10¹⁰ pfu de vírus por prato de 10 cm). Ablato os alelos Erbb4 floxed usando o adenovírus na concentração máxima tolerada do vírus (multiplicidade de infecção, MOI), conforme determinado empiricamente. Consulte a Figura 2C para obter um esquema do fluxo de trabalho para esta ablação.
10. Dia 1º: Aproximadamente 16 horas depois, resgate as culturas adicionando 10 mL de DMEM-10 ao coquetel de infecção.
11. Dia 2 - 3: FACS classifica células infectadas seguindo o protocolo recomendado da instalação central para classificar células positivas do eGFP aproximadamente 48 h após a infecção. Antes da classificação FACS, verifique brevemente as células quanto ao sinal eGFP em um microscópio de fluorescência para garantir que as culturas tenham sido infectadas eficientemente (~50-100% células positivas). Células de retorno recuperadas após o FACS a 10 cm pratos de cultura tecidual; reservar um prato para isolamento genômico de DNA.
12. Dia 4 - 5: Após a triagem facs, deixe as células se recuperarem em uma incubadora de cultura tecidual por pelo menos 24-48 h e, em seguida, preparar as células para análises in vitro baseadas em células ou enxerto in vivo . Confirme a exclusão de Erbb4 via PCR usando DNA genômico isolado de uma porção das células eGFP-positivas classificadas. Verifique se as células positivas do eGFP são ErbB4-negativas por PCR ou por imunosterar uma amostra da cultura com um anticorpo anti-erbB4.
    1. Isole o DNA genômico das células usando o método padrão de isolamento de DNA ácido-guanidinium-phenol e clorofórmio¹⁷.
    2. Execute o PCR padrão para distinguir alelos Erbb4 floxed e alelos erbb4 ablados. Realize 40 ciclos com DNA de 2 ng, primers de 20 μM 1 + 2 para produzir um produto erbb4-null de 250 bp e um produto floxed de 350 bp¹³. Execute tanto as abordagens baseadas em PCR quanto de anticorpos para confirmar o nocaute quando não houver anticorpos confiáveis disponíveis.
       NOTA: As células estão prontas para ensaios in vitro baseados em células, conforme descrito abaixo. Muitos tipos de análises a jusante podem ser realizadas com células preparadas dessa forma. O objetivo dos protocolos apresentados abaixo é fornecer alguns exemplos de aplicações in vitro e in vivo dessas células tumorais após ablação do gene Erbb4 .

3. Ensaios de proliferação e viabilidade em células MPNST com alelos Erbb4 ablados

1. Realize ensaios de proliferação durante os próximos sete dias em células MPNST classificadas banhadas em uma placa multiwell usando um citômetro automatizado baseado em imagem.
   1. Dia 6: Placa 2.000 células por poço em um volume final de 150 μL (~13.300 células/mL) de meio de crescimento em uma placa de 96 poços. Realizar medições em triplicado para cada coorte experimental e 4 leituras diárias de endpoint (3 réplicas x 2 condições x 4 dias).
   2. Dias 7, 9, 11, 13: Colorir células com corantes de iodeto hoechst e propidium (PI) e imagem-as em um leitor de placas automatizada para contar o número de células vivas e mortas em cada poço. Para isso, colorir simultaneamente as células com corante Hoechst para manchar os núcleos de células vivas e mortas e com iodeto de propídio (PI) para rotular as células mortas. Faça todas as leituras ao mesmo tempo todos os dias ou todos os dias.
      1. Adicione 50 μL de uma solução de coloração 4x PI/Hoechst (4 μg/mL cada) a cada poço quantificado naquele dia (por exemplo, apenas no dia 7), e incubar por 30 min a 37 °C na incubadora de cultura tecidual. Mantenha a placa protegida da luz.
         NOTA: A concentração de coloração de Hoechst precisa ser empiricamente determinada e pode variar de 1 a 10 μg/mL, dependendo do tipo celular.
      2. Leia os poços manchados após a incubação usando o canal fluorescente apropriado no imager celular automatizado. Após a leitura, devolva a placa à incubadora para leituras futuras nos dias subsequentes (ou seja, dias 9, 11, 13).
      3. Quantifique as intensidades de coloração com base no sistema de imagem utilizado e calcule o número de células mortas, células vivas e células totais usando as seguintes configurações: canal azul (377/50 nm, Hoechst): células totais (vivas e mortas); canal vermelho (531/40 nm, PI): somente células mortas; azul - vermelho (total - morto) = células vivas.
2. Realize o ensaio de viabilidade celular ao longo de três dias, se desejar, seguindo o protocolo dos fabricantes de ensaios.
   NOTA: Os ensaios de viabilidade podem ser combinados com ensaios de proliferação realizando uma mancha tripla, incluindo calcein AM (488/32 nm; canal verde, especificamente rótulos de células vivas), PI e Hoechst. Um ensaio de apoptose também pode ser realizado utilizando culturas configuradas como descrito acima; o protocolo específico dependerá do sistema de imagem.
   1. Dia 6: Placa 4.000 células por poço em um volume final de 150 μL em uma placa de 96 poços em triplicado.
   2. Dias 7 - 9: Adicione 2.000x de reagentes de ensaio de viabilidade bioluminescente celular (Tabela de Materiais), devolva a placa à incubadora e leia a placa 1h depois. Faça leituras subsequentes ao mesmo tempo todos os dias. Para os ensaios de bioluminescência (MTT), realize o ensaio exatamente conforme descrito nas instruções do fabricante a cada 24 h por 72 h usando um leitor de placas de luminômetro.

4. Análises do RNA-Seq e identificação de genes cuja expressão é alterada pela perda de Erbb4

1. Dia 6: Isole o RNA total das células MPNST classificadas usando métodos padrão ácido-guanidinium-phenol e clorofórmio. Para experimentos projetados para detectar alterações nos níveis de mRNA entre duas coortes, prepare o RNA total de pelo menos três réplicas biológicas em cada coorte.
   1. Para eliminar eventos causados pelo vetor adenoviral ou expressão eGFP em vez da perda de Erbb4, isole o RNA de três réplicas biológicas de P 0-GGFβ3; Trp53^+/-; Células MPNST erbb4^fl/fl transduzidas com Ad5CMV-Cre/eGFP e três réplicas biológicas transduzidas com Ad5CMV-eGFP.
      NOTA: O RNA isolado deve ter uma pontuação de número de integridade de RNA (RIN) ≥ 8 para análise de RNA-Seq. Certifique-se de que o núcleo de sequenciamento determina o RIN de todas as amostras antes da construção de bibliotecas.
2. Use 100-200 ng de RNA total de alta qualidade de cada amostra para preparar bibliotecas RNA-Seq (trabalhe com a instalação de sequenciamento principal para esta etapa). Realize sequenciamento de alta throughput usando um sequenciador de DNA de próxima geração. Para quantificação de mRNA, execute sequenciamento de um único fim para gerar arquivos Fastq. Assegure um mínimo de 50 milhões de leituras para cada amostra.
   NOTA: Consulte a Figura 3 para um esquema que ilustra o fluxo de trabalho utilizado para processar dados RNA-Seq e quantificar a expressão de transcrições expressas diferencialmente. Os dados de sequência, na forma de arquivos Fastq, são submetidos a procedimentos de controle de qualidade; >80% das leituras devem produzir uma pontuação de 30 para ser considerada adequada para análise subsequente. As sequências também são pré-processadas (aparadas) usando Trimmomatic¹⁸ para remover sequências de adaptador e filtrar leituras de baixa qualidade.
3. Realize o alinhamento e análise do RNA-Seq nos arquivos gerados pelo fastq usando qualquer programa de software capaz (por exemplo, DNAStar^19,20 ou Partek²¹). Siga as etapas específicas do programa usando as configurações padrão para alinhar os arquivos fastq ao genoma de referência do mouse (GRCm38/mm10).
   NOTA: Usando o DNAStar como exemplo, o fluxo de trabalho geral é descrito abaixo (Figura Suplementar 1).
   1. Selecione o método de análise, RNA-Seq.
   2. Selecione o genoma de referência, Mouse.
   3. Carregue o arquivo BED se fornecido um pelo núcleo de sequenciamento.
   4. Carregue os arquivos de sequenciamento fastq, atribuindo-os nomes de réplica exclusivos.
   5. Replique em grupo os arquivos fastq e designe-os para um conjunto de réplica (ou seja, GFP, CRE)
      NOTA: Cada programa de alinhamento tem suas etapas específicas, e o usuário deve consultar o guia do usuário do programa para o protocolo específico do programa. Em seguida, o programa gerará dados de contagem bruta específicos de genes a partir desses arquivos Fastq.
4. Realize a análise estatística e de normalização (DESeq2, EdgeR) sobre os dados de contagem bruta utilizando quaisquer programas de software capazes, conforme descrito em 4.3, com o conjunto de amostras Ad5CMV-eGFP como conjunto de dados de controle e conjunto Ad5CMV-Cre como o conjunto de dados de teste para identificar sinais de expressão genética diferencial com poder estatístico robusto^22,23.
   1. Selecione arquivos de fastq GFP como o conjunto de dados de controle.
   2. Selecione o DESeq2 como o método estatístico e de normalização .
   3. Comece a montagem e análise.
      NOTA: Cada programa de alinhamento tem suas etapas específicas, e o usuário deve consultar o guia do usuário do programa para o protocolo específico do programa. Em seguida, o programa gerará dados de contagem bruta específicos de genes a partir desses arquivos Fastq. A análise estatística e normalização é um passo embutido em muitos programas, como mostrado no exemplo aqui, dentro do protocolo de alinhamento de sequência. Se for utilizado um programa de software de alinhamento de sequência alternativa que não ofereça esta etapa incorporada subsequente, execute a análise estatística e normalização nos dados de contagem bruta no nível do terminal usando os pacotes de codificação DESeq2 ou EdgeR escritos em R, disponíveis gratuitamente para download em Bioconductor.org.
5. Use essas abordagens para identificar alterações que representem pelo menos um aumento ou diminuição de 1,5 vezes em relação ao controle (neste caso, as células transduzidas com o vírus Ad5CMV-eGFP). Utilize apenas aqueles genes expressos diferencialmente (DEGs) determinados a serem estatisticamente significativos que mostram ≥ 1,5 vezes as alterações e um valor p 0,05 ou um padj de 0,1 para análise de enriquecimento funcional subsequente.
   NOTA: Isso gerará uma lista de genes DEG e seu poder estatístico para análise de enriquecimento funcional.
6. Realize análises de enriquecimento funcional em DEG mediada por Erbb4 estatisticamente significante identificada em 4.4 com um arquivo de lista genética ranqueada usando qualquer uma das ferramentas baseadas na Web disponíveis livremente. Determine a significância biológica e de caminho da perda genética de Erbb4 através de conjuntos de dados de ontologia genética integrados nessas ferramentas de análise de enriquecimento funcional de acesso aberto 24,25,26,27 (ver a Tabela de Materiais, por exemplo, e a Figura 3, por exemplo, o fluxo de trabalho usando o Pantera).
   1. Exportar os dados obtidos na etapa 4.4 como planilha.
   2. Classifique os dados por alteração de dobra log2, valor p/padj ou ambos.
   3. Certifique-se de remover todos os dados não estatisticamente significativos.
   4. Exporte a lista de genes classificados com ID de genes apenas como um arquivo .txt e faça upload para o site.
      NOTA: Utilize apenas DEG estatisticamente significativo (valores p/padj < 0,05 ou 0,1, respectivamente) para gerar uma lista de genes de entrada ranqueada usando alterações de dobra log2 (mais altas para menores), p/padj-valores (de menor para maior) ou ambos [(-log10(pval)*sign(log2FC)]. Existem várias abordagens para gerar uma lista genética ranqueada e é empiricamente determinada para o conjunto de dados e a pergunta que está sendo feita. O tipo específico de ferramenta de análise de enriquecimento funcional que está sendo usada também pode auxiliar na determinação do tipo apropriado de lista genética de classificação. Para obter recursos adicionais no RNA-Seq, consulte os seguintes trabalhos 28,29,30.

5. Ação ortotópica de células MPNST com alelos erbb4 ablados e análise dos efeitos da ablação de Erbb4

1. Antes de realizar o aentorgrafo ortotópico de células MPNST classificadas, certifique-se de que todos os procedimentos sejam revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais, e que todos os procedimentos sejam realizados por pessoal devidamente treinado.
2. No dia da injeção, remova as células de baixa passagem (aproximadamente 85% de confluência) de placas de cultura celular ou frascos usando uma solução de dissociação celular não enzimática (por exemplo, uma mistura de queladores; consulte a Tabela de Materiais) e conte as células usando um hemocitômetro. Para injeções ortotópicas no nervo ciático, reconstitua as células a 16.667 células/mL (50.000 células por 3 μL para cada animal) em DMEM-10³¹. Mantenha as células no gelo.
   NOTA: Algumas culturas não estabelecerão com sucesso enxertos a menos que as células sejam injetadas na matriz de membrana de porão de fator de baixo crescimento. A exigência de uma matriz de membrana de porão (10-50%) deve ser determinada empiricamente.
3. Avalie o potencial de crescimento de aoentrato in vivo em células pós-infectadas injetando células MPNST no nervo ciático de Hsd anestografado de 8-10: Ratos^nus atímicos-foxn1 por coorte (idade de 4 a 8 semanas). Para injeção ortotópica de células tumorais, consulte Turk et al³¹. Aqui, uma injeção subcutânea é demonstrada.
   NOTA: Para determinar o número de animais experimentais necessários para significância estatística, consulte um bioestatístico ou recomenda-se o uso do G*Power3, um software livremente disponível³².
4. Monitore os animais de perto duas vezes por dia durante a primeira semana pós-injeção para qualquer sinal de dor. Posteriormente, monitore os camundongos enxertados três vezes por semana para medições de pinças e avalie os escores de condições corporais (BCSs) como descrito anteriormente ^5,31. Conforme descrito nas diretrizes da IACUC, eutanize animais com um BCS de 2 ou menos.
5. À medida que as células enxertadas crescem em taxas diferentes, determine os tempos de enxerto empiricamente usando células de controle (não modificadas) antes de realizar experimentos descritos nesta seção. Para coletar os enxertos no ponto final experimental, eutanize os camundongos humanamente usando inalação de dióxido de carbono seguido de luxação cervical como medida secundária. Regisso volume final e medições em massa de cada enxerto.
   NOTA: Como P 0-GGFβ3 não modificado; Trp53^+/-; As células MPNST erbb4^fl/fl normalmente atingem o tamanho máximo permitido pela IACUC dentro de 30-45 dias, uma linha do tempo típica é de cerca de 30-45 dias após a injeção.
6. Tecido isolado e seção conforme descrito nas etapas 1.6-1.8. Fixar parte do tecido do enxerto durante a noite em 4% de paraformaldeído (Figura 2) e, em seguida, incorporá-lo em parafina. Prepare seções de 5 μm do tecido FFPE e monte-as em lâminas. Realizar a coloração de H&E e outras imunostenções necessárias para confirmar que o tecido do enxerto é composto de células tumorais como descrito em 1.8.1. Congele o resto do tecido tumoral para análises a jusante, como validar a perda da expressão Erbb4 e avaliar os efeitos da perda de Erbb4 na expressão de outros membros da família Erbb .
   NOTA: A confirmação das células tumorais no tecido do enxerto deve ser feita porque camundongos imunodeficientes são propensos a desenvolver neoplasias. No caso de pequenos enxertos, é importante garantir que o tecido cicatricial ou inflamação não seja confundido com uma neoplasia.
   1. Realize a coloração padrão do IHC no tecido FFPE para comparar a expressão de proteínas de interesse em aloenxertos cultivados a partir de células tratadas Ad5CMV-eGFP e Ad5CMV-Cre/eGFP. Colora o tecido de enxerto excisado usando anticorpos específicos do erbB4 para confirmar diferenças na expressão in vivo erbB4 entre as duas condições experimentais. Determine o índice de proliferação através da coloração ki67 e o nível de apoptose através da coloração dUTP de rotulagem dUTP (TUNEL) mediada pelo terminal deoxynucleotidyl.
      NOTA: Qualquer meta de interesse proteica também pode ser avaliada via IHC. Por exemplo, avalie a densidade vascular imunosflando aoenxertos com um anticorpo anti-CD31 (diluição 1:50) para determinar diferenças in vivo de microambientes vasculares mediados pela ablação genética. O número de perfis vasculares por campo de 40x pode ser contado para quantificação. Para estes ensaios baseados em IHC, siga os protocolos padrão de IHC para os procedimentos de coloração e o protocolo do fabricante para coloração TUNEL. Para quantificação de imagens, use o plug-in ImageJ "contagem automatizada de imagem de cor única".

Resultados

A Figura 4 ilustra um resultado típico obtido ao transdutor P 0-GGFβ3; Trp53^-/+; Células MPNST erbb4^fl/fl com o adenovírus Ad5CMV-eGFP ou adenovírus Ad5CMV-Cre/eGFP (Figura 4A). As culturas são vistas com microscopia de fluorescência para identificar células expressas pelo eGFP e por microscopia de contraste de fase para determinar o número total de células presentes no mesmo campo em 10x (superior) e ...

Discussão

Os métodos detalhados aqui apresentados foram desenvolvidos utilizando-se um modelo GEM de MPNSTs. No entanto, se o tecido tumoral de interesse pode ser dispersado em células individuais, essas metodologias são facilmente adaptáveis para vários tipos de tumores surgidos em GEMs. É importante garantir que o alelo floxed não resulte em i) diminuição da sobrevida que pode dificultar a obtenção de camundongos suficientes para a triagem de tumores, ou ii) aumento da latência tumoral que pode dificultar a obtençã...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ad5CMV-eGFP	Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa	VVC-U of Iowa-4
Ad5CMVCre-eGFP	Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa	VVC-U of Iowa-1174
alexa 568 secondary antibody	Thermo/Fisher	GaR A11036
Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics	Bioconductor	http://www.bioconductor.org	alternative statistical analysis tool used for step 4.4
CD31	Abcam	ab28364
Celigo Image Cytometer	Nexcelom Bioscience	N/A
Cell Stripper	Corning	25-056-Cl	mixture of chelators
DAB staining kit	Vector Labs	MP-7800
DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery)	DAVID	https://david.ncifcrf.gov	functional enrichment analysis software used for step 4.5
DMEM	Corning	15-013-Cl
DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR)	Thermo/Fisher	EP0701 and K1072
erbB4 antibodies	Santa Cruz	sc-284
erbB4 antibodies	Abcam	ab35374
erbB4 antibodies	Millipore	HFR1: 05-1133
FACS Sorter	BD Biosciences	Aria II
Forskolin	Sigma	F6886
GenomeSpace Tools and Data Sources	GenomeSpace	https://genomespace.org/support/tools/	general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5
Glutamine	Corning	25-005-Cl
Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool	Gorilla	N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il	functional enrichment analysis software used for step 4.5
GSEA Gene Set Enrichment Analysis	Broad Institute	N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp	functional enrichment analysis software used for step 4.5
HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice	Envigo (Previously Harlan Labs)	69
Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer)	Illumina	Hi Seq 2500	DNA sequencer used for step 4.2
Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis	DNAStar LaserGene software	N/A	software statistical and normalization analysis used for step 4.4
Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly	software alignment used for step 4.3	N/A	software alignment used for step 4.3
Matrigel, low growth factor basement membrane matrix	Corning	354230
NRG1-beta	In house	Generated by SLC, also commercially available from R & D Systems(396-HB-050/CF).
Nuclear Stain Hoeschst 33342	Thermo	62249
Panther Gene Ontology Classification System	Panther	http://pantherdb.org	functional enrichment analysis software used for step 4.5
Partek (BWA aligner and analyzer)	Partek, Ver 7	N/A	software alignment and statistical/normalization used for step 4.3
Pen/Strep	Corning	30-002-Cl
Primer 1: 5′-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT GTCTG- 3′	Eurofins Genomics	Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product;
Primer 2: 5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC AGAAGC-3′	Eurofins Genomics	Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product;
Primer 3: 5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA ACCCAG-3′	Eurofins Genomics	Primer 1 + 3: 350 bp wild-type ErbB4 product.
Propidium Iodine	Fisher	51-351-0
Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays	R&D Systems	ARY003B
Real time glo	Promega	G9712	bioluminescent cell viability assay
ToppGene Suite	ToppGene	https://toppgene.cchmc.org	functional enrichment analysis software used for step 4.5
Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent)	Invitrogen	15596026
Tyramide Signal Amplification Kit	Perkin Elmer	NEL721001EA