通过恶性周围神经鞘肿瘤细胞中絮状等位基因的 离体 消融来定义肿瘤发生的基因功能

摘要

在这里，我们提出了一种方案，用于在基因工程小鼠模型衍生 的肿瘤中 执行胚胎在体内致命的基因敲除，然后评估敲除对肿瘤生长，增殖，存活，迁移，侵袭以及 体外 和 体内转录组的影响。

摘要

精确靶向人类癌症中关键蛋白质的新药的开发正在从根本上改变癌症治疗方法。然而，在使用这些药物之前，它们的靶蛋白必须被验证为特定癌症类型的治疗靶点。这种验证通常是通过在癌症的基因工程小鼠（GEM）模型中敲除编码候选治疗靶标的基因并确定其对肿瘤生长的影响来进行的。不幸的是，诸如传统淘汰赛中的胚胎杀伤力和有条件淘汰赛中的镶嵌性等技术问题经常限制这种方法。为了克服这些限制，开发了一种在GEM模型中产生的恶性周围神经鞘肿瘤（MPNSTs）短期培养物中烧蚀的未光斑胚胎致死性目的基因的方法。

本文描述了如何建立具有适当基因型的小鼠模型，从这些动物中提取短期肿瘤培养物，然后使用表达Cre重组酶和增强绿色荧光蛋白（eGFP）的腺病毒载体消融未发酵的胚胎致死基因。然后详细阐述使用荧光激活细胞分选（FACS）纯化用腺病毒转导的细胞，并定量基因消融对细胞增殖，活力，转录组和原位同种异体移植物生长的影响。这些方法为 在体外 和体内鉴定和验证治疗靶点提供了一种有效且可推广的方法 。 这些方法还提供了低传代肿瘤衍生细胞的可再生来源，减少了 体外 生长伪影。这使得靶向基因的生物学作用可以在各种生物过程中进行研究，例如由分泌组介导的迁移，入侵，转移和细胞间通信。

引言

在过去二十年之前，人类癌症的治疗严重依赖放疗和化疗药物，这些药物通过破坏DNA或抑制DNA合成来广泛靶向快速增殖的细胞群。虽然这些方法确实抑制了癌细胞的生长，但它们对正常快速增殖的细胞类型（如肠上皮细胞和毛囊细胞）也有有害的副作用。最近，癌症治疗已经开始利用化疗药物，这些药物精确地靶向信号通路中的蛋白质，这对个体患者肿瘤的生长至关重要。这种方法通常被称为"精准医疗"，导致了不断扩大的单克隆抗体和小分子抑制剂库的发展。这些药物有效地抑制肿瘤细胞的增殖和存活，同时避免了常规化疗药物和放疗对正常细胞类型的有害副作用。用于治疗人类癌症的单克隆抗体最常靶向细胞表面分子，例如生长因子受体¹ （例如，跨膜受体酪氨酸激酶的大家族）和免疫应答调节剂² （例如，程序性细胞死亡蛋白1，程序性死亡配体1）。小分子抑制剂可以抑制细胞表面蛋白或位于细胞内的信号蛋白³。然而，为了有效地利用这些新的治疗剂，必须确定特定的癌症依赖于候选治疗剂所靶向的分子。

虽然这些新的治疗剂具有更集中的作用，但其中许多仍然抑制一种以上蛋白质的作用。此外，通常可以使用具有不同有效性和特异性的多种试剂来靶向特定蛋白质。因此，在临床前研究期间，明智的做法是使用其他方法（例如遗传消融）来验证候选蛋白质作为治疗靶标。验证蛋白质作为治疗靶点的一种特别有用的方法是在基因工程动物模型中消融编码候选蛋白质的基因，该模型开发特定的癌症类型。如果具有零突变（自然突变，基因工程零突变["敲除"]或基因陷阱引入的零突变）的小鼠可用，并且小鼠存活到成年期，则这种方法可能相对简单。不幸的是，符合这些标准的具有零突变的小鼠通常不可用，通常是因为零突变导致胚胎死亡或在产后生命的最初几天死亡。在这种情况下，容易发生肿瘤型感兴趣的小鼠可以转而杂交到目的基因的关键片段被loxP位点（"floxed"）两侧的小鼠杂交，这允许通过将表达Cre重组酶的转基因引入肿瘤细胞（条件敲除）来消融该基因。此方法具有几个优点。首先，如果Cre驱动剂在肿瘤中表达，但不在导致常规敲除中死亡的细胞类型中表达，则这种方法可以潜在地验证候选治疗靶点。其次，在肿瘤细胞中烧蚀编码候选蛋白的基因，而不是在其他肿瘤内元素（如肿瘤相关成纤维细胞或免疫细胞）中，使研究者能够区分治疗靶点的细胞自主和非细胞自主效应。最后，他莫昔芬诱导的Cre驱动因子（CreER^T2）允许研究者在肿瘤发展的不同阶段删除目的基因，并确定候选治疗剂最有可能有效的窗口。

不幸的是，还有一些技术问题可能会限制在GEM模型中出现的肿瘤中使用有条件敲除。例如，在肿瘤细胞中表达并避免生命所必需的正常细胞中基因缺失的Cre驱动器可能不可用。另一个可能被低估的问题是，Cre和CreER^T2 驱动者经常可变地消融小鼠中絮状等位基因，导致GEM癌症中零突变的嵌合体。当这种情况发生时，靶向基因尚未消融的肿瘤细胞将继续快速增殖，用消融的等位基因过度生长肿瘤细胞。Cre驱动谱系中的马赛克化可能是由于目标谱系中非普遍的Cre表达以及独立于Cre表达⁴的单个细胞中的重组失败而发生的。这是Cre驱动因素的已知现象，与细胞类型有关，应在实验设计和数据解释期间考虑。Mosaicism可以掩盖敲除的影响，并导致研究人员错误地得出结论，即目的基因对肿瘤细胞增殖和/或存活不是必需的，因此不是有效的治疗靶点。

在之前的一项研究中遇到了其中一些问题，该研究试图确定受体酪氨酸激酶erbB4是否是MPNST细胞中的潜在治疗靶标⁵。在这些研究中，在施万细胞特异性髓鞘蛋白零启动子（P 0-GGFβ3小鼠）的控制下，使用表达编码神经肽-1（NRG1）同种型神经胶质生长因子-β3（GGFβ3）的转基因的小鼠。P 0-GGFβ3小鼠发展为多个丛状神经纤维瘤，通过概括常染色体显性肿瘤易感综合征1型（NF1）⁶型神经纤维瘤病的神经纤维瘤发病机制和丛状神经纤维瘤-MPNST进展的过程进展为MPNST。当与具有Trp53零突变的小鼠杂交时，所得P 0-GGFβ3;Trp53 ^+/-小鼠从头发展MPNSTs，如顺式Nf1 ^{+ / -;}Trp53^+/- 小鼠。

这些 MPNST 概括了在人类中从世界卫生组织 （WHO） II 级病变进展到 WHO IV 级病变⁷。在P 0-GGFβ3小鼠中，MPNSTs出现在三叉神经（58%）和脊髓背神经根（68%）⁷中预先存在的丛状神经纤维瘤内;在 P 0-GGFβ3 中产生的甲基物质免疫吸附剂;Trp53 ^+/-小鼠具有高度相似的分布。在人类中，MPNSTs最常出现在坐骨神经中，其次是臂丛神经，脊神经根，迷走神经，股骨，正中，骶丛，腘腘闭塞器以及胫骨后神经和尺神经⁸。这些GEM模型中的这种肿瘤分布与人类中的肿瘤分布有些不同。然而，在P 0-GGFβ3和P_0-GGFβ3中出现的甲基卫星;Trp53 ^{+ / -}小鼠在组织学上与人类MPNST相同，携带许多与人类MPNTS相同的突变，并概括了NF1患者中可见的神经纤维瘤 - MPNST进展过程。生成 P 0-GGFβ3 或 P_0-GGFβ3;Erbb4-^/-的Trp53+^/-小鼠是不可行的，因为具有两个Erbb4空等位基因的小鼠在继发于心脏缺陷的胚胎第10.5天在子宫内死亡⁹。因为通过引入心脏特异性Erbb4转基因（α肌球蛋白重链（MHC）-Erbb4）来拯救心脏中的Erbb4表达导致活的Erbb4^-/-小鼠¹⁰，产生具有复杂P 0-GGFβ3的小鼠;Trp53^+/-α-麦格-埃尔布4;尝试了 Erbb4^-/- 基因型。

然而，交配没有产生预期孟德尔比例的小鼠，表明所需的基因型是有害的。因此，生成P 0-GGFβ3;尝试使用具有絮状Erbb4等位基因¹¹和CreER^T2驱动程序的Trp53 ^{+ / -}小鼠允许在这些小鼠中出现的MPNST中去除Erbb4。在这些动物中，许多具有完整Erbb4等位基因的肿瘤细胞仍然存在（嵌合体）。观察到的嵌合体可能是由于他莫昔芬递送效率低下造成的，这导致组织内重组效率的差异。自发代偿机制的可能性可以通过绕过Erbb4表达的要求，进一步促进他莫昔芬介导的重组中的嵌合体。Trp53的丢失使肿瘤细胞容易受到其他自发"允许"突变的影响，这可能会混淆对数据的解释。由于Erbb4完整的MPNST细胞似乎有可能掩盖在其他肿瘤细胞中烧蚀Erbb4的后果，因此这种方法被放弃了。

这些障碍导致了一种使用表达Cre重组酶和eGFP的腺病毒在非常早期的传代MPNST细胞中烧蚀Erbb4的方法。这些细胞可以使用FACS从未感染的细胞中分离出来，这显着减少了烧蚀的Erbb4基因的嵌合体。下面描述了用于实现这一目标的方法，以及用于评估基因消融在体外和体内效果的方法。以下方案是如何产生荷瘤小鼠的一个例子，这些小鼠在体内同种异体移植肿瘤生长评估之前产生携带目标胚胎致死基因的絮状等位基因的肿瘤。这包括描述用于分析Erbb4消融对体外肿瘤细胞增殖，存活和基因表达的影响以及原位同种异体移植物中的增殖，存活和血管生成的作用的方法。

研究方案

在与小鼠进行任何程序之前，所有程序必须由机构动物护理和使用委员会审查和批准。本手稿中描述的协议已获得南卡罗来纳医科大学机构动物护理和使用委员会的批准。该协议由经过适当培训的人员按照MUSC的机构动物护理指南执行。

1. 生成MPNSTs纯合子的 小鼠的Erbb4 ^flox 等位基因

1. 产生 F1 代 P 0-GGFβ3;53^+/-;埃尔布4^fl/+ 动物通过交配 P 0-GGFβ3;Trp53^+/-小鼠⁷与Erbb4^fl/fl小鼠¹¹。使用Punett方块（图1）来指导育种方案，以确保用所需的P 0-GGFβ3产生足够的雄性和雌性_F1幼崽;53^+/-;埃尔布4^fl/+ 基因型。
2. 基因型F1后代，通过从根据IACUC指南收集的尾剪中分离基因组DNA，然后使用先前描述的引物进行PCR，以检测P 0-GGFβ3转基因¹²，Trp53野生型（+）和零（-）等位基因⁷，以及Erbb4^flox和Erbb4野生型等位基因¹³。
   1. 使用 jacks-lab.mit.edu/protocols 详述的方法分离尾部DNA。
   2. 使PCR反应与25ng DNA，0.25 nM dNTP，0.02 U / μL Taq，每个引物的0.5μM和1x PCR缓冲液混合。进行PCR反应，单次95°C孵育（熔化基因组DNA并激活Taq）1分钟，然后进行35次94°C，10秒（熔化）的PCR循环;55 °C， 30 秒 （退火）;72 °C，40秒（延长），然后是单个72°C（延长）5分钟。将反应储存在4°C，直到准备在1.2-1.5%琼脂糖凝胶上电泳。
      注意:退火温度取决于所使用的PCR缓冲液系统;建议执行退火温度梯度以确定适当的退火温度。
3. 产生F2代P 0-GGFβ3;53^+/-;Erbb4^通过交配适当的F1后代（P 0-GGFβ3;Trp53^-/+;Erbb4^fl/+） 彼此相伴。
   注意: 图1 显示了用于计算具有所需基因型的F2后代的预期数量的Punet平方预测。
4. 鉴定具有所需P 0-GGFβ3的动物;Trp53^-/+;Erbb4^fl/fl 基因型如步骤 1.2 中所述。
5. 将F2后代相互交配以维持P 0-GGFβ3;Trp53^-/+;Erbb4^{fl / fl}菌落和基因型所有幼崽。确认新引入的絮状等位基因不影响存活或肿瘤潜伏期。通过建立P 0-GGFβ3的队列（₂₀只小鼠/队列）来实现这一目标;53^+/- 和 P 0-GGFβ3;53^+/-;Erbb4^fl/fl小鼠并跟踪它们的存活率和肿瘤发生频率。
6. 每周监测动物几次，直到达到实验终点（IACUC批准的最大允许肿瘤大小/人道终点）。
   1. 在每周监测期间，评估体重，正常的社交和美容行为以及肿瘤大小测量。在体重减轻>10%、社交隐居和驼背的情况下，安排兽医评估。
   2. 当识别出荷瘤小鼠并已达到其人道终点时，使用二氧化碳吸入人道对动物实施安乐死，然后进行颈椎脱位，并使用手术刀无菌切除肿瘤。通过使用卡尺和重量肿瘤（质量和体积）测量长度，宽度和深度来进行肿瘤测量。快速工作以避免自溶。
7. 在无菌条件下，使用面包面包叶式手术刀切割肿瘤分成三个部分，以产生用于福尔马林固定/石蜡包埋（FFPE），早期传代培养物生成和速冻材料的组织段（图2A）。
   1. 确保第1部分（对于早期传代培养生成，步骤1.7.2）约为总肿瘤体积的10%，第2部分（用于固定和IHC，步骤1.7.3）为总肿瘤体积的70%，第3部分（对于快速冷冻，步骤1.7.4）是总肿瘤体积的20%。
   2. 取肿瘤的第1部分用于制备早期传代培养物（见下文）。
   3. 将肿瘤的第2部分在4°C下在4%多聚甲醛中固定过夜，然后包埋在石蜡中（福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）用于诊断性病情检查。
   4. 用于分析分析的速冻第3部分（例如，免疫印迹以验证由靶向絮凝基因编码的蛋白质是否适当表达）。
8. 用苏木精和曙红（H&E）染色5μm厚的FFPE组织切片，以确认合格病理学家的肿瘤诊断。如果合适，进行免疫组织化学染色（IHC）以确认肿瘤诊断。
   1. 免疫染色MPNSTs用于S100钙结合蛋白B（S100β），巢蛋白和性别决定区Y（SRY）-盒转录因子10（Sox10）-在MPNTS和施万细胞（肿瘤细胞起源）中表达的三个标记物^{5，6，14，15}。用识别erbB4的抗体染色肿瘤，erbB4是由下游步骤中靶向消融的基因编码的蛋白质。
   2. 为确认诊断，请合格的兽医或人类病理学家按照世卫组织诊断和分级标准^5，6，7，¹⁶评估所有染色的肿瘤载玻片。

2. MPNST细胞中絮状Erbb4等位基因的离体消融

1. 通过将第1节（步骤1.7.3）的组织置于冰冷的无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，然后将其转移到无菌工作区域（图2B）¹⁶，从新鲜收集的MPNST组织中建立早期传代培养物。
   注意:所有后续程序均应在无菌组织培养罩中进行。
2. 将肿瘤组织切碎成2-4mm片，并在10cm² 处理的组织培养皿中用10mL生长培养基研磨8-10次。将这些制剂培养在高葡萄糖DMEM-10生长培养基（杜尔贝科修饰的鹰培养基（DMEM），含有10%胎牛血清，1%谷氨酰胺，10μg/ mL链霉素和10 IU / mL青霉素）中，并补充10 nM神经肽-1β（NRG1β）和2μM毛喉素。在此阶段添加毛喉素以抑制成纤维细胞等常见污染细胞类型的生长。
3. 在5%CO₂ 气氛中将机械解离的组织和细胞在37°C下维持长达3天，以建立早期传代培养。此时不要分离分散的细胞和剩余的组织碎片。
4. 每3-4天用新培养基刷新一次培养物。让肿瘤细胞增殖，直到它们汇合。
5. 通过将融合培养物分成几道菜来扩展早期通道培养物。取出生长培养基并用1x dPBS洗涤细胞。然后，每10厘米2处理的细胞培养皿在室温下加入1mL^0.25 %胰蛋白酶2-5分钟。轻轻研磨培养物以促进分离并产生单细胞悬浮液。
   1. 通过加入2mL DMEM-10生长培养基终止胰蛋白酶消化。收集胰蛋白酶消化的细胞混合物并将其转移到5 mL无菌离心管中。通过在室温下以500× g 离心5分钟来沉淀细胞。
   2. 将细胞沉淀重悬于5mL DMEM-10中。将细胞分成两到四个10厘米的细胞培养皿，每个培养皿含有10mL生长培养基（每个培养皿约1×10^个6 个细胞）。
6. 5次传代后（在2.5中重复步骤），使用不含NRG1β和毛喉素的生长培养基。用抗S100β抗体对培养物样品进行免疫染色，以验证培养物仅由肿瘤细胞组成。在所有后续传代中将细胞保持在DMEM-10生长培养基中。
7. 在下一次传代时，计数细胞并冷冻P 0-GGFβ3的一部分;53^+/-;从融合培养物（3 ×10⁶个细胞/小瓶）中收集的Erbb4 fl ^{/ fl} MPNST细胞。
8. 板 P 0-GGFβ3;53^+/-;Erbb4^fl/fl早期传代MPNST细胞的密度为每10cm处理过的细胞培养皿在DMEM-10生长培养基中的1.5×10⁶个细胞。
9.  第0天: （接种后约12-16小时），用2-4mL dPBS洗涤贴壁培养物，并在10mL无血清DMEM（即每10cm培养皿30μL2×10¹⁰ pfu病毒）中以约400个斑块形成单位（pfu）/细胞感染Ad5CMV-Cre / eGFP或Ad5CMV-eGFP。根据经验确定的，使用腺病毒以最大耐受病毒浓度（感染多重性，MOI）消融絮状的 Erbb4 等位基因。有关此消融工作流程的示意图，请参阅 图 2C 。
10. 第1天: 大约16小时后，通过在感染鸡尾酒中加入10mL DMEM-10来挽救培养物。
11. 第2 - 3天: FACS按照核心设施的推荐方案对感染细胞进行分类，以在感染后约48小时对eGFP阳性细胞进行分选。在FACS分选之前，在荧光显微镜上短暂检查细胞的eGFP信号，以确保培养物已被有效感染（〜50-100%阳性细胞）。将FACS后恢复的细胞恢复到10厘米组织培养皿中;保留一个培养皿用于基因组DNA分离。
12. 第4 - 5天: FACS分选后，让细胞在组织培养箱中恢复至少24-48小时，然后准备细胞进行基于 体外 细胞的分析或 体内 移植。使用从分选的eGFP阳性细胞的一部分分离的基因组DNA通过PCR确认 Erbb4 缺失。通过PCR或用抗 erbB4抗体对培养物样品进行免疫染色来验证eGFP阳性细胞是否为ErbB4阴性。
    1. 使用标准的酸性胍酚和基于氯仿的DNA分离方法从细胞中分离基因组DNA¹⁷。
    2. 进行标准PCR以区分脱色的 Erbb4 等位基因和消融的 Erbb4 等位基因。用2 ng DNA，20μM引物1 + 2进行40次循环，以产生250 bp Erbb4-null产物和350 bp絮凝产物¹³。在没有可靠的抗体可用时，同时进行PCR和基于抗体的方法以确认敲除。
       注意:细胞已准备好进行基于细胞的体外测定，如下所述。许多类型的下游分析都可以用这种方式制备的细胞进行。下面介绍的方案的目的是提供这些肿瘤细胞在Erbb4基因消融后的体外和体内应用的一些例子。

3. 具有消融 的Erbb4 等位基因的MPNST细胞中的增殖和活力测定

1. 在接下来的七天内，使用基于图像的自动细胞仪对接种在多孔板中的分选MPNST细胞进行增殖测定。
   1. 第6天: 在96孔板中将最终体积为150μL（〜13，300个细胞/ mL）的生长培养基中培养2，000个细胞。对每个实验队列和4个每日终点读数（3次重复x 2个条件x 4天）进行一式三份的测量。
   2. 第7、9、11、13天: 用 Hoechst 和碘化丙啶 （PI） 染料染色细胞，并在自动读板器上对它们进行成像，以计数每个孔中活细胞和死细胞的数量。为了实现这一点，同时用Hoechst染料染色细胞以染色活细胞和死细胞的细胞核，并用碘化丙啶（PI）标记死细胞。每天或每隔一天在同一时间执行所有读取。
      1. 向当天（例如，仅第7天）定量的每个孔中加入50μL 4x PI / Hechst染色溶液（每个4μg/ mL），并在组织培养箱中于37°C下孵育30分钟。保护板材避光。
         注意:Hoechst的染色浓度需要根据经验确定，根据细胞类型，范围可以从1到10μg/ mL。
      2. 孵育后，使用自动细胞成像仪上的适当荧光通道读取染色的孔。读数后，将板放回培养箱，以便在随后的几天（即第9天，第11天，第13天）进行将来的读数。
      3. 根据所使用的成像系统量化染色强度，并使用以下设置计算死细胞，活细胞和总细胞的数量:蓝色通道（377 / 50nm，Hoechst）:总细胞（活细胞和死细胞）;红色通道（531/40 nm，PI）:仅死细胞;蓝色 - 红色（总计 - 死亡）=活细胞。
2. 如果需要，按照测定制造商的方案，在三天内进行细胞活力测定。
   注意:通过进行三重染色，包括钙黄绿素AM（488/32nm，绿色通道，特异性标记活细胞），PI和Hoechst，活性测定可以与增殖测定相结合。细胞凋亡测定也可以使用如上所述设置的培养物进行;具体方案将取决于成像系统。
   1. 第6天: 将每孔4，000个细胞以150μL的最终体积在96孔板中一式三份。
   2. 第7 – 9天: 加入2，000x生物发光细胞活力测定试剂（材料表），将板返回培养箱，并在1小时后读取板。每天在同一时间执行后续读取。对于生物发光（MTT）测定，使用光度计读板器每24小时严格按照制造商说明中概述的测定，持续72小时。

4. RNA-Seq分析和鉴定其表达因 Erbb4 丢失而改变的基因

1. 第6天: 使用标准的酸性胍酚和基于氯仿的方法从分选的MPNST细胞中分离总RNA。对于旨在检测两个队列之间mRNA水平变化的实验，请从每个队列中的至少三个生物重复中制备总RNA。
   1. 为了消除由腺病毒载体或eGFP表达引起的事件而不是Erbb4损失，从P 0-GGFβ3的三个生物重复中分离RNA;53^+/-;用Ad5CMV-Cre / eGFP转导的Erbb4 fl ^{/ fl} MPNST细胞和用Ad5CMV-eGFP转导的三个生物重复。
      注意:分离的RNA必须具有≥8的RNA完整性数（RIN）评分才能进行RNA-Seq分析。在构建文库之前，确保测序核心确定所有样品的 RIN。
2. 使用来自每个样品的100-200ng高质量总RNA来制备RNA-Seq文库（使用核心测序工具进行此步骤）。使用下一代 DNA 测序仪执行高通量测序。对于mRNA定量，执行单端测序以生成Fastq文件。确保每个样品至少读取 5000 万次。
   注意:请参阅 图3 ，了解用于处理RNA-Seq数据和量化差异表达转录本表达的工作流程的示意图。以Fastq文件形式存在的序列数据受到质量控制程序的约束;>80% 的读数应得出 30 分的 Phred 评分，以被认为适合后续分析。这些序列还使用 Trimmomatic¹⁸ 进行预处理（修剪），以删除适配器序列并过滤掉低质量的读数。
3. 使用任何功能强大的软件程序（例如，DNAStar^19，20 或 Partek²¹）对 fastq 生成的文件执行 RNA-Seq 比对和分析。使用默认设置按照程序特定的步骤将 fastq 文件与小鼠参考基因组 （GRCm38/mm10） 对齐。
   注意:以 DNAStar 为例，一般工作流程如下所述（补充图 1）。
   1. 选择分析方法，RNA-酶。
   2. 选择参考基因组， 小鼠。
   3. 上传 BED 文件（如果排序内核提供）。
   4. 上传 fastq 测序文件，为它们分配唯一的复制名称。
   5. 对 fastq 文件进行分组复制，并将它们指定为复制集（即 GFP、CRE）
      注意:每个对齐程序都有其特定的步骤，用户必须查阅程序用户指南以了解程序特定的协议。然后，该程序将从这些Fastq文件生成基因特异性原始计数数据。
4. 如4.3所述，使用任何功能强大的软件程序对原始计数数据执行统计和归一化分析（DESeq2，EdgeR），将Ad5CMV-eGFP样本集作为对照数据集，以强大的统计能力^22，23识别差异基因表达信号。
   1. 选择 GFP 快速 q 文件 作为控制数据集。
   2. 选择 DESeq2 作为统计和归一化方法。
   3. 开始组装和分析。
      注意:每个对齐程序都有其特定的步骤，用户必须查阅程序用户指南以了解程序特定的协议。然后，该程序将从这些Fastq文件生成基因特异性原始计数数据。统计和归一化分析是序列比对协议中许多程序中的内置步骤，如此处的示例所示。如果使用的替代序列比对软件程序不提供此后续内置步骤，请使用用R编写的DESeq2或EdgeR编码包在终端级别对原始计数数据执行统计和归一化分析，这些包可在 Bioconductor.org 上免费下载。
5. 使用这些方法识别相对于对照至少增加或减少1.5倍的变化（在这种情况下，用Ad5CMV-eGFP病毒转导的细胞）。仅使用那些被确定为具有统计学显著性的差异表达基因（DEG），这些基因显示≥1.5倍的变化和 p值0.05或padj为0.1，用于后续的功能富集分析。
   注意:这将生成DEG基因及其功能富集分析的统计功效列表。
6. 使用任何免费提供的基于Web的工具，使用排名基因列表文件对4.4中鉴定的具有统计显着性的Erbb4介导的DEG进行功能富集分析。通过集成在这些开放获取功能富集分析工具^{24，25，26，27}中的基因本体数据集来确定Erbb4基因丢失的生物学和通路意义（参见材料表的示例和图3，了解使用Panther的示例工作流程）。
   1. 将步骤 4.4 中获得的数据导出为电子表格。
   2. 按 log2 折叠更改和/或 p/padj 值对数据进行排名。
   3. 请务必删除所有非统计显著性数据。
   4. 仅将具有基因ID的排名基因列表导出为.txt文件，并将其上传到网站。
      注意:仅使用具有统计显著性的 DEG（p/padj 值分别< 0.05 或 0.1）来生成使用 log2 折叠更改（从高到低）、p/padj 值（从低到高）或两者 [（-log10（pval）*符号 （log2FC）] 的排名输入基因列表。有几种方法可以生成排名基因列表，并根据经验确定数据集和所问的问题。所使用的特定类型的功能富集分析工具也有助于确定适当类型的等级基因列表。有关RNA-Seq的其他资源，请参阅以下论文^28，29，30。

5. MPNST细胞与消融 Erbb4 等位基因的原位同位异体移植及 Erbb4 消融效果分析

1. 在对分选的MPNST细胞进行原位同种异体移植之前，请确保所有程序都经过机构动物护理和使用委员会的审查和批准，并且所有程序都由经过适当培训的人员执行。
2. 在注射当天，使用非酶细胞解离溶液（例如，螯合剂混合物，参见 材料表）从细胞培养板或烧瓶中除去低传代细胞（约85%汇合度），并使用血细胞计数器计数细胞。对于坐骨神经的原位注射，在DMEM-10 31中以16，667个细胞/ mL（每只动物每3μL50，000个细胞）重建^细胞。将细胞保持在冰上。
   注意:除非将细胞注射到低生长因子基底膜基质中，否则某些培养物将无法成功建立移植物。必须根据经验确定对基底膜基质（10-50%）的要求。
3. 通过将MPNST细胞注射到8-10个麻醉Hsd的坐骨神经中来评估感染后细胞中的体内同种异体移植物生长潜力:每个队列（4-8周龄）的无胸腺Nude-Foxn1 nu小鼠。对于肿瘤细胞的原位注射，参见Turk等人³¹。在这里，演示了皮下注射。
   注意:要确定统计显著性所需的实验动物数量，请咨询生物统计学家，或者建议使用G *Power3，一个免费提供的软件³²。
4. 在注射后的第一周，每天密切监测动物两次，以发现任何疼痛迹象。此后，每周监测移植小鼠三次卡尺测量并评估身体状况评分（BCS），如前所述^5，31。如IACUC指南中所述，对BCS为2或更低的动物实施安乐死。
5. 由于接种细胞以不同的速率生长，在进行本节中描述的实验之前，请使用对照（未修饰）细胞根据经验确定移植物时间。为了在实验终点收集移植物，使用二氧化碳吸入，然后宫颈脱位作为次要措施，对小鼠进行人道安乐死。记录每个移植物的最终体积和质量测量值。
   注:作为未修饰的 P 0-GGFβ3;53^+/-;Erbb4^{fl / fl} MPNST细胞通常在30-45天内达到IACUC允许的最大尺寸，典型的时间表约为注射后30-45天。
6. 分离和切片组织，如步骤1.6-1.8所述。将部分移植物组织在4%多聚甲醛中固定过夜（图2），然后将其包埋在石蜡中。从FFPE组织中制备5μm切片并将其安装在载玻片上。进行H&E染色和其他必要的免疫染色，以确认移植物组织由肿瘤细胞组成，如1.8.1所述。快速冷冻肿瘤组织的其余部分以进行下游分析，例如验证 Erbb4 表达的损失和评估 Erbb4 丢失对其他 Erbb 家族成员表达的影响。
   注意:必须确认移植物组织中的肿瘤细胞，因为免疫缺陷小鼠容易发生肿瘤。在小移植物的情况下，重要的是要确保疤痕组织或炎症不会被误认为是肿瘤。
   1. 在FFPE组织上进行标准IHC染色，以比较从Ad5CMV-eGFP和Ad5CMV-Cre / eGFP处理的细胞生长的同种异体移植物中目标蛋白质的表达。使用erbB4特异性抗体对切除的移植物组织进行染色，以确认两种实验条件之间 体内 erbB4表达的差异。通过Ki67染色确定增殖指数，并通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP切口标记（TUNEL）染色确定细胞凋亡水平。
      注意:任何感兴趣的蛋白质靶标也可以通过IHC进行评估。例如，通过用抗CD31抗体（1:50稀释）对同种异体移植物进行免疫染色来评估血管密度，以确定由基因消融介导的体内血管微环境差异。可以计算每个40x场的血管轮廓数量以进行量化。对于这些基于 IHC 的检测，请遵循染色程序的标准 IHC 方案和制造商的 TUNEL 染色方案。要量化图像，请使用 ImageJ 插件"单色图像的自动计数"。

结果

图4示出了转导P 0-GGFβ3时获得的典型结果;Trp53^-/+;具有腺5CMV-eGFP腺病毒或AD5CMV-cre/eGFP腺病毒的Erbb4 fl/^{fl MPNST}细胞（图4A）。用荧光显微镜观察培养物以鉴定表达eGFP的细胞，并通过相差显微镜确定同一场中存在的细胞总数为10x（顶部）和40x（底部）。如果需要，可以计算表达eGFP的细胞的百分比。代表性的FACS输出数据如...

讨论

这里介绍的详细方法是使用MPNST的GEM模型开发的。然而，如果感兴趣的肿瘤组织可以分散到单个细胞中，这些方法很容易适应GEM中出现的各种肿瘤类型。重要的是要确保絮状等位基因不会导致i）存活率下降，这可能使获得足够的小鼠难以筛查肿瘤，或ii）肿瘤潜伏期增加，可能使获得足够的荷瘤小鼠变得困难。如果絮状等位基因不影响存活，则两个队列的存活率将是相等的。如果它对肿瘤潜伏期?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ad5CMV-eGFP	Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa	VVC-U of Iowa-4
Ad5CMVCre-eGFP	Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa	VVC-U of Iowa-1174
alexa 568 secondary antibody	Thermo/Fisher	GaR A11036
Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics	Bioconductor	http://www.bioconductor.org	alternative statistical analysis tool used for step 4.4
CD31	Abcam	ab28364
Celigo Image Cytometer	Nexcelom Bioscience	N/A
Cell Stripper	Corning	25-056-Cl	mixture of chelators
DAB staining kit	Vector Labs	MP-7800
DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery)	DAVID	https://david.ncifcrf.gov	functional enrichment analysis software used for step 4.5
DMEM	Corning	15-013-Cl
DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR)	Thermo/Fisher	EP0701 and K1072
erbB4 antibodies	Santa Cruz	sc-284
erbB4 antibodies	Abcam	ab35374
erbB4 antibodies	Millipore	HFR1: 05-1133
FACS Sorter	BD Biosciences	Aria II
Forskolin	Sigma	F6886
GenomeSpace Tools and Data Sources	GenomeSpace	https://genomespace.org/support/tools/	general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5
Glutamine	Corning	25-005-Cl
Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool	Gorilla	N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il	functional enrichment analysis software used for step 4.5
GSEA Gene Set Enrichment Analysis	Broad Institute	N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp	functional enrichment analysis software used for step 4.5
HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice	Envigo (Previously Harlan Labs)	69
Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer)	Illumina	Hi Seq 2500	DNA sequencer used for step 4.2
Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis	DNAStar LaserGene software	N/A	software statistical and normalization analysis used for step 4.4
Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly	software alignment used for step 4.3	N/A	software alignment used for step 4.3
Matrigel, low growth factor basement membrane matrix	Corning	354230
NRG1-beta	In house	Generated by SLC, also commercially available from R & D Systems(396-HB-050/CF).
Nuclear Stain Hoeschst 33342	Thermo	62249
Panther Gene Ontology Classification System	Panther	http://pantherdb.org	functional enrichment analysis software used for step 4.5
Partek (BWA aligner and analyzer)	Partek, Ver 7	N/A	software alignment and statistical/normalization used for step 4.3
Pen/Strep	Corning	30-002-Cl
Primer 1: 5′-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT GTCTG- 3′	Eurofins Genomics	Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product;
Primer 2: 5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC AGAAGC-3′	Eurofins Genomics	Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product;
Primer 3: 5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA ACCCAG-3′	Eurofins Genomics	Primer 1 + 3: 350 bp wild-type ErbB4 product.
Propidium Iodine	Fisher	51-351-0
Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays	R&D Systems	ARY003B
Real time glo	Promega	G9712	bioluminescent cell viability assay
ToppGene Suite	ToppGene	https://toppgene.cchmc.org	functional enrichment analysis software used for step 4.5
Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent)	Invitrogen	15596026
Tyramide Signal Amplification Kit	Perkin Elmer	NEL721001EA