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Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour effectuer des knockouts génétiques qui sont létaux embryonnaires in vivo dans des tumeurs génétiquement modifiées dérivées de modèles murins, puis évaluer l’effet que le knockout a sur la croissance tumorale, la prolifération, la survie, la migration, l’invasion et le transcriptome in vitro et in vivo.

Résumé

Le développement de nouveaux médicaments qui ciblent précisément les protéines clés dans les cancers humains modifie fondamentalement les thérapies anticancéreuses. Cependant, avant que ces médicaments puissent être utilisés, leurs protéines cibles doivent être validées en tant que cibles thérapeutiques dans des types de cancer spécifiques. Cette validation est souvent effectuée en éliminant le gène codant pour la cible thérapeutique candidate dans un modèle de cancer de souris génétiquement modifiée (GEM) et en déterminant l’effet que cela a sur la croissance tumorale. Malheureusement, des problèmes techniques tels que la létalité embryonnaire dans les knockouts conventionnels et le mosaïcisme dans les knockouts conditionnels limitent souvent cette approche. Pour surmonter ces limites, une approche d’ablation d’un gène létal embryonnaire floxé d’intérêt dans des cultures à court terme de tumeurs malignes de la gaine nerveuse périphérique (MPNST) générées dans un modèle GEM a été développée.

Cet article décrit comment établir un modèle murin avec le génotype approprié, dériver des cultures tumorales à court terme de ces animaux, puis ablation du gène létal embryonnaire floxé à l’aide d’un vecteur adénoviral qui exprime la Cre recombinase et la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP). La purification des cellules transduites avec l’adénovirus à l’aide du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) et la quantification des effets que l’ablation génique exerce sur la prolifération cellulaire, la viabilité, le transcriptome et la croissance de l’allogreffe orthotopique sont ensuite détaillées. Ces méthodologies fournissent une approche efficace et généralisable pour identifier et valider des cibles thérapeutiques in vitro et in vivo. Ces approches fournissent également une source renouvelable de cellules dérivées de tumeurs à faible passage avec des artefacts de croissance in vitro réduits. Cela permet d’étudier le rôle biologique du gène ciblé dans divers processus biologiques tels que la migration, l’invasion, les métastases et la communication intercellulaire médiée par le sécrétome.

Introduction

Avant les deux dernières décennies, le traitement des cancers humains reposait fortement sur la radiothérapie et les agents chimiothérapeutiques qui ciblaient largement les populations cellulaires proliférant rapidement en endommageant l’ADN ou en inhibant la synthèse de l’ADN. Bien que ces approches aient inhibé la croissance des cellules cancéreuses, elles ont également eu des effets secondaires délétères sur des types cellulaires normaux qui prolifèrent rapidement, tels que les cellules épithéliales intestinales et les cellules du follicule pileux. Plus récemment, le traitement du cancer a commencé à utiliser des agents chimiothérapeutiques qui ciblent précisément les protéines dans les voies de signalisation qui sont d’une importance cruciale pour la croissance du néoplasme d’un patient individuel. Cette approche, communément appelée « médecine de précision », a conduit au développement d’un répertoire sans cesse croissant d’anticorps monoclonaux et de petits inhibiteurs moléculaires. Ces agents inhibent efficacement la prolifération et la survie des cellules tumorales tout en évitant les effets secondaires délétères sur les types de cellules normales observés avec les agents chimiothérapeutiques conventionnels et la radiothérapie. Les anticorps monoclonaux utilisés pour le traitement des cancers humains ciblent le plus souvent des molécules de surface cellulaire telles que les récepteurs du facteur de croissance1 (p. ex., la grande famille des tyrosine kinases du récepteur membranaire) et les modulateurs de la réponse immunitaire2 (p. ex., protéine de mort cellulaire programmée 1, ligand de mort programmé 1). Les petits inhibiteurs moléculaires peuvent inhiber soit les protéines de surface cellulaire, soit les protéines de signalisation situées intracellulairement3. Cependant, pour utiliser efficacement ces nouveaux agents thérapeutiques, il faut établir qu’un cancer particulier dépend de la molécule ciblée par un agent thérapeutique candidat.

Bien que ces nouveaux agents thérapeutiques aient des effets plus ciblés, beaucoup d’entre eux inhibent encore l’action de plus d’une protéine. De plus, plusieurs agents avec une efficacité et une spécificité variables sont souvent disponibles pour cibler une protéine spécifique. Par conséquent, lors des investigations précliniques, il est judicieux d’utiliser des approches supplémentaires telles que l’ablation génétique pour valider une protéine candidate comme cible thérapeutique. Une approche particulièrement utile pour valider une protéine en tant que cible thérapeutique consiste à ablation du gène codant pour la protéine candidate dans un modèle animal génétiquement modifié qui développe le type de cancer spécifique d’intérêt. Cette approche peut être relativement simple si des souris porteuses d’une mutation nulle (soit une mutation naturelle, une mutation nulle génétiquement modifiée [un « knockout»], ou une mutation nulle introduite par un piège génétique) sont disponibles et que les souris sont viables à l’âge adulte. Malheureusement, les souris avec une mutation nulle qui répondent à ces critères ne sont souvent pas disponibles, généralement parce que la mutation nulle entraîne la mort embryonnaire ou dans les premiers jours de la vie postnatale. Dans cette circonstance, les souris sujettes à développer le type de tumeur d’intérêt peuvent plutôt être croisées avec des souris dans lesquelles des segments clés du gène d’intérêt sont flanqués de sites loxP (« floxed »), ce qui permet au gène d’être ablée en introduisant un transgène exprimant la Cre recombinase dans les cellules tumorales (un knockout conditionnel). Cette approche offre plusieurs avantages. Tout d’abord, si un pilote de Cre est disponible qui est exprimé dans la tumeur mais pas dans le type de cellule qui a conduit à la mort dans les knockouts conventionnels, cette approche peut potentiellement valider la cible thérapeutique candidate. Deuxièmement, l’ablation du gène codant pour la protéine candidate dans les cellules tumorales mais pas dans d’autres éléments intratumoraux tels que les fibroblastes associés à la tumeur ou les cellules immunitaires permet à l’investigateur de distinguer les effets autonomes cellulaires et non autonomes de la cible thérapeutique. Enfin, un pilote cre inductible au tamoxifène (CreERT2) permet à l’investigateur de supprimer le gène d’intérêt à différents stades du développement tumoral et de définir la fenêtre dans laquelle l’agent thérapeutique candidat est le plus susceptible d’être efficace.

Malheureusement, il existe également des problèmes techniques qui peuvent limiter l’utilisation de knockouts conditionnels dans les tumeurs survenant dans les modèles GEM. Par exemple, un facteur cre qui est exprimé dans les cellules tumorales et évite la délétion de gènes dans les cellules normales essentielles à la vie peut ne pas être disponible. Un autre problème, qui peut être sous-estimé, est que les pilotes Cre et CreERT2 ablatent souvent de manière variable les allèles floxés chez la souris, ce qui entraîne un mosaïcisme pour la mutation nulle dans un cancer GEM. Lorsque cela se produit, les cellules tumorales dans lesquelles le gène ciblé n’a pas été ablation continueront à proliférer rapidement, envahissant les cellules tumorales avec des allèles ablés. Le mosaïcisme dans les lignes pilotes de Cre peut se produire en raison de l’expression non omniprésente de Cre dans la lignée ciblée et par l’échec de la recombinaison dans des cellules individuelles indépendantes de l’expression de Cre4. Il s’agit d’un phénomène connu des facteurs de Cre qui dépend du type cellulaire et doit être pris en compte lors de la conception expérimentale et de l’interprétation des données. Le mosaïcisme peut masquer l’effet de l’assommage et amener un chercheur à conclure à tort que le gène d’intérêt n’est pas essentiel à la prolifération et/ou à la survie des cellules tumorales et n’est donc pas une cible thérapeutique valide.

Plusieurs de ces problèmes ont été rencontrés dans une étude précédente qui tentait de déterminer si le récepteur tyrosine kinase erbB4 était une cible thérapeutique potentielle dans les cellules MPNST5. Dans ces études, des souris ont été utilisées qui expriment un transgène codant pour le facteur de croissance gliale isoforme neuréguline-1 (NRG1) β3 (GGFβ3) sous le contrôle du promoteur zéro de la protéine de myéline spécifique à la cellule de Schwann (souris P 0-GGFβ3). Les souris P 0-GGFβ3 développent plusieurs neurofibromes plexiformes qui progressent pour devenir des MPNST via un processus qui récapitule les processus de pathogenèse du neurofibrome et de progression du neurofibrome plexiforme-MPNST observé chez les patients atteints du syndrome de susceptibilité tumorale autosomique dominante neurofibromatose de type 1 (NF1)6. Lorsqu’il est croisé avec des souris avec une mutation nulle Trp53, le P 0-GGFβ3 résultant; Les souris Trp53+/- développent des MPNST de novo comme on le voit dans cis-Nf1+/-; Trp53+/- souris.

Ces MPNST récapitulent la progression des lésions de grade II de l’Organisation mondiale de la Santé (OMS) aux lésions de grade IV de l’OMS observées chez l’homme7. Chez les souris P 0-GGFβ3, les MPNST apparaissent dans les neurofibromes plexiformes préexistants dans le nerf trijumeau (58%) et les racines du nerf dorsal spinal (68%)7; les MPNST apparaissant dans P 0-GGFβ3; Les souris Trp53+/- ont une distribution très similaire. Chez l’homme, les MPNST surviennent le plus souvent dans le nerf sciatique, suivi du plexus brachial, des racines du nerf spinal, du vagus, du fémur, de la médiane, du plexus sacré, de l’obturateur poplité et des nerfs tibia et ulnaire postérieurs8. Cette distribution tumorale dans ces modèles GEM est quelque peu différente de ce qui est vu chez l’homme. Cependant, les MPNST qui apparaissent dans P 0-GGFβ3 et P0-GGFβ3; Les souris Trp53+/- sont histologiquement identiques aux MPNST humains, portent bon nombre des mêmes mutations observées chez les MPNST humains et récapitulent le processus de progression du neurofibrome-MPNST observé chez les patients NF1. La génération de P 0-GGFβ3 ou P0-GGFβ3; Trp53+/- souris qui étaient Erbb4-/- n’était pas faisable car les souris avec deux allèles nuls Erbb4 meurent in utero au jour embryonnaire 10,5 secondaire à des malformations cardiaques9. Parce que sauver l’expression d’Erbb4 dans le cœur en introduisant un transgène Erbb4 spécifique au cœur (chaîne lourde α-myosine (CMH)-Erbb4) donne des souris Erbb4-/- viables 10, la génération de souris avec un P 0-GGFβ3 compliqué; Trp53+/-;α-MHC-Erbb4; Le génotype Erbb4-/- a été tenté.

Cependant, les accouplements n’ont pas produit de souris dans les rapports mendéliens attendus, ce qui indique que le génotype souhaité était délétère. Par conséquent, la génération de P 0-GGFβ3; Des souris Trp53+/- avec des allèles Erbb4 floxés 11 et un pilote CreERT2 ont été tentées pour permettre la suppression d’Erbb4 dans les MPNST survenant chez ces souris. Chez ces animaux, de nombreuses cellules tumorales avec des allèles Erbb4 intacts étaient encore présentes (mosaïcisme). Le mosaïcisme observé pourrait résulter d’un apport inefficace de tamoxifène, ce qui a entraîné des différences dans l’efficacité de la recombinaison dans le tissu. La possibilité de mécanismes compensatoires spontanés pourrait contribuer davantage au mosaïcisme dans la recombinaison médiée par le tamoxifène en contournant l’exigence d’expression d’Erbb4. Il est possible que la perte de Trp53 rende les cellules tumorales sensibles à d’autres mutations spontanées « permissives » qui pourraient confondre l’interprétation des données. Comme il semblait probable que les cellules MPNST intactes d’Erbb4 masqueraient les conséquences de l’ablation d’Erbb4 dans d’autres cellules tumorales, cette approche a été abandonnée.

Ces obstacles ont conduit au développement d’une méthodologie pour ablation d’Erbb4 dans les cellules MPNST à passage très précoce à l’aide d’un adénovirus exprimant la Cre recombinase et l’eGFP. Ces cellules peuvent être séparées des cellules non infectées à l’aide de FACS, ce qui réduit considérablement le mosaïcisme du gène Erbb4 ablée. Ci-dessous, les méthodes utilisées pour y parvenir, ainsi que les méthodes utilisées pour évaluer les effets de l’ablation génique in vitro et in vivo, sont décrites. Le protocole suivant est un exemple de la façon de produire des souris porteuses de tumeurs qui produisent des tumeurs portant des allèles floxés de gènes létaux embryonnaires d’intérêt pour l’excision ex vivo avant l’évaluation de la croissance tumorale par allogreffe in vivo . Cela comprend une description des approches utilisées pour analyser l’effet que l’ablation d’Erbb4 exerce sur la prolifération des cellules tumorales, la survie et l’expression des gènes in vitro et la prolifération, la survie et l’angiogenèse dans les allogreffes orthotopiques.

Protocole

Avant d’effectuer des procédures avec des souris, toutes les procédures doivent être examinées et approuvées par le Comité de soins et d’utilisation des animaux en établissement. Le protocole décrit dans ce manuscrit a été approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université médicale de Caroline du Sud. Ce protocole a été exécuté par du personnel dûment formé conformément aux directives de soins aux animaux en établissement du MUSC.

1. Génération de souris qui développent des MPNST homozygotes pour les allèles Erbb4 flox

  1. Produire la génération F1 de P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/+ animaux par accouplement P 0-GGFβ3; Trp53+/- souris7 avec Erbb4fl/fl souris11. Utiliser un carré de Punnett (Figure 1) pour guider le schéma de reproduction afin de s’assurer qu’un nombre suffisant de petits F1 mâles et femelles sont générés avec le P 0-GGFβ3 souhaité; Trp53+/-; Génotype Erbb4fl/+.
  2. La progéniture du génotype F1 en isolant l’ADN génomique d’une souche de queue recueillie conformément aux directives de l’IACUC, puis en effectuant une PCR à l’aide d’amorces décrites précédemment pour détecter le transgène P 0-GGFβ312, les allèles de type sauvage Trp53 (+) et nuls (-)7, et les allèles de type sauvage Erbb4flox et Erbb4 13.
    1. Isolez l’ADN de la queue à l’aide de méthodes détaillées sur jacks-lab.mit.edu/protocols.
    2. Faites le mélange de réaction PCR avec 25 ng d’ADN, 0,25 nM dNTPs, 0,02 U/μL Taq, 0,5 μM de chaque amorce et 1x tampon PCR. Effectuer une réaction pcR avec une seule incubation à 95 °C (pour faire fondre l’ADN génomique et activer Taq) pendant 1 min suivie de 35 cycles pcR de 94 °C, 10 s (fusion); 55 °C, 30 s (recuit); 72 °C, 40 s (extension) suivie d’un seul 72 °C (extension) pendant 5 min. Conservez les réactions à 4 °C jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à fonctionner sur un gel d’agarose à 1,2-1,5 %.
      REMARQUE: La température de recuit dépend du système tampon PCR utilisé; il est recommandé d’effectuer un gradient de température de recuit pour déterminer la température de recuit appropriée.
  3. Produire la génération F2 de P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/fl animaux en accoupant la descendance F1 appropriée (P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/+) les uns avec les autres.
    REMARQUE: La figure 1 illustre les prédictions carrées de Punnet utilisées pour calculer le nombre attendu de descendants F2 avec le génotype souhaité.
  4. Identifier les animaux avec le P 0-GGFβ3 souhaité; Trp53-/+; Génotype Erbb4fl/fl tel que décrit à l’étape 1.2.
  5. Mate F2 descendance l’un à l’autre pour maintenir le P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/fl colonie et génotype tous les chiots. Confirmez que l’allèle floxé nouvellement introduit ne compromet pas la survie ou la latence tumorale. Atteindre cet objectif en établissant des cohortes (20 souris/cohorte) de P 0-GGFβ3; Trp53+/- et P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl / fl souris et suivent leur survie et la fréquence d’apparition de la tumeur.
  6. Surveiller les animaux plusieurs fois par semaine jusqu’à ce que le critère d’évaluation expérimental soit atteint (taille maximale admissible de la tumeur/critère d’évaluation sans cruauté approuvé par l’IACUC).
    1. Au cours de la surveillance hebdomadaire, évaluez le poids corporel, le comportement social et de toilettage normal et les mesures de la taille de la tumeur. Organisez une évaluation vétérinaire en cas de perte de poids de >10% du poids corporel, d’isolement social et de intuition.
    2. Lorsqu’une souris porteuse de tumeur est identifiée et a atteint son point d’extrémité sans cruauté, euthanasier humainement l’animal en utilisant l’inhalation de dioxyde de carbone suivie d’une luxation cervicale et enlever stérilement la tumeur à l’aide d’un couteau à scalpel. Prenez des mesures tumorales en mesurant la longueur, la largeur et la profondeur à l’aide d’un étrier et d’une tumeur de poids (masse et volume). Travaillez rapidement pour éviter l’autolyse.
  7. Découpez la tumeur en trois sections à l’aide de coupes de type pain avec un couteau à scalpel dans des conditions stériles afin de générer des segments tissulaires pour la fixation du formol / incorporation de paraffine (FFPE), la génération de culture de passage précoce et le matériel surgelé (Figure 2A).
    1. Assurez-vous que la section 1 (pour la génération précoce de culture de passage, étape 1.7.2) représente environ 10% du volume total de la tumeur, la section 2 (pour la fixation et l’IHC, étape 1.7.3) représente 70% du volume total de la tumeur et la section 3 (pour le gel éclair, étape 1.7.4) représente 20% du volume total de la tumeur.
    2. Prendre la rubrique 1 de la tumeur pour la préparation de cultures à passage précoce (voir ci-dessous).
    3. Fixer la section 2 de la tumeur dans du paraformaldéhyde à 4% pendant la nuit à 4 ° C, puis incorporer dans de la paraffine (incorporée de paraffine fixée au formol (FFPE) pour le bilan diagnostique.
    4. Flash-freeze section 3 pour les analyses analytiques (p. ex., immunoblots pour vérifier que la protéine codée par le gène floxé ciblé est correctement exprimée).
  8. Colorez des coupes de tissu FFPE de 5 μm d’épaisseur avec de l’hématoxyline et de l’éosine (H & E) pour confirmer le diagnostic de tumeur par un pathologiste qualifié. Le cas échéant, effectuer une coloration immunohistochimique (IHC) pour confirmer le diagnostic de la tumeur.
    1. Les MPNST immunotachés pour la protéine B (S100β) de liaison au calcium S100, la nestine et le facteur de transcription 10 (Sox10) de la région déterminante du sexe Y (SRY) - trois marqueurs qui sont exprimés dans les MPNST et les cellules de Schwann (origine des cellules tumorales)5,6,14,15. Colorez les tumeurs avec des anticorps reconnaissant erbB4, la protéine codée par le gène ciblé pour l’ablation par étapes en aval.
    2. Pour confirmer le diagnostic, demandez à un vétérinaire ou à un pathologiste humain qualifié d’évaluer toutes les lames tumorales colorées conformément aux critères de diagnostic et de classement 5,6,7,16 de l’OMS.

2. Ablation ex vivo des allèles Erbb4 floxés dans les cellules MPNST

  1. Établir des cultures à passage précoce à partir de tissus MPNST fraîchement prélevés en plaçant le tissu de la section 1 (étape 1.7.3) dans 10 mL de solution saline saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) glacée sur de la glace, puis en le transférant dans une zone de travail stérile (Figure 2B)16.
    REMARQUE: Toutes les procédures ultérieures doivent être effectuées dans une hotte de culture tissulaire stérile.
  2. Hacher le tissu tumoral en morceaux de 2 à 4 mm et triturer 8 à 10 fois dans un plat de culture tissulaire traité de 10 cm2 avec 10 mL de milieu de croissance. Cultiver ces préparations dans un milieu de croissance DMEM-10 à haute teneur en glucose (milieu d’Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) contenant 10 % de sérum de veau fœtal, 1 % de glutamine, 10 μg/mL de streptomycine et 10 UI/mL de pénicilline) complétée par 10 nM de neuréguline-1β (NRG1β) et 2 μM de forskoline. Ajouter de la forskoline à ce stade pour inhiber la croissance des types de cellules contaminantes courantes telles que les fibroblastes.
  3. Maintenir les tissus et cellules dissociés mécaniquement jusqu’à 3 jours à 37 °C dans une atmosphère de CO2 à 5 % pour établir une culture de passage précoce. Ne séparez pas les cellules dispersées et les fragments de tissu restants à ce stade.
  4. Rafraîchissez les cultures avec un nouveau médium tous les 3-4 jours. Laissez les cellules tumorales proliférer jusqu’à ce qu’elles soient confluentes.
  5. Élargissez les cultures de passage précoce en divisant les cultures confluentes en plusieurs plats. Retirez le milieu de croissance et lavez les cellules avec 1x dPBS. Ensuite, ajoutez 1 mL de 0,25% de trypsine pendant 2-5 min à température ambiante par plat de culture cellulaire traité de 10 cm2 . Triturez doucement la culture pour faciliter le détachement et générer une suspension unicellulaire.
    1. Terminez la trypsinisation en ajoutant 2 mL de milieu de croissance DMEM-10. Recueillir le mélange de cellules trypsinisées et le transférer dans un tube de centrifugeuse stérile de 5 mL. Granulés les cellules par centrifugation pendant 5 min à 500 × g à température ambiante.
    2. Remettre en suspension la pastille de la cellule dans 5 mL de DMEM-10. Divisez les cellules en deux à quatre boîtes de culture cellulaire de 10 cm, chacune contenant 10 mL de milieu de croissance (environ 1 × 10à 6 cellules par plat).
  6. Après 5 passages (étapes répétées en 2.5), utilisez un milieu de croissance sans NRG1β et forskoline. Immunostain un échantillon de la culture avec un anticorps anti-S100β pour vérifier que la culture est composée uniquement de cellules tumorales. Maintenir les cellules dans le milieu de croissance DMEM-10 dans tous les passages suivants.
  7. Au passage suivant, comptez les cellules et congelez une portion de P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Cellules MPNST Erbb4fl/fl prélevées à partir de cultures confluentes (3 × 106 cellules/flacon).
  8. Plaque P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Cellules MPNST à passage précoce Erbb4fl/fl à une densité de 1,5 × 106 cellules par boîte de culture cellulaire traitée de 10 cm dans un milieu de croissance DMEM-10.
  9.  Jour 0 : (environ 12 à 16 h après le placage), laver les cultures adhérentes avec 2 à 4 mL de dPBS et infecter avec Ad5CMV-Cre/eGFP ou Ad5CMV-eGFP à environ 400 unités formant de la plaque (pfu)/cellule dans 10 mL de DMEM sans sérum (c.-à-d. 30 μL de 2 × 1010 pfu de virus par plat de 10 cm). Ablation des allèles Erbb4 floxés à l’aide de l’adénovirus à la concentration virale maximale tolérée (multiplicité de l’infection, MOI), déterminée empiriquement. Reportez-vous à la Figure 2C pour un schéma du flux de travail pour cette ablation.
  10. Jour 1 : Environ 16 h plus tard, sauvez les cultures en ajoutant 10 mL de DMEM-10 au cocktail d’infection.
  11. Jour 2 - 3: Le FACS trie les cellules infectées en suivant le protocole recommandé depuis l’installation centrale pour trier les cellules eGFP positives environ 48 h après l’infection. Avant le tri FACS, vérifiez brièvement les cellules pour le signal eGFP sur un microscope à fluorescence pour vous assurer que les cultures ont été infectées efficacement (~ 50-100% de cellules positives). Renvoyer les cellules récupérées après FACS dans des boîtes de culture tissulaire de 10 cm; réserver une antenne pour l’isolement de l’ADN génomique.
  12. Jour 4 - 5: Après le tri FACS, laissez les cellules récupérer dans un incubateur de culture tissulaire pendant au moins 24 à 48 h, puis préparez les cellules pour des analyses cellulaires in vitro ou une greffe in vivo . Confirmer la délétion d’Erbb4 par PCR à l’aide d’ADN génomique isolé d’une partie des cellules eGFP-positives triées. Vérifier que les cellules eGFP-positives sont ErbB4-négatives par PCR ou en immunocolorant un échantillon de la culture avec un anticorps anti-erbB4.
    1. Isoler l’ADN génomique des cellules à l’aide de la méthode standard d’isolement de l’ADN à base d’acide-guanidinium-phénol et de chloroforme17.
    2. Effectuer une PCR standard pour distinguer les allèles Erbb4 floxés et les allèles Erbb4 ablés. Effectuer 40 cycles avec 2 ng d’ADN, 20 amorces μM 1 + 2 pour produire un produit Erbb4-null de 250 bp et un produit floxé de 350 bp13. Effectuer des approches à base de PCR et d’anticorps pour confirmer l’élimination lorsqu’aucun anticorps fiable n’est disponible.
      REMARQUE: Les cellules sont prêtes pour les tests cellulaires in vitro comme décrit ci-dessous. De nombreux types d’analyses en aval peuvent être effectués avec des cellules préparées de cette manière. Le but des protocoles présentés ci-dessous est de fournir quelques exemples d’applications in vitro et in vivo de ces cellules tumorales post-ablation du gène Erbb4 .

3. Essais de prolifération et de viabilité dans les cellules MPNST avec allèles Erbb4 ablés

  1. Effectuer des tests de prolifération au cours des sept prochains jours sur des cellules MPNST triées plaquées dans une plaque multipuits à l’aide d’un cytomètre automatisé basé sur l’image.
    1. Jour 6: Plaque 2 000 cellules par puits dans un volume final de 150 μL (~13 300 cellules/mL) de milieu de croissance dans une plaque de 96 puits. Effectuer des mesures en trois exemplaires pour chaque cohorte expérimentale et 4 lectures quotidiennes des critères d’évaluation (3 réplique x 2 conditions x 4 jours).
    2. Jours 7, 9, 11, 13: Colorez les cellules avec des colorants Hoechst et à l’iodure de propidium (PI) et imagez-les sur un lecteur de plaques automatisé pour compter le nombre de cellules vivantes et mortes dans chaque puits. Pour ce faire, colorez simultanément les cellules avec le colorant Hoechst pour colorer les noyaux des cellules vivantes et mortes et avec de l’iodure de propidium (PI) pour marquer les cellules mortes. Effectuez toutes les lectures à la même heure tous les jours ou tous les deux jours.
      1. Ajouter 50 μL d’une solution de coloration 4x PI/Hoechst (4 μg/mL chacune) à chaque puits quantifié ce jour-là (p. ex., jour 7 seulement) et incuber pendant 30 min à 37 °C dans l’incubateur de culture tissulaire. Gardez la plaque à l’abri de la lumière.
        REMARQUE: La concentration de coloration de Hoechst doit être déterminée empiriquement et peut varier de 1 à 10 μg / mL selon le type de cellule.
      2. Lisez les puits colorés après l’incubation en utilisant le canal fluorescent approprié sur l’imageur cellulaire automatisé. Après la lecture, retournez la plaque à l’incubateur pour les lectures futures les jours suivants (c.-à-d. les jours 9, 11, 13).
      3. Quantifier les intensités de coloration en fonction du système d’imagerie utilisé et calculer le nombre de cellules mortes, de cellules vivantes et de cellules totales en utilisant les paramètres suivants: canal bleu (377/50 nm, Hoechst): nombre total de cellules (vivantes et mortes); canal rouge (531/40 nm, PI) : cellules mortes seulement ; bleu - rouge (total - mort) = cellules vivantes.
  2. Effectuer le test de viabilité cellulaire sur trois jours, si vous le souhaitez, en suivant le protocole des fabricants du test.
    REMARQUE: Les tests de viabilité peuvent être combinés avec des tests de prolifération en effectuant une triple coloration, y compris la calcéine AM (488/32 nm; canal vert, en particulier les étiquettes des cellules vivantes), PI et Hoechst. Un test d’apoptose peut également être effectué à l’aide de cultures mises en place comme décrit ci-dessus; le protocole spécifique dépendra du système d’imagerie.
    1. Jour 6: Plaque 4 000 cellules par puits dans un volume final de 150 μL dans une plaque de 96 puits en triple.
    2. Jours 7 - 9: Ajouter 2 000 fois les réactifs de test de viabilité des cellules bioluminescentes (table des matériaux), retourner la plaque à l’incubateur et lire la plaque 1 h plus tard. Effectuez les lectures suivantes à la même heure tous les jours. Pour les essais de bioluminescence (MTT), effectuez le test exactement comme indiqué dans les instructions du fabricant toutes les 24 h pendant 72 h à l’aide d’un lecteur de plaque luminométrique.

4. Analyses ARN-Seq et identification des gènes dont l’expression est altérée par la perte d’Erbb4

  1. Jour 6: Isoler l’ARN total à partir de cellules MPNST triées à l’aide de méthodes standard à base d’acide-guanidinium-phénol et de chloroforme. Pour les expériences conçues pour détecter les changements dans les niveaux d’ARNm entre deux cohortes, préparez l’ARN total à partir d’au moins trois répliques biologiques dans chaque cohorte.
    1. Pour éliminer les événements causés par le vecteur adénoviral ou l’expression eGFP plutôt que par la perte d’Erbb4, isoler l’ARN de trois répliques biologiques de P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Cellules MPNST Erbb4fl/fl transduites avec Ad5CMV-Cre/eGFP et trois répliques biologiques transduites avec Ad5CMV-eGFP.
      REMARQUE: L’ARN isolé doit avoir un score de nombre d’intégrité de l’ARN (RIN) ≥ 8 pour l’analyse ARN-Seq. Assurez-vous que le noyau de séquençage détermine le RIN de tous les échantillons avant de construire des bibliothèques.
  2. Utilisez 100 à 200 ng d’ARN total de haute qualité de chaque échantillon pour préparer les bibliothèques d’ARN-Seq (travaillez avec l’installation de séquençage du noyau pour cette étape). Effectuez un séquençage à haut débit à l’aide d’un séquenceur d’ADN de nouvelle génération. Pour la quantification de l’ARNm, effectuez un séquençage à extrémité unique pour générer des fichiers Fastq. Assurez-vous d’avoir au moins 50 millions de lectures pour chaque échantillon.
    REMARQUE : Reportez-vous à la figure 3 pour obtenir un schéma illustrant le flux de travail utilisé pour traiter les données RNA-Seq et pour quantifier l’expression des transcriptions exprimées différemment. Les données de séquence, sous la forme de fichiers Fastq, sont soumises à des procédures de contrôle de la qualité; >80% des lectures devraient donner un score Phred de 30 pour être considéré comme approprié pour une analyse ultérieure. Les séquences sont également prétraitées (découpées) à l’aide de Trimmomatic18 pour supprimer les séquences d’adaptateurs et filtrer les lectures de mauvaise qualité.
  3. Effectuez l’alignement et l’analyse ARN-Seq sur les fichiers générés par fastq à l’aide de n’importe quel logiciel compatible (par exemple, DNAStar19,20 ou Partek21). Suivez les étapes spécifiques au programme en utilisant les paramètres par défaut pour aligner les fichiers fastq sur le génome de référence de la souris (GRCm38/mm10).
    REMARQUE : En utilisant DNAStar comme exemple, le flux de travail général est décrit ci-dessous (figure supplémentaire 1).
    1. Sélectionnez la méthode d’analyse, RNA-Seq.
    2. Sélectionnez le génome de référence, Souris.
    3. Téléchargez le fichier BED s’il en fournit un par le noyau de séquençage.
    4. Téléchargez les fichiers de séquençage fastq en leur attribuant des noms de réplication uniques.
    5. Répliquez les fichiers fastq de groupe et désignez-les dans un ensemble de réplication (c.-à-d. GFP, CRE)
      REMARQUE: Chaque programme d’alignement a ses étapes spécifiques, et l’utilisateur doit consulter le guide de l’utilisateur du programme pour le protocole spécifique au programme. Le programme générera ensuite des données de comptage brutes spécifiques au gène à partir de ces fichiers Fastq.
  4. Effectuer une analyse statistique et de normalisation (DESeq2, EdgeR) sur les données de comptage brutes à l’aide de tout logiciel capable, comme décrit dans 4.3, avec l’ensemble d’échantillons Ad5CMV-eGFP comme ensemble de données de contrôle et l’ensemble Ad5CMV-Cre comme ensemble de données de test pour identifier les signaux d’expression génique différentielle avec une puissance statistique robuste22,23.
    1. Sélectionnez les fichiers GFP fastq comme ensemble de données de contrôle.
    2. Sélectionnez DESeq2 comme méthode statistique et de normalisation.
    3. Démarrez l’assemblage et l’analyse.
      REMARQUE: Chaque programme d’alignement a ses étapes spécifiques, et l’utilisateur doit consulter le guide de l’utilisateur du programme pour le protocole spécifique au programme. Le programme générera ensuite des données de comptage brutes spécifiques au gène à partir de ces fichiers Fastq. L’analyse statistique et de normalisation est une étape intégrée dans de nombreux programmes, comme indiqué dans l’exemple ici, dans le protocole d’alignement de séquence. Si un autre logiciel d’alignement de séquences est utilisé qui n’offre pas cette étape intégrée ultérieure, effectuez l’analyse statistique et de normalisation sur les données de comptage brutes au niveau du terminal à l’aide des packages de codage DESeq2 ou EdgeR écrits en R, disponibles gratuitement en téléchargement sur Bioconductor.org.
  5. Utilisez ces approches pour identifier les changements représentant au moins une augmentation ou une diminution d’au moins 1,5 fois par rapport au témoin (dans ce cas, les cellules transduites avec le virus Ad5CMV-eGFP). N’utilisez que les gènes exprimés différentiellement (DEG) jugés statistiquement significatifs qui montrent des changements de ≥1,5 fois et une valeur de p de 0,05 ou un padj de 0,1 pour une analyse ultérieure de l’enrichissement fonctionnel.
    REMARQUE: Cela générera une liste des gènes DEG et leur puissance statistique pour l’analyse de l’enrichissement fonctionnel.
  6. Effectuer une analyse d’enrichissement fonctionnel sur des DEG à médiation Erbb4 statistiquement significatifs identifiés dans 4.4 avec un fichier de liste de gènes classés à l’aide de l’un des outils Web disponibles gratuitement. Déterminer l’importance biologique et de voie de la perte de gène Erbb4 grâce à des ensembles de données d’ontologie génique intégrés dans ces outils d’analyse de l’enrichissement fonctionnel en libre accès 24,25,26,27 (voir la Table des matériaux pour des exemples et la Figure 3 pour un exemple de flux de travail utilisant Panther).
    1. Exportez les données obtenues à l’étape 4.4 sous forme de feuille de calcul.
    2. Classez les données par changement de pli log2, valeur p/padj ou les deux.
    3. Assurez-vous de supprimer toutes les données non statistiquement significatives.
    4. Exportez la liste des gènes classés avec l’ID du gène uniquement en tant que fichier .txt et téléchargez-la sur le site Web.
      REMARQUE: Utilisez uniquement des DEG statistiquement significatifs (valeurs p / padj < 0,05 ou 0,1, respectivement) pour générer une liste de gènes d’entrée classés en utilisant les changements de pli log2 (du plus haut au plus bas), les valeurs p / padj (du plus bas au plus élevé) ou les deux [(-log10(pval)*sign(log2FC)]. Il existe plusieurs approches pour générer une liste de gènes classés et est déterminée empiriquement pour l’ensemble de données et la question posée. Le type spécifique d’outil d’analyse de l’enrichissement fonctionnel utilisé peut également aider à déterminer le type approprié de liste de gènes de rang. Pour des ressources supplémentaires sur RNA-Seq, voir les articles suivants 28,29,30.

5. Allogreffe orthotopique de cellules MPNST avec allèles Erbb4 ablés et analyse des effets de l’ablation Erbb4

  1. Avant d’effectuer l’allogreffe orthotopique de cellules MPNST triées, assurez-vous que toutes les procédures sont examinées et approuvées par le Comité de soins et d’utilisation des animaux en établissement, et que toutes les procédures sont effectuées par un personnel dûment formé.
  2. Le jour de l’injection, prélever les cellules à faible passage (environ 85 % de confluence) des plaques ou des flacons de culture cellulaire à l’aide d’une solution de dissociation cellulaire non enzymatique (p. ex., un mélange de chélateurs; voir le Tableau des matériaux) et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Pour les injections orthotopiques dans le nerf sciatique, reconstituer les cellules à 16 667 cellules/mL (50 000 cellules pour 3 μL pour chaque animal) dans DMEM-1031. Gardez les cellules sur la glace.
    REMARQUE: Certaines cultures n’établiront pas avec succès les greffons à moins que les cellules ne soient injectées dans une matrice de membrane basale à faible facteur de croissance. L’exigence d’une matrice de membrane basale (10-50%) doit être déterminée empiriquement.
  3. Évaluer le potentiel de croissance de l’allogreffe in vivo dans les cellules post-infectées en injectant des cellules MPNST dans le nerf sciatique de 8 à 10 souris Hsd: Athymic Nude-Foxn1 anesthésiées par cohorte (âgées de 4 à 8 semaines). Pour l’injection orthotopique de cellules tumorales, se référer à Turk et al31. Ici, une injection sous-cutanée est démontrée.
    REMARQUE: Pour déterminer le nombre d’animaux de laboratoire nécessaires à la signification statistique, consultez un biostatisticien ou il est recommandé d’utiliser G*Power3, un logiciel disponible gratuitement32.
  4. Surveillez les animaux de près deux fois par jour pendant la première semaine après l’injection pour détecter tout signe de douleur. Par la suite, surveillez les souris greffées trois fois par semaine pour les mesures d’étrier et évaluez les scores d’état corporel (BCS) comme décrit précédemment 5,31. Comme indiqué dans les lignes directrices de l’IACUC, euthanasier les animaux avec un BCS de 2 ou moins.
  5. Comme les cellules greffées se développent à des vitesses différentes, déterminez empiriquement les temps de greffon à l’aide de cellules témoins (non modifiées) avant d’effectuer les expériences décrites dans cette section. Pour recueillir les greffons au critère d’évaluation expérimental, euthanasier les souris sans cruauté en utilisant l’inhalation de dioxyde de carbone suivie d’une luxation cervicale comme mesure secondaire. Enregistrez les mesures finales de volume et de masse de chaque greffe.
    NOTE: Comme non modifié P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Les cellules MPNST Erbb4fl / fl atteignent généralement la taille maximale autorisée par l’IACUC dans les 30 à 45 jours, un délai typique est d’environ 30 à 45 jours après l’injection.
  6. Isoler et couper le tissu comme décrit aux étapes 1.6-1.8. Fixez une partie du tissu greffé pendant la nuit dans du paraformaldéhyde à 4 % (Figure 2), puis incorporez-le dans de la paraffine. Préparez des sections de 5 μm à partir du tissu FFPE et montez-les sur des lames. Effectuer une coloration H&E et d’autres immunocolorations nécessaires pour confirmer que le tissu du greffon est composé de cellules tumorales comme décrit au point 1.8.1. Gelez le reste du tissu tumoral pour des analyses en aval, telles que la validation de la perte d’expression d’Erbb4 et l’évaluation des effets de la perte d’Erbb4 sur l’expression d’autres membres de la famille Erbb .
    REMARQUE: La confirmation des cellules tumorales dans le tissu du greffon doit être faite parce que les souris immunodéficientes sont sujettes à développer des néoplasmes. Dans le cas de petits greffons, il est important de s’assurer que le tissu cicatriciel ou l’inflammation n’est pas confondu avec un néoplasme.
    1. Effectuer une coloration IHC standard sur le tissu FFPE pour comparer l’expression des protéines d’intérêt dans les allogreffes cultivées à partir de cellules traitées Ad5CMV-eGFP et Ad5CMV-Cre/eGFP. Colorer le tissu du greffon excisé à l’aide d’anticorps spécifiques à erbB4 pour confirmer les différences d’expression in vivo d’erbB4 entre les deux conditions expérimentales. Déterminer l’indice prolifératif via la coloration Ki67 et le niveau d’apoptose via la coloration dUTP (TUNEL) médiée par la désoxynucléotidyl transférase terminale.
      REMARQUE: Toute cible protéique d’intérêt peut également être évaluée via IHC. Par exemple, évaluer la densité vasculaire en colorant immunocolorant les allogreffes avec un anticorps anti-CD31 (dilution 1:50) pour déterminer les différences in vivo de microenvironnement vasculaire médiées par l’ablation génique. Le nombre de profils vasculaires par champ 40x peut être compté pour la quantification. Pour ces tests à base d’IHC, suivez les protocoles IHC standard pour les procédures de coloration et le protocole du fabricant pour la coloration TUNEL. Pour la quantification des images, utilisez le plug-in ImageJ « comptage automatisé d’images monochromes ».

Résultats

La figure 4 illustre un résultat typique obtenu lors de la transduction de P 0-GGFβ3 ; Trp53-/+; Cellules MPNST Erbb4fl/fl avec l’adénovirus Ad5CMV-eGFP ou l’adénovirus Ad5CMV-Cre/eGFP (Figure 4A). Les cultures sont visualisées par microscopie à fluorescence pour identifier les cellules exprimant l’eGFP et par microscopie à contraste de phase pour déterminer le nombre total de cellules présentes d...

Discussion

Les méthodes détaillées présentées ici ont été développées à l’aide d’un modèle GEM de MPNST. Cependant, si le tissu tumoral d’intérêt peut être dispersé dans des cellules individuelles, ces méthodologies sont facilement adaptables à divers types de tumeurs survenant dans les GEM. Il est important de s’assurer que l’allèle floxé n’entraîne pas i) une diminution de la survie qui peut rendre difficile l’obtention de suffisamment de souris pour dépister les tumeurs, ou ii) une latence tumo...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions de l’Institut national des maladies neurologiques et des accidents vasculaires cérébraux (R01 NS048353, R01 NS109655), du National Cancer Institute (R01 CA122804), du ministère de la Défense (X81XWH-09-1-0086, W81XWH-11-1-0498, W81XWH-12-1-0164, W81XWH-14-1-0073 et W81XWH-15-1-0193) et de la Children’s Tumor Foundation (2014-04-001 et 2015-05-007).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Ad5CMV-eGFPGene Transfer Vector Core, Univ of IowaVVC-U of Iowa-4
Ad5CMVCre-eGFPGene Transfer Vector Core, Univ of IowaVVC-U of Iowa-1174
alexa 568 secondary antibodyThermo/FisherGaR A11036
Bioconductor Open Source Software for BioninformaticsBioconductorhttp://www.bioconductor.orgalternative statistical analysis tool used for step 4.4
CD31Abcamab28364
Celigo Image CytometerNexcelom BioscienceN/A
Cell StripperCorning25-056-Clmixture of chelators
DAB staining kitVector LabsMP-7800
DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery)DAVIDhttps://david.ncifcrf.govfunctional enrichment analysis software used for step 4.5
DMEMCorning15-013-Cl
DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR)Thermo/FisherEP0701 and K1072
erbB4 antibodiesSanta Cruzsc-284
erbB4 antibodiesAbcamab35374
erbB4 antibodiesMilliporeHFR1: 05-1133
FACS SorterBD BiosciencesAria II
ForskolinSigmaF6886
GenomeSpace Tools and Data SourcesGenomeSpacehttps://genomespace.org/support/tools/general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5
GlutamineCorning25-005-Cl
Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion toolGorillaN/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.ilfunctional enrichment analysis software used for step 4.5
GSEA Gene Set Enrichment AnalysisBroad InstituteN/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jspfunctional enrichment analysis software used for step 4.5
HSD: Athymic Nude-FOxn1nu miceEnvigo (Previously Harlan Labs)69
Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer)IlluminaHi Seq 2500DNA sequencer used for step 4.2
Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysisDNAStar LaserGene softwareN/Asoftware statistical and normalization analysis used for step 4.4
Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assemblysoftware alignment used for step 4.3N/Asoftware alignment used for step 4.3
Matrigel, low growth factor basement membrane matrixCorning354230
NRG1-betaIn houseGenerated by SLC, also commercially available from R & D Systems(396-HB-050/CF).
Nuclear Stain Hoeschst 33342Thermo62249
Panther Gene Ontology Classification SystemPantherhttp://pantherdb.orgfunctional enrichment analysis software used for step 4.5
Partek (BWA aligner and analyzer)Partek, Ver 7N/Asoftware alignment and statistical/normalization used for step 4.3
Pen/StrepCorning30-002-Cl
Primer 1: 5′-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT
GTCTG- 3′		Eurofins GenomicsPrimer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product;
Primer 2: 5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC
AGAAGC-3′		Eurofins GenomicsPrimer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product;

Primer 3: 5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA
ACCCAG-3′

Eurofins GenomicsPrimer 1 + 3: 350 bp wild-type ErbB4 product.
Propidium IodineFisher51-351-0
Proteom Profiler Phospho-Kinase ArraysR&D SystemsARY003B
Real time gloPromegaG9712bioluminescent cell viability assay
ToppGene SuiteToppGenehttps://toppgene.cchmc.orgfunctional enrichment analysis software used for step 4.5
Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent)Invitrogen15596026
Tyramide Signal Amplification KitPerkin ElmerNEL721001EA

Références

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