הזרקה נגיפית סטריאוטקסית והשתלת עדשה בעלת אינדקס שיפוע להדמיית סידן עמוקה במוח In Vivo

Summary

הדמיית סידן in vivo של Miniscope in vivo היא טכניקה רבת עוצמה לחקר דינמיקה עצבית ומיקרו-מעגלים בעכברים המתנהגים בחופשיות. פרוטוקול זה מתאר ביצוע ניתוחי מוח להשגת הדמיית סידן in vivo טובה באמצעות מיניסקופ.

Abstract

מיקרוסקופ פלואורסצנטי מיניאטורי (מיניסקופ) הוא כלי רב עוצמה להדמיית סידן in vivo מחיות המתנהגות בחופשיות. הוא מציע מספר יתרונות על פני מערכות הדמיה קונבנציונליות של סידן מרובה פוטונים: (1) קומפקטי; (2) קל משקל; (3) בר השגה; ו-(4) מאפשר הקלטה מבעלי חיים שמתנהגים בחופשיות. פרוטוקול זה מתאר ניתוחי מוח להדמיית סידן in vivo במוח עמוק באמצעות מערכת הקלטה של מיניסקופ שפותחה בהתאמה אישית. הליך ההכנה מורכב משלושה שלבים, כולל (1) הזרקה סטריאוטקסית של הנגיף באזור המוח הרצוי במוח של מוח עכבר כדי לתייג תת-קבוצה מסוימת של נוירונים עם חיישן סידן מקודד גנטית; (2) השתלת עדשת אינדקס גרדיאנט (GRIN) שיכולה להעביר תמונת סידן מאזור מוח עמוק למערכת המיניסקופ; ו-(3) הצמדת מחזיק המיניסקופ מעל גולגולת העכבר, שם ניתן לחבר מיניסקופ מאוחר יותר. כדי לבצע הדמיית סידן in vivo , המיניסקופ מהודק על המחזיק, ותמונות סידן עצבי נאספות יחד עם הקלטות התנהגות סימולטניות. פרוטוקול הניתוח הנוכחי תואם לכל מערכת הדמיה מסחרית או מותאמת אישית של פוטון יחיד ושני פוטונים להדמיית סידן in vivo עמוקה במוח.

Introduction

איתות Ca²⁺ תוך-תאי הוא מווסת חיוני של גדילת תאים, התפשטות, התמיינות, הגירה, שעתוק גנים, הפרשה ואפופטוזיס¹. בתאי עצב, איתות Ca²⁺ נשלט במדויק מכיוון שהתבנית המרחבית-טמפורלית שלו קשורה לתפקודים חיוניים כגון רגישות ממברנה, שחרור נוירוטרנסמיטורים ופלסטיות סינפטית².

הדמיית סידן In vivo היא טכניקה רבת עוצמה שניתן להשתמש בה כדי לפענח ייצוג מעגלים עצביים יסודיים להתנהגויות נורמליות של בעלי חיים, לזהות פעילויות עצביות חריגות במודלים של בעלי חיים של הפרעות מוחיות, ולחשוף מטרות טיפוליות פוטנציאליות שעשויות לנרמל את המעגלים המשתנים האלה. שתי מערכות ההדמיה הנפוצות של סידן in vivo הן מיקרוסקופיה פלואורסצנטית לסריקת לייזר דו-פוטונית ^3,4,5,6 ומיקרואנדוסקופיה ממוזערת (מיניסקופ) המותקנת על הראש 7,8,9,10,11,12,13 . המיקרוסקופיה הקונבנציונלית של שני פוטונים מציעה יתרונות שולטים כגון רזולוציה טובה יותר, רעש נמוך יותר והלבנת תמונות נמוכה יותר; עם זאת, חיות הניסוי נדרשות להיות קבועות ראש, מה שמגביל את מחקרי ההתנהגות שניתן לבצע 3,4,5,6. לעומת זאת, מערכת המיניסקופ המותקנת על הראש היא קטנה וניידת, מה שמאפשר לחקור מגוון רחב של מבחני התנהגות באמצעות בעלי חיים המתנהגים בחופשיות 7,8,9,10,11,12,13.

ישנם שני אינדיקטורים מובילים של Ca²⁺, אינדיקטורים כימיים ^5,14 ואינדיקטורים לסידן מקודדים גנטית (GECIs)^15,16. הדמיית Ca²⁺ התאפשרה על ידי שימוש ב-GECIs רגישים ביותר המועברים עם וקטורים נגיפיים המאפשרים תיוג ספציפי של נוירונים במעגל הממוקד. המאמץ המתמשך לשפר את הרגישות, אריכות הימים והיכולת לתייג אפילו את התאים התת-תאיים, הופך את ה-GECIs לאידיאליים למחקרי הדמיית סידן in vivo שונים 17,18,19.

פיזור האור ברקמת המוח במהלך ההדמיה מגביל את החדירה האופטית לעומק, אפילו עם המיקרוסקופיה הדו-פוטונית. עם זאת, עדשת ה-Gradient Index (GRIN) מתגברת על בעיה זו מכיוון שעדשת ה-GRIN יכולה להיות מוטמעת ישירות ברקמות הביולוגיות ולהעביר תמונות מאזור המוח העמוק אל מטרת המיקרוסקופ. בניגוד לעדשה קונבנציונלית העשויה מחומר הומוגני אופטי ודורשת משטח בעל צורה מסובכת כדי להתמקד וליצור תמונות, ביצועי עדשת GRIN מבוססים על שינוי הדרגתי במקדם השבירה בתוך חומר העדשה שמשיג מיקוד עם משטח מישור²⁰. ניתן לייצר עדשת GRIN עד לקוטר של 0.2 מ"מ. לכן, עדשת GRIN ממוזערת יכולה להיות מושתלת במוח העמוק מבלי לגרום נזק רב מדי.

במאמר זה, פרוטוקול ניתוח מלא מוצג עבור המוח העמוק in vivo סידן הדמיה. לצורך ההדגמה, אנו מתארים ניתוחי מוח המכוונים באופן ספציפי לקליפת המוח הקדם-מצחית המדיאלית (mPFC) של מוח העכבר והקלטת הדמיית סידן in vivo באמצעות מערכת מיניסקופים שנבנתה בהתאמה אישית שפותחה על ידי קבוצתו של ד"ר לין במכון הלאומי לשימוש בסמים (NIDA/IRP)^7,12. ההליך הניסיוני כולל שני ניתוחי מוח גדולים. הניתוח הראשון הוא הזרקה סטריאוטקסית של וקטור ויראלי המבטא GCaMP6f (GECI) ב-mPFC. הניתוח השני הוא להשתיל את עדשת ה-GRIN באותו אזור במוח. לאחר ההחלמה מניתוחי מוח אלה, ההליך הבא הוא להצמיד את מחזיק המיניסקופ (בסיס) על גולגולת העכבר באמצעות מלט דנטלי. In vivo ניתן לבצע הדמיה Ca²⁺ בכל עת לאחר הרכבת המיניסקופ על בסיסו. פרוטוקול הניתוח להזרקה ויראלית והשתלת עדשות GRIN תואם לכל מערכת הדמיה מסחרית או מותאמת אישית של פוטון יחיד ושני פוטונים עבור הדמיית הסידן in vivo במוח העמוק.

Protocol

הפרוטוקול הניסויי תואם את הנחיות הטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת ויומינג. העכבר שבו נעשה שימוש במחקר זה הוא זכר בן 6 חודשים C57BL/6J. ניתן להשתמש בהליך כדי להתמקד בכל אזורי המוח העמוקים להדמיית סידן in vivo . כאן, להדגמה, אזור המוח הממוקד הוא mPFC העכבר (קדמי ואחורי (A/P): 1.94 מ"מ, מדיאלי ורוחבי (M/L): 0.5 מ"מ, גב וגחון (D/V): 1.8 מ"מ). פרוטוקול זה משתנה בהתבסס על פרוטוקול²¹ שפורסם בעבר.

1. הזרקה סטריאוטקסית של נגיף ב-mPFC (איור 1)

1. הכנה לניתוח
   1. לעקר את כל כלי הניתוח באמצעות אוטוקלאב ולהניח אותם על משטח סטרילי.
   2. הכינו מזרק של 10 μL על ידי החדרתו עם מלח ומילוי מראש ב-5 μL של מלח. הצמידו את המזרק למיקרו-פומפה (ראו טבלת חומרים).
   3. הפעילו את משטח החימום ושמרו על הטמפרטורה ב-35 מעלות צלזיוס.
2. מקם את העכבר בתא האינדוקציה (5 אינץ' x 10 אינץ' x 4 אינץ', אורך x רוחב x גובה) עם 5% איזופלורן וקצב זרימת חמצן של 1 ליטר לדקה. שימו לב היטב וספרו את קצב הנשימה של העכבר. מוציאים את העכבר ברגע שקצב הנשימה שלו יורד ל-1 נשימה/שנייה.
   הערה: ניתן לנטר בקלות את קצב הנשימה של העכבר על ידי צפייה בתנועת שרירי הגב כלפי מטה וכלפי מעלה במהלך כל שאיפה.
3. אפשרו לעכבר להתיישב על אזור ספסל המופרד מהאזור הכירורגי. עם קוצץ גילוח, לגלח את השיער מראש העכבר עד החוליות הצוואריות הראשונות.
4. הניחו את העכבר על הבמה הסטריאוטקסית (ראו טבלת חומרים) והבטיחו את מיקומו באמצעות מוטות אוזניים ותופס אף. שמור על זרימת האיזופלורן לשלב הסטריאוטקסי בקצב זרימת החמצן של 1.5% ו-0.5 ליטר לדקה של זרימת חמצן.
5. יש למרוח את משחת העיניים האופטלמית המשמן על שתי העיניים עם צמר גפן נקייה כדי למנוע יובש בעיניים במהלך הניתוח. הערך רפלקסים של דוושות בעכבר כדי לאשר שהעכבר מורדם לחלוטין לפני תחילת הניתוח.
6. יש לחטא את האזור חסר השיער בתמיסת פובידון-יוד של 7.5% (ראו טבלת חומרים) ו-70% אתנול שלוש פעמים כל אחת באמצעות צמר גפן סטרילי.
7. הזריקו נפח קטן (50 μL) של 2% לידוקאין מתחת לעור של האזור חסר השיער.
8. בצע חתך של 2 ס"מ דרך העור לאורך קו האמצע באמצעות אזמל כדי לחשוף את למבדה ואת bregma של הגולגולת.
9. הסר את החיתולית מהגולגולת בעזרת צמר גפן יבשה ומלקחיים מחודדים.
10. לאחר שהברגמא והמבדה גלויים לעין, השתמשו בקצה של בור מקדחה דנטלי (בקוטר 0.5 מ"מ) כדי למדוד את קואורדינטות Z של bregma ו-lambda (ראו טבלת חומרים). התאם את גובה מחזיק האף עד שהברגמה והמבדה ישכבו באותה תנוחת Z.
11. אתר את בור המקדחה הדנטלית בקוטר 0.5 מ"מ למצב של A/P: 1.94 מ"מ, M/L: 0.5 מ"מ מהברגמה. קודחים דרך הגולגולת.
    הערה: כאן, להדגמה, אזור המוח הממוקד הוא mPFC העכבר. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להתמקד בכל אזור מוח עמוק אחר. לדוגמה, אם אזור המוח הממוקד הוא גרעין אקומבנס (NAc), המיקום המתאים צריך להיות A/P: 0.9 מ"מ, M/L: 1.2 מ"מ.
12. הסירו את הדורה בעזרת קצה מחט של 30 גרם ונקו את כל פיסות פסולת העצם באמצעות מלקחיים חדים בעלי זווית של 45°.
    הערה: דימום נפוץ מכיוון שכלי דם קטנים עלולים להיקרע במהלך שלב הניקוי. השתמשו במטושים מכותנה סטרילית כדי לעצור את הדימום והחלו מלוחים כדי לשטוף את האזור. יש למרוח מלח על אזור הגולגולת החשוף כדי לשמור עליו לח.
13. טען את הנגיף לתוך מזרק המיקרוליטר באמצעות לוח הבקרה של המיקרו-פומפה. למשוך 500 nL של בועת אוויר ואחריו 800 nL של הנגיף בקצב זרימה של 50 nL/s.
    הערה: לצורך ההדגמה, כאן, וירוס הקשור לאדנו סרוטיפ 1 (AAV1) המבטא GCaMP6f (GECI), AAV1-CamKII-GCamp6f, מוזרק ל- mPFC (ראה טבלת חומרים). הטיטר של הנגיף הוא 2.8 x 10¹³ GC/mL. השעה 1:2 מדוללת במי מלח לפני ההזרקה.
14. הניחו את קצה המחט בחלק העליון של הברגמא רק כדי לגעת בברגמה וציינו את קואורדינטת Z של ברגמא. הזז את המחט מעל החור שנקדח והזריק 100 nL של הנגיף כדי להבטיח שהמחט לא תהיה סתומה.
15. הזיזו באיטיות את המחט לתוך רקמת המוח אל קואורדינטת Z ממוקדת של D/V: 1.75 מ"מ ואז הזיזו אותה מעט עד לקואורדינטת Z של D/V: 1.65 מ"מ.
    הערה: זה כדי ליצור כיס קטן עבור הפתרון הוויראלי להיות חדור. אם אזור המוח הממוקד הוא ה-NAc, קואורדינטת ה-Z הממוקדת המתאימה של D/V צריכה להיות 4.2 מ"מ, ולאחר מכן לנוע מעט עד 4.1 מ"מ.
16. השתמש בלוח הבקרה כדי להגדיר את המיקרו-פומפה להזרקת 500 nL של הנגיף בקצב זרימה של 50 nL/min. לחץ על כפתור RUN בלוח הבקרה כדי להזריק את הנגיף.
    הערה: ההזרקה תימשך כ-10 דקות. לאחר סיום ההזרקה, יש להמתין 5-10 דקות נוספות לפני שתוציאו את המחט מהמוח. יש למרוח לעתים קרובות מלח כדי לשמור על אזור הגולגולת החשוף לח במהלך תקופת ההזרקה.
17. הזיזו את המחט למעלה והחוצה מהמוח. הזריקו נפח של 500 nL פעמיים בקצב זרימה של 50 nL/s.
    הערה: שלב זה מאשר כי נפח תקין של הנגיף ניתן לתוך המוח. במהלך 500 זריקות nL הראשונות, הנגיף משתחרר, ואחריו בועות אוויר. במהלך ההזרקה השנייה של 500 nL, בועות אוויר מופיעות לראשונה, ואחריהן מי מלח. המזרק מוכן כעת לטעון את הווירוס עבור העכבר הבא. לאחר סיום הניתוח, מזרק המיקרוליטר והמחט מנוקים ביסודיות עם אצטון ואחריו מלח.
18. מסדרים את קצוות העור וסוגרים בזהירות את החתך עם תפר (מידה 4.0). יש למרוח משחה אנטיביוטית על האזור התפור כדי למנוע זיהום.
19. הסר את העכבר מהבמה הסטריאוטקסית והחזיר אותו לכלוב הביתי שלו. מניחים את הכלוב הביתי באינקובטור של 33 מעלות צלזיוס עד שהעכבר אמבולטורי.
    הערה: בדרך כלל לוקח לעכבר 10-15 דקות להתעורר מהרדמה איזופלורנית לפני שהוא מתחיל לנוע.
20. לאחר שהעכבר מתחיל לנוע, תנו תרופות נוגדות דלקת לא סטרואידליות במשך 3 ימים לאחר הניתוח (ראו טבלת חומרים). תנו לעכבר להתאושש מהניתוח במשך 14 יום לפני שתמשיך בהשתלת עדשת GRIN.

2. השתלת עדשת GRIN ב-mPFC (איור 1)

1. הכנה לניתוח
   1. הכן את הנוזל השדרתי המלאכותי (ACSF) המכיל 124 mM של NaCl, 2.5 mM של KCl, 1.25 mM של NaH₂PO₄, 1.2 mM של MgCl₂, 25 mM של גלוקוז, 26 mM של NaHCO₃ ו 2.4 mM של CaCl₂.
   2. לעקר את כל כלי הניתוח באמצעות אוטוקלאב ולהניח אותם על משטח סטרילי.
   3. הפעילו את משטח החימום ושמרו על הטמפרטורה ב-35 מעלות צלזיוס.
   4. ממיסים 1% אגרוז ושומרים אותו באמבט מים בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
      הערה: ניתן לשמור את האגרוז המומס באמבט המים במשך כמה שעות.
   5. יש לחטא עדשת GRIN (בקוטר של 1 מ"מ, באורך של 4.38 מ"מ, איור 2A) ב-70% אתנול למשך 15 דקות, ולהעביר אותה לצינור מלא במי מלח כדי לשטוף אותה כראוי לפני ההשתלה.
      הערה: עדשות GRIN (ראו טבלת חומרים) מיוצרות באמצעות חילופי כסף וליתיום-יון במשקפיים מיוחדים, מה שהופך אותן ללא רעילות וידידותיות לנוירונים ^6,7. עם זאת, עדשות GRIN רבות הזמינות באופן מסחרי עלולות לזלוג לשאריות רעילות, ולגרום לניוון עצבי, מה שהופך אותן לבלתי מתאימות להשתלה במוח החי למחקרי הדמיה in vivo ארוכי טווח. עדשות GRIN אלה עשויות לדרוש ציפוי עם חומרים תואמים ביולוגית כמו פארילן-C כדי למנוע תופעות לוואי רעילות על נוירונים שכנים²².
2. שוקלים את העכבר ומרדימים אותו על ידי הזרקה תוך-צפקית של תערובת קטמין/קסילאזין (ראו טבלת חומרים) (קטמין:100 מ"ג/ק"ג; קסילאזין: 15 מ"ג/ק"ג).
   הערה: עכבר במשקל 30 גרם דורש 300 μL של תערובת קטמין/קסילאזין (קטמין 100 מ"ג/מ"ל וקסילאזין 1.5 מ"ג/מ"ל) עבור המינון הראשוני ו-150 μL של קטמין (10 מ"ג/מ"ל) למינונים נוספים במהלך הניתוח. כדי לשמור על העכבר נשאר מורדם במהלך כל התהליך הכירורגי, יש לתת מינונים נוספים של קטמין (50 מ"ג/ק"ג) לפחות פעם בשעה. שלב ההרדמה של העכבר צריך להיות מנוטר לעתים קרובות על ידי הערכת רפלקסים של דוושות.
3. לגלח את השיער מהאזור הכירורגי באמצעות מכונת גילוח ולנקות את השיער באמצעות מגבת נייר רטובה.
4. הניחו את העכבר בשלב הסטריאוטקסי והבטיחו את מיקומו על ידי הידוק קליפס האף ומוטות האוזניים. יש למרוח משחת עיניים משומן על שתי העיניים עם מטוש כותנה סטרילי. ודא שהעכבר מורדם באופן מלא על ידי הערכת רפלקסים של דוושות.
5. יש לחטא את האזור חסר השיער בתמיסה של 7.5% פובידון-יוד ו-70% אתנול שלוש פעמים כל אחת באמצעות צמר גפן סטרילי. נהלו 2 מ"ג/ק"ג של דקסמתזון תוך שרירי בירך כדי להפחית את הסיכון לנפיחות ודלקת הקשורות לניתוח.
6. הזריקו 50 μL של 2% לידוקאין מתחת לעור של אזור הניתוח.
7. השתמשו במספריים עדינים כדי לבלום אזור עור משולש בגודל 1.5 ס"מ (גובה) x 1.0 ס"מ (בסיס), מהצד הקדמי בין העיניים לצד האחורי שמאחורי הלמבדה.
8. הסר את רקמת הפריוסטאום מהגולגולת באמצעות מלקחיים עדינים, מיקרו-להב ומטושים מכותנה.
   הערה: יש לנקות ולייבש את הגולגולת ביסודיות לפני ביצוע הצעד הבא.
9. יש למרוח ציאנואקרילט (ראו טבלת חומרים) על שולי העור ולהצמיד את העור לגולגולת. יש להמתין 5 דקות עד שהציאנואקרילט יתייבש.
10. בעזרת קצה בור מקדחה בקוטר 0.5 מ"מ, יישרו את הברגמה והמבדה באותו מישור אופקי על ידי התאמת גובה קליפס האף.
11. אתרו בור מקדחה דנטלי (בקוטר 1.2 מ"מ) למיקום של A/P: 1.94 מ"מ, M/L: 0.8 מ"מ מהברגמה. קודחים דרך הגולגולת. הסירו את הדורה בעזרת קצה מחט של 30 גרם ונקו את כל פיסות פסולת העצם באמצעות מלקחיים חדים בעלי זווית של 45°.
    הערה: פסולת עצם זו יכולה לחסום את שלב השאיפה הבא אם לא תוסר לחלוטין.
12. חברו מחט בעלת קצה קהה מלוטש ידנית של 27 גרם (איור 2B) למחזיק המחט, המחוברת לזרוע רובוטית מוטה בזווית של 10° (איור 2C). חברו את הקצה השני של מחזיק המחט למערכת הוואקום הביתית.
    הערה: הזרוע הרובוטית (ראו טבלת חומרים) פותחה על ידי קבוצתו של ד"ר לין ב-NIDA/IRP ונשלטת על ידי תוכנה שפותחה בהתאמה אישית, כיום בגישה פתוחה, AutoStereota (https://github.com/liang-bo/AutoStereota)²³
13. אתרו את קצה המחט רק כדי לגעת בברגמא. הגדר את קואורדינטת Z של bregma ל- 0 על ידי לחיצה על לחצן Bregma ב- AutoStereota.
14. הגדר את ערך הקלט X ל- 0.8, ערך הקלט Y ל- 1.94, ערך הקלט Z ל- 1.0 ולאחר מכן לחץ על לחצן חיפוש כדי להעביר את המחט לחלק העליון של החור שנקדח בגולגולת.
15. התאם את מיקום המחט למרכז אזור רקמת המוח החשופה באמצעות AutoStereota.
    הערה: כדי להזיז את המחט לכיוונים רוחביים או מדיאליים, הזן את הערך שלב ולחץ על הלחצנים Lateral או Medial ב- AutoStereota. באופן דומה, כדי להזיז את המחט בכיוונים קדמיים או אחוריים וגבריים או גחוניים, לחץ על כפתורי Rostral או Caudal ו- Dorsal או Ventral, בהתאמה.
16. הפעילו את הוואקום והתחילו לשטוף את אזור המוח החשוף באמצעות ACSF דרך מערכת צינורות מבוקרת כבידה (ראו טבלת חומרים) המחוברת למחט של 30 גרם עם קצה כפוף. ACSF מבעבע באופן רציף עם תערובת גזים של 95% O₂ ו-5% CO₂ ומסונן דרך מסנן של 0.2 מיקרומטר.
    הערה: קצב זרימת ACSF הוא ~ 1.5 מ"ל לדקה. לחץ הפלט של תערובת הגז נשמר על ~ 3 psi.
17. לשאוף רקמת המוח שכבה אחר שכבה בעזרת תוכנת AutoStereota (תרשים 3).
    הערה: שאיפת רקמת המוח הושלמה ב -4 סיבובים כך שנוצר כיס עמודה (1.8 מ"מ עומק וקוטר 1 מ"מ).
    1. בהפעלה "zStep", לחץ ובדוק את השורה הראשונה והשנייה. הגדר את הערכים עבור השורה הראשונה ל- 0.2 ו- 1. הגדר את הערכים עבור השורה השנייה ל- 0.15 ו- 4 (איור 3A).
    2. בהפעלה "מצב", הגדר את גודל המחט 27 מד ו- 1.2, הגדר את Dims 0.9. כל הערכים האחרים משתמשים בערכי ברירת מחדל (איור 3A).
    3. לחץ ברצף על הלחצנים 'הגדר', 'שמור אפס' ו'התחל' כדי להתחיל את השאיפה.
       הערה: זהו סיבוב 1^st של שאיפה. ערכי קלט מצביעים על כך שעומק השאיפה הוא 0.2 מ"מ (מקואורדינטת Z של 0) במהלך הצעד הראשון עם שכבה אחת; במהלך השלב השני, עומק השאיפה הוא 0.15 מ"מ, חוזר על עצמו ללא הרף במשך 4 שכבות. רזולוציית השאיפה היא 1.2, והקוטר הוא 0.9 מ"מ. במהלך השאיפה, ניתן לעקוב אחר המיקום המיידי של קצה המחט באמצעות לוח גרף המסלול. לאחר השלמת סיבוב שאיפה זה, נוצר כיס עמוד עם עומק 0.8 מ"מ וקוטר 1 מ"מ. קצה המחט יחזור למרכז עם קואורדינטת Z של 0.
    4. בהפעלה "zStep", לחץ ובדוק את השורה הראשונה והשנייה. הגדר את הערכים עבור השורה הראשונה ל- 1 ו- 1. הגדר את הערכים עבור השורה השנייה ל- 0.15 ו- 4 (איור 3B).
    5. בהפעלה "מצב", שמרו על כל הערכים זהים לסיבוב הקודם (איור 3B).
    6. לחץ ברצף על הלחצנים 'הגדר', 'שמור אפס' ו'התחל' כדי להתחיל את השאיפה.
       הערה: זהו הסיבוב^השני של השאיפה. ערכי קלט מצביעים על כך שעומק השאיפה הוא 1 מ"מ (מקואורדינטת Z של 0) במהלך הצעד הראשון עם שכבה אחת; במהלך השלב השני, עומק השאיפה הוא 0.15 מ"מ, חוזר על עצמו ללא הרף במשך 4 שכבות. לאחר השלמת סיבוב שאיפה זה, נוצר כיס העמוד עם עומק 1.6 מ"מ וקוטר 1 מ"מ.
    7. בהפעלה "zStep", לחץ ובדוק את השורה הראשונה בלבד. הגדר את הערכים עבור השורה הראשונה ל- 1.8 ו- 1 (איור 3C).
    8. בהפעלה "מצב", הגדר גודל מחט 27 מד ו- 2.2. כל שאר הערכים נשארים זהים לאלה של הסיבוב הקודם (איור 3C).
    9. לחץ ברצף על הלחצנים 'הגדר', 'שמור אפס' ו'התחל' כדי להתחיל את השאיפה.
       הערה: זהו הסיבוב^השלישי של השאיפה. ערכי קלט מצביעים על כך שעומק השאיפה הוא 1.8 מ"מ (מקואורדינטת Z של 0) עם שכבה אחת. החלטת השאיפה היא 2.2. לאחר השלמת סיבוב שאיפה זה, נוצר כיס העמוד עם עומק 1.8 מ"מ וקוטר 1 מ"מ.
    10. בהפעלה "zStep", לחץ ובדוק את השורה הראשונה בלבד. הגדר את הערכים עבור השורה הראשונה ל- 1.6 ו- 1 (איור 3D).
    11. בהפעלה "מצב", הגדר את גודל המחט 27 מד ו- 2.2, הגדר את Dims 0.6 (איור 3D).
    12. לחץ ברצף על הלחצנים 'הגדר', 'שמור אפס ' ו'התחל ', כדי להתחיל את השאיפה.
        הערה: זהו הסיבוב^הרביעי של השאיפה. מטרת שלב זה היא לנקות את הדם שנצבר בכיס. דימום נפוץ כאשר כלי דם קטנים נקרעים במהלך תהליך השאיפה. כדי לנקות ביסודיות את הדם, להפסיק את ההשקיה של ACSF במשך 5 דקות ולאחר מכן להפעיל שוב את ההשקיה. חזור על הסיבוב^הרביעי של השאיפה מספר פעמים עד שהכיס נקי מדם. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי להתמקד באזורים אחרים במוח העמוק. לדוגמה, אם אזור המוח הממוקד הוא ה-NAc, קואורדינטת ה-Z המתאימה הסופית של D/V צריכה להיות 4.4 מ"מ.
18. עצור את הוואקום וההשקיה של ACSF. הביאו את המחט ל+2 מ"מ קואורדינטות Z ו-0.5 מ"מ קדמיות למרכז. מכניסים את עדשת ה-GRIN הסטרילית בקוטר 1 מ"מ לכיס.
19. שמרו על קצה המחט במגע עם עדשת ה-GRIN החשופה כדי להבטיח שעדשת ה-GRIN תתמקם בזווית של 10°. לחץ בעדינות על המשטח העליון של עדשת GRIN עם נייר טישו רך סטרילי כדי להבטיח שהמשטח התחתון של עדשת GRIN נמצא במגע עם רקמת המוח.
20. יש למרוח את האגרוז המומס במרווח שבין עדשת ה-GRIN לרקמת המוח בעזרת מרית. לאחר שאגרוז יוצר ג'ל, הסר עודף אגרוז באמצעות מיקרו-להב.
21. נקו את הגולגולת ביסודיות עם מלחים ומטושים מכותנה. אפשרו לגולגולת להתייבש לפני היישום הבא של המלט הדנטלי (ראו טבלת חומרים).
22. הוציאו את הערבוב היטב ממקפיא של -20 מעלות צלזיוס. מערבבים את אבקת המלט הדנטלית ואת נוזל הזרז ומניחים שכבה של מלט שרף דבק מרפא את עצמו על הגולגולת; ראשית, הקף את עדשת GRIN ולאחר מכן כיסה את כל הגולגולת החשופה.
23. המתן 5 דקות ותן לו להתקשות לחלוטין. הסר את מחט השאיפה בזהירות.
24. בבאר פלסטיק נקייה, מערבבים אבקת מלט דנטלית, פחם שחור עם נוזל, ומורחים שכבה דקה של התערובת על גבי השכבה הראשונה של המלט הדנטלי. חכו 5 דקות כדי לתת לו להתקשות.
25. הגן על עדשת ה-GRIN החשופה על-ידי כיסויה בפקק מותאם אישית העשוי מצינור PCR (איור 2D). יש למרוח ציאנואקרילט כדי לחבר את המכסה למלט הדנטלי.
26. הזריקו 1 מ"ל של מלח תת-עורי מוכן מראש לעכבר ואחריו 0.1 מ"ג/ק"ג של בופרנורפין. הניחו את העכבר בחזרה בכלוב הביתי שלו. מניחים את הכלוב הביתי באינקובטור של 33 מעלות צלזיוס ומנטרים את העכבר עד שהוא אמבולטורי. בדרך כלל לוקח לעכבר 20-40 דקות להתעורר מהרדמה לפני שהוא מתחיל לנוע.
27. מתן תרופות נוגדות דלקת לא סטרואידליות ועקוב אחר העכבר במשך 3 ימים לפחות לאחר הניתוח. תן לעכבר להתאושש מהניתוח במשך 30 יום.

3. הצמדת מחזיק מיניסקופ (בסיס) לגולגולת העכבר (איור 1)

1. מרדימים את העכבר בתא אינדוקציה עם 5% איזופלורן וקצב זרימת חמצן של 1 ליטר/דקה עד שקצב הנשימה שלו יורד לנשימה אחת לשנייה.
2. הניחו את העכבר בשלב הסטריאוטקסי והבטיחו את מיקומו באמצעות מוטות אוזניים ותפסני אף. שמרו על זרימה רציפה של איזופלורן (1.5%) וחמצן (0.5 ליטר לדקה).
3. יש למרוח משחה אופטלמית על עיניה כדי לשמור על לחותן. הפעילו את משטח החימום ושמרו על הטמפרטורה ב-35 מעלות צלזיוס. ודא שהעכבר מורדם באופן מלא על ידי הערכת רפלקסים של דוושות.
4. הסר את המכסה המכסה את עדשת GRIN בעדינות באמצעות מלקחיים מחודדים. קדחו את שאריות הציאנואקרילט המיובשות מהמלט הדנטלי באמצעות מיקרודריל (ראו טבלת חומרים).
5. חותכים את השיער סביב אזור הבטון הדנטלי עם מספריים קטנים. נקו את הפסולת בעזרת אבק אוויר דחוס. השתמשו במטוש כותנה טבול באצטון כדי לנקות את המשטח העליון של עדשת GRIN.
6. הכן את המיניסקופ עם המחזיק שלו (בסיס).
   1. הניחו אום מס' 00-90 הקסדצימלי (ראו טבלת חומרים) בחריץ הקיים בבסיס והחלו ציאנואקרילט כדי לאבטח אותו שם (איור 2E).
   2. מרחו סרט פוליאתילטרפלואורואתילן (PTFE) בחוזקה סביב חוט המיניסקופ וגזרו את הקלטת הנוספת (איור 2F).
   3. הדקו את המיניסקופ לבסיס והשתמשו בבורג הנעילה כדי להדק את המיניסקופ לבסיס (איור 2G).
   4. חבר את המיניסקופ לכבל שלו והפעל את התוכנה שפותחה בהתאמה אישית, הנמצאת כעת בגישה פתוחה, NeuView (ראה טבלת חומרים).
      הערה: תוכנת NeuView פותחה בהתאמה אישית להדמיית סידן in vivo של מיניסקופ מקבוצתו של ד"ר לין ב-NIDA/IRP ^7,12. זוהי גישה פתוחה (https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0).
   5. ב-NeuView, לחץ על חומרה, בדוק את LED1 ולחץ על לחצן הזרם כדי להציג את התמונות החיות (איור 4A). כדי להפסיק את ההזרמה בשידור חי, לחץ על עצור כפתור.
   6. הניחו את המיניסקופ בזרוע אוחזת במיניסקופ שנבנה בהתאמה אישית (איור 2H) שאת מיקום ה-XYZ שלה ניתן לתמרן באמצעות בקרים ממונעים (איור 2I).
7. אתרו את המיניסקופ ממש מעל עדשת ה-GRIN החשופה והפכו אותו למקביל לפני השטח של העדשה. הורידו באיטיות את המיניסקופ לכיוון עדשת ה-GRIN והתאימו את מיקום ה-Z שלו עד שיימצא מישור המיקוד הטוב ביותר.
   הערה: מישור המוקד הטוב ביותר נקבע על ידי השוואת מספר מיקומי Z אפשריים ובחירת מישור המוקד עם הדמיה ברורה של רוב גופי התא.
8. יש למרוח בזהירות את השכבה הראשונה של מלט דנטלי סביב בסיס המיניסקופ מבלי לשנות את מיקום המיניסקופ. לאחר הקשחת המלט, הסר בעדינות את הזרוע המחזיקה כך שהמיניסקופ יוכל לעמוד בפני עצמו על ראש העכבר.
   הערה: המלט הדנטלי נוטה להתכווץ לאחר ההתקשות, והוא יגרור את המיניסקופ מטה הרחק ממישור המיקוד המקורי. בדרך כלל מיקום המיניסקופ Z מורם מעט מעל מישור המוקד המקורי לפני מריחת מלט דנטלי כדי לפצות על השינוי הפוטנציאלי.
9. יש למרוח שכבה שנייה של מלט דנטלי סביב הבסיס כדי למלא את כל הפערים ולוודא שאין דליפת נורת LED מהמרווחים. תנו למלט הדנטלי להתקשות.
10. הסר את העכבר מהשלב הסטריאוטקסי. שחררו את בורג הנעילה ונתקו את המיניסקופ מהבסיס. הכניסו לבסיס מכסה מגן מודפס בתלת-ממד כדי להגן על עדשת ה-GRIN החשופה והידקו את בורג הנעילה בבסיס (איור 2J).
11. הניחו את העכבר בחזרה בכלוב הביתי שלו.
    הערה: בדרך כלל לוקח לעכבר 10-15 דקות להתעורר מהרדמה איזופלורנית לפני שהוא מתחיל לנוע.

4. הרכבה של מיניסקופ והדמיית in vivo Ca²⁺ (איור 1)

1. הרכיבו את המיניסקופ לבסיסו
   1. מרדימים את העכבר לזמן קצר בתא האינדוקציה (5% איזופלורן וקצב זרימת חמצן של 1 ליטר/דקה). הניחו את העכבר על משטח ספסל נקי.
   2. שחררו את בורג הנעילה באמצעות מברג קטן, הסירו את מכסה המגן ונקו את פני השטח של עדשת ה-GRIN בעזרת צמר גפן ספוגת אצטון.
   3. עוטפים סרט PTFE בחוזקה סביב חוט המיניסקופ ומהדקים את המיניסקופ לבסיסו על ראש העכבר.
   4. חברו את המיניסקופ לכבל (איור 2K), הפעילו את תוכנת NeuView.
   5. ב-NeuView, לחץ על חומרה, בדוק את LED1 ולחץ על לחצן הזרם כדי להציג את התמונות החיות (איור 4A).
   6. זהה את מישור המוקד הטוב ביותר על ידי התאמת מיקום המיניסקופ ביחס לבסיס, או הידוק קל או התרופפות בעזרת מלקחיים קהים.
      הערה: מישור המוקד הטוב ביותר נקבע על ידי השוואת מספר מיקומים אפשריים ובחירת אחד עם הדמיה ברורה של רוב גופי התא.
   7. הידקו את בורג הנעילה והחזירו את העכבר לכלוב הביתי שלו.
   8. ב-NeuView, התאימו את עוצמת תאורת ה-LED לרמה האופטימלית. לחץ על לכידה ולאחר מכן הפעל לחצנים כדי להתחיל להקליט ולחץ על עצור לאחר 150 פריימים.
      הערה: ההספק הנמוך ביותר האפשרי קובע את הרמה האופטימלית של עוצמת ה-LED להשגת תמונה בהירה מספיק. מטרת הקלטת סרטון קצר היא להקל על זיהוי אותו מישור מוקד בעתיד להדמיה חוזרת ונשנית.
   9. נתק את הכבל מהמיניסקופ. תן לעכבר להתאושש לפחות 30 דקות לפני תחילת הניסוי.
      הערה: כדי להגן על המיניסקופ, בדרך כלל, בקבוק המים ומזין המזון חוט מוסרים במהלך פרק זמן קצר זה. אם העכבר צריך להישאר בכלוב הביתי שלו זמן רב יותר, מומלץ לספק ג'ל תזונה זמין מסחרית (ראו טבלת חומרים) בכלוב הביתי.
2. איסוף נתונים להדמיית סידן in vivo
   הערה: הדמיית סידן In vivo יכולה להתבצע בו זמנית יחד עם כל בדיקות ההתנהגות שהחוקר חפץ בהן. לצורך ההדגמה, הדוגמה כאן היא הדמיית in vivo Ca²⁺ במהלך בדיקת שדה פתוח. כדי להשיג מטרה זו, נדרשים שני מחשבים. מחשב אחד מצויד בתוכנה מסחרית (ראה טבלת חומרים) כדי לשלוט במצלמה כדי לתעד התנהגות עכבר באופן אוטומטי. המחשב השני מצויד ב- NeuView כדי לשלוט במיניסקופ ולהקליט את תמונות Ca²⁺ .
   1. הפעל את תוכנת מצלמת ההתנהגות (ראה טבלת חומרים) כדי להציג את זירת התנהגות העכבר באמצעות פונקציית שידור חי. כוונו באופן ידני את המיקוד של המצלמה העליונה (איור 2L).
   2. בחר טריגר/סטרוב ובדוק "הפעל/השבת את ההדק" (איור 4B). לחץ על הקלט כפתור, השתמש בעיון כדי לבחור את המיקום שבו יישמרו הקלטות התנהגות, בחר את תבנית התמונה הרצויה.
      הערה: הפונקציה "בקרת טריגר" מופעלת כדי לאפשר הפעלת הקלטת ההתנהגות על-ידי תוכנת NeuView, כך שמסגרות ההתנהגות ומסגרות הדמיית הסידן המתאימות יצורמדו זו לזו באופן זמני. ניתן לשמור את הקלטת אופן הפעולה בכל פורמט רצוי. הקלטת אופן הפעולה נשמרת בדרך כלל בתבנית JPEG בתיקיה המיועדת.
   3. קירבו את העכבר לזירה וחברו את המיניסקופ לכבל המקושר למערכת איסוף הנתונים (איור 2L) (ראו טבלת חומרים). העכבר ממוקם לאחר מכן במרכז הזירה.
   4. עם פונקציית ההזרמה החיה של תוכנת NeuView, התאם את עוצמת ה-LED כדי למטב את הבהירות של תמונת הסידן.
      הערה: עבור הדמיית סידן, קצב הפריימים של ההקלטה הוא 10 פריימים לשנייה כברירת מחדל.
   5. ב- NeuView, בטל את הסימון של LED1, לחץ על לכידה ולאחר מכן הפעל את הלחצנים כדי להתחיל להקליט, ולחץ על עצור לאחר 100 פריימים.
      הערה: זה כדי להקליט תמונות רקע במשך כ-100 פריימים עם תאורת LED כבויה.
   6. בתוכנת מצלמת ההתנהגות, לחץ על התחל הקלטה (איור 4C). ב- NeuView, בדוק את LED1, לחץ על לכידה ולאחר מכן הפעל את הלחצנים כדי להתחיל להקליט. לחץ על עצור אחרי 3000 פריימים.
      הערה: זה כדי לתעד הדמיה והתנהגות של סידן בו זמנית. המבחן בשטח פתוח הוא באורך של 15 דקות, ובדרך כלל מחולק לשלושה מפגשי הקלטה כל אחד של 5 דקות. זאת כדי למנוע מהמיניסקופ להתחמם יתר על המידה עקב שימוש מתמשך.
   7. שמור גם את הדמיית הסידן וגם את הקלטות ההתנהגות בתיקיות המיועדות. חזור על ההקלטה לשני סשנים נוספים תוך כדי הקלטת הרקע לפני כל הפעלה ושמור את כל ההקלטות בתיקיה המיועדת.
3. נתקו את המיניסקופ מבסיסו.
   1. לאחר השלמת ההקלטה, נתקו את הכבל מהמיניסקופ.
   2. מרדימים את העכבר לזמן קצר בתא האינדוקציה (5% איזופלורן ו-1 ליטר/דקה של קצב זרימת חמצן). הניחו את העכבר על משטח נקי וחם.
4. פתחו את בורג הנעילה בבסיס ונתקו את המיניסקופ מהבסיס. החזירו את מכסה המגן מעל הבסיס והידקו את בורג הנעילה. החזירו את העכבר לכלוב הביתי שלו.

תוצאות

איור 1 מראה את ההליך הניסויי הסכמטי, הכולל הזרקה נגיפית, השתלת עדשת GRIN, הצמדת בסיס המיניסקופ לגולגולת העכבר והדמיית סידן in vivo באמצעות מיניסקופ. ההליך כולו אורך כחודשיים. איור 2 מראה את המרכיבים העיקריים המתוארים בפרוטוקול להדמיית סידן in vivo של מיניסקופ. איור 3 מציג את הממשקים של תוכנת AutoStereota במהלך השתלת עדשת GRIN. איור 4 מציג את הממשקים של NeuView ואת תוכנת הקלטת ההתנהגות במהלך הדמיית סידן in vivo.

התוצאה של הדמיית סידן in vivo תלויה בהצלחתם של ניתוחי הזרקה נגיפית והשתלת עדשות GRIN. איור 5 מראה מגוון של תוצאות (כלומר, לא מוצלחות, לא אופטימליות וטובות) מרישומי הדמיית סידן in vivo . במקרים לא מוצלחים, תמונת הסידן יכולה להיראות כהה או בהירה, אך בדרך כלל חושפת לא או מעט מאוד נוירונים פעילים. בדרך כלל איננו ממשיכים בניסויים ברישום סידן in vivo אם יש פחות מחמישה תאי עצב פעילים. הדמיית סידן in vivo טובה חושפת בדרך כלל כמה מאות נוירונים פעילים. אם הקלטה מכילה פחות ממאה תאי עצב פעילים, אנו רואים בה הקלטה לא אופטימלית.

הן בהקלטות לא אופטימליות והן בהקלטות טובות בוצעו ניסויי הדמיית סידן in vivo , וניתוח הנתונים שלאחר מכן בוצע. סרט 1 מציג הקלטה מייצגת של הדמיית סידן in vivo מ-mPFC של העכבר. סרטוני התנהגות ונתוני הדמיית סידן מעובדים בדרך כלל בנפרד. ניתן להבקיע באופן ידני סרטוני התנהגות עכבר. קבצי הדמיית סידן מעובדים באמצעות ארגז הכלים לעיבוד תמונה של סידן CaImAn²⁴. איור 6 מראה מפת תאים מייצגת וכמה עקבות סידן מרישום טוב של הדמיית סידן in vivo .

לאחר השלמת הדמיית הסידן in vivo , השלב האחרון הוא לאשר אם ההזרקה הנגיפית והשתלת עדשת GRIN התרחשו באזור המוח הרצוי. לשם כך, העכבר הוחדר עם מלח בעל מאגר פוספט (PBS) ואחריו 4% פרפורמלדהיד (PFA). מוח העכבר נקטף, הוצב ב-4% PFA במשך 12 שעות, ואוחסן ב-PBS בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. מוח העכבר נחתך אז לפרוסות בעובי 50 מיקרומטר עם ויברטום. פרוסות המוח הוכתמו ב-DAPI ונצפו תחת המיקרוסקופ (לא מתואר בפרוטוקול)¹². איור 7 הוא פרוסת מוח של עכבר בגודל של כ-1.94 מ"מ קדמית לברגמא מעכבר ניסיוני, ומראה את המסלול שבו הושתלה עדשת ה-GRIN. אזור הפלואורסצנציה הירוק מתחת למסלול עדשות GRIN ובסביבתו מציין את הביטוי של GCaMP6f באזור mPFC.

איור 1: סקירה סכמטית של ההליך הניסיוני. (B) השתלת עדשת GRIN ב-mPFC. (C) הצמדת בסיס מיניסקופ לגולגולת העכבר. (D) הרכבה של מיניסקופ והדמיית סידן in vivo. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: רכיבים עיקריים הדרושים להדמיית סידן in vivo . (A) עדשת GRIN בקוטר 1 מ"מ ובאורך 4.38 מ"מ. (B) מחט קהה בעלת קצה קהה מלוטשת באורך 27 גרם המשמשת לשאיפת רקמת המוח. (C) הזרוע הרובוטית המוצמדת למחזיק המחט. (D) מכסה מותאם אישית מצינור PCR להגנה על עדשת ה-GRIN החשופה עד להצמדת בסיס מיניסקופ על גולגולת העכבר. (E) מחזיק המיניסקופ (בסיס) עם אום הקסדצימלי. (F) מיניסקופ שחלק החוט שלו עטוף בקלטת PTFE. (G) מיניסקופ מהודק לבסיסו באמצעות בורג נעילה. (ח) המיניסקופ האוחז בזרועו. (I) בקר ממונע תלת-ממדי שנבנה בהתאמה אישית ומשמש להקלה על תנועת המיניסקופ במיקומי XYZ. (J) מכסה מגן מהודק על הבסיס כדי להגן על עדשת ה-GRIN החשופה בזמן שהעכבר אינו מבצע הדמיית סידן in vivo . (K) המיניסקופ המחובר לכבל. (L) מערכת רכישת הנתונים להדמיה in vivo Ca²⁺ . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: ממשקים של תוכנת AutoStereota במהלך שאיפת רקמת מוח שכבה אחר שכבה. (B) הממשק המתאים לשלבים 2.17.4 עד 2.17.6. (C) הממשק המתאים לשלבים 2.17.7 עד 2.17.9. (ד) הממשק המתאים לשלבים 2.17.10 עד 2.17.12. תיבות אדומות מדגישות את ערכי הקלט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4: הממשקים של תוכנת NeuView ותוכנת הקלטת ההתנהגות במהלך הדמיית סידן in vivo . (A) הממשק של NeuView. (ב,ג) הממשקים של תוכנת הקלטת ההתנהגות. תיבות אדומות מדגישות לחצנים שיש ללחוץ עליהם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 5: הקרנה מקסימלית של תאים פלואורסצנטיים ממפים כדי להראות את טווח התוצאות האפשריות. (A) הוא כהה ומכיל פחות מ-5 תאי עצב פעילים. (B) הוא בהיר אך אין לו נוירונים פעילים. (C) מפת התאים מהדמיית סידן in vivo תת-אופטימלית המכילה כמה תאי עצב פעילים. (D) מפת התאים מהדמיית סידן in vivo טובה הכוללת כמה מאות נוירונים פעילים. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 6: מפת תאים מייצגת וחולף סידן מהדמיית סידן in vivo מוצלחת. הפאנל השמאלי הוא מפת התאים הפלואורסצנטיים של ההקרנה המקסימלית מהקלטת הדמיית סידן in vivo ב-mPFC במהלך בדיקת שדה פתוח. ההקלטה נמשכת 5 דקות. הפאנל הימני מציג ארעי סידן מ-15 אזורי עניין (תואמי צבע). סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 7: הערכה לאחר המוות של עכבר ניסיוני. ההערכה שלאחר המוות עבור ביטוי GCaMP6f והשתלת עדשת GRIN ב- mPFC של עכבר ניסיוני. האזור המלבני מציין את הנתיב להשתלת עדשת GRIN. האזור הירוק שמתחת לאזור המושתל בעדשת GRIN מאשר כי GCaMP6f הובטא, ועדשת GRIN הושתלה בדיוק באזור המוח הרצוי. Cg, קליפת המוח הסינגולטית; PrL, קליפת המוח הפרה-לימבית; IL, קליפת המוח האינפרא-לימבית. סרגל קנה מידה: 400 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה 1: השוואות של מערכת המיניסקופים שנבנתה בהתאמה אישית ב-NIDA עם מערכות מיניסקופ אחרות 7,8,9,10,11,13,25,26. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

סרט 1: הקלטת הדמיית סידן in vivo מ-mPFC של העכבר במהלך בדיקת שדה פתוח. למטרות הדגמה, סרטון זה מציג רק הקלטה של דקה אחת. קצב הפריימים המקורי של ההקלטה הוא 10 פריימים לשנייה. הסרטון מהיר פי 6 מההקלטה המקורית. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה.

Discussion

שאלה מרכזית במדעי המוח היא הבנת האופן שבו דינמיקה ומעגלים עצביים מקודדים ומאחסנים מידע, וכיצד הם משתנים במחלות מוח. באמצעות מיניסקופ in vivo Ca²⁺ הדמיה, ניתן לנטר בו זמנית פעילות עצבית בודדת מכמה מאות נוירונים בתוך מיקרו-מעגל מקומי מבעל חיים שמתנהג באופן חופשי. כאן, פרוטוקול ניתוח מפורט להזרקה ויראלית והשתלת עדשת GRIN מתואר כדי להכין מכרסמים להדמיית מוח עמוק in vivo Ca²⁺ באמצעות מערכת הקלטה של מיניסקופ שפותחה בהתאמה אישית. טבלה 1 מציגה את ההשוואות של מערכת המיניסקופ שלנו עם מערכות מיניסקופ אחרות הזמינות מסחרית ובהתאמה אישית 7,8,9,10,11,13,25,26. ראוי לציין כי השתלת עדשת GRIN באמצעות הפרוטוקול הכירורגי הנוכחי תואמת לכל מערכת הדמיה מסחרית או מותאמת אישית של פוטון יחיד ושני פוטונים עבור הדמיית סידן in vivo במוח עמוק.

מהזרקה ויראלית ועד רכישת נתונים של הדמיית סידן in vivo של מיניסקופ, כל הליך הניסוי לוקח לפחות חודשיים להשלים. זהו תהליך מסובך ועתיר עבודה. ההצלחה הסופית של הניסוי תלויה במספר גורמים, כולל בחירה נכונה של GECIs, הזרקת וירוס במדויק באזור המוח הממוקד, ביטוי ויראלי מספיק באוכלוסייה העצבית הרצויה, השתלת עדשת GRIN בדיוק במיקום הרצוי, התאוששות נאותה מניתוחים, כמו גם, האם דלקת חמורה מתרחשת לאחר הניתוח, והאם התנהגות בעלי החיים מושפעת קשות מניתוחים, וכן הלאה.

שני שלבים קריטיים כוללים הזרקה סטריאוטקסית של וירוס והשתלת עדשת GRIN. לצורך ההדגמה, המיקרו-איניג'קציה הסטריאוטקסית בוצעה ב-mPFC של העכבר, כאשר נגיף הקשור לאדנו (AAV1) מקודד את GCaMP6f בשליטת מקדם CaMKII שמתייג באופן סלקטיבי נוירונים פירמידליים ב-mPFC. GCaMP6f נבחר מכיוון שהוא אחד ממדדי הסידן המהירים והרגישים ביותר עם זמן של חצי ריקבון של 71 אלפיות השנייה¹⁵. בנוסף, הביטוי הנגיפי AAV של GCaMP6f הוא ארוך טווח (כלומר, מספר חודשים), מה שהופך אותו לאידיאלי לביצוע הדמיה חוזרת ונשנית in vivo Ca²⁺ לאורך תקופה ארוכה עבור מחקרי אורך במודלים של עכברים של מחלות נוירודגנרטיביות²⁷. פרוטוקול הניתוח הנוכחי יכול להיות מותאם למיקוד אוכלוסיות תאים שונות בכל אזור מוח אחר. כלים ויראליים שונים זמינים מאפשרים תיוג סלקטיבי של אוכלוסיות עצביות ספציפיות באזור המוח הרצוי בגיל הרצוי. בנוסף, חוקרים יכולים לנצל את מערכת הרקומבינציה Cre-LoxP ואת מודלי העכברים המהונדסים הזמינים השונים כדי לבצע שינויים גנטיים ולחקור את תוצאות המעגלים ההתנהגותיים והעצביים^28,29.

מאפיין ייחודי אחד של הפרוטוקול המוצג הוא שהשאיפה האוטומטית של רקמת המוח שכבה אחר שכבה בוצעה לפני השתלת עדשת GRIN (בקוטר 1 מ"מ). זה מושג באמצעות מחט 27 גרם המחוברת למערכת ואקום, הנשלטת על ידי זרוע רובוטית שנבנתה בהתאמה אישית ותוכנה²³. בהתבסס על הניסיון שלנו, שיטה זו יוצרת משטח אחיד לעדשת GRIN למגע וגורמת פחות נזק לרקמה השכנה מאשר שאיפת רקמות ידנית²³. מסיבה זו, הליך זה מביא יתרון ברור לעדשות GRIN בקוטר רחב יחסית (למשל, 1 מ"מ). עם זאת, ייתכן ששאיפת רקמות אינה נחוצה להשתלת עדשת GRIN בקוטר קטן יותר (0.5 מ"מ או 0.25 מ"מ). במקום זאת, ניתן לשתול אותו ישירות לאורך המסלול המוביל המיוצר עם מחט 30 G²¹.

מלבד שני השלבים הקריטיים שנדונו לעיל, יש לשקול בזהירות גורמים רבים אחרים לצורך ניתוח מוצלח. (1) יש לעקר את כל המכשירים שבאים במגע עם המוח כדי למנוע זיהום. (2) כל שלבי הניתוח צריכים להתבצע כדי למזער את הנזק למוח כדי למנוע דלקת נוספת ויצירת רקמת צלקת מוגזמת. (3) יש לשקול בקפידה את מינוני ההרדמה שניתנו בתחילה ונשמרו במהלך הניתוח, במיוחד אלה שניתנו באופן תוך-צפקי. מינוני ההרדמה עשויים להשתנות בהתאם לזני עכברים שונים, שכן חלקם עשויים להיות רגישים יותר. (4) מצבו של העכבר צריך להיות מנוטר כל הזמן במהלך הניתוח. לבסוף, (5) העכברים צריכים להיות במעקב קבוע לאחר הניתוח, שכן סיבוכים רבים עלולים להתרחש לאחר הניתוח.

למרות שנתח של רקמת מוח מוסר באופן חד צדדי במהלך שלב השתלת עדשת GRIN, לא ראינו ליקויי התנהגות ברורים ^7,12. משקלו של המיניסקופ הוא כ-2 גרם והכבל מתוכנן בהתאמה אישית כדי להפוך אותו לקליל ולהבטיח שהעכבר יוכל לשאת אותו בקלות. המיניסקופ והכבל מחוברים לחיה רק לפני הדמיית in vivo ומנותקים לאחר ההדמיה. תהליך ההדמיה כולו אורך בדרך כלל לא יותר מ-30 דקות. לכן, מכשור זה אינו מונע מהעכבר להתנהג בחופשיות. התקנת המיניסקופ ושלבי הדה-אינסטלציה זקוקים להרדמה קצרה (פחות מ-2 דקות) עם איזופלורן לצורך ריסון בעלי חיים. בדרך כלל אנו מאפשרים לעכבר להתאושש מהחשיפה הקצרה של איזופלורן למשך 30 דקות לפני ביצוע הדמיית in vivo. ביצענו הדמיית סידן in vivo של מיניסקופ פעם בשבוע במשך כמה שבועות מבלי לשים לב להשפעה כלשהי על בריאות העכברים ועל ההתנהגות החברתית של העכבר¹².

מגבלה מרכזית אחת של מערכת ההקלטה הנוכחית של המיניסקופ היא הצורך לחבר את המיקרוסקופ לכבל לצורך רכישת נתונים. נוכחות הכבל מגבילה לעתים את ביצועי משימת העכבר ומגבילה את ההקלטה של חיה אחת בכל פעם. לאחרונה פותח מיניסקופ אלחוטי^25,26. זה ירחיב את ביצועי המשימה ויאפשר הדמיית in vivo בו זמנית ממספר בעלי חיים בקבוצה. יתר על כן, פיתוח GECIs רגישים יותר עם אורכי גל הניתנים להפרדה ספקטרלית בשילוב עם מיניסקופ דו-צבעי יציעו אפשרויות מרגשות יותר למחקר במדעי המוח.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.6mm and 1.2mm drill burrs	KF technology	8000037800	For craniotomy
27-G and 30-G needle	BD PrecisionGlide Needle	REF 305109 and REF305106	For both surgeries
45 angled forceps	Fine Science tools	11251-35	For surgeries
7.5% povidone-iodine solution (Betadine)	Purdue Products L.P.	NDC 67618-151-17	Surface disinfectant
Acetone	Sigma-Aldrich	179124-1L	GRIN lens cleaner
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539-25G	For GRIN lens implantation
Antibiotic ointment	HeliDerm Technology	81073087	For virus injection
Anti-inflamatory drug (Ibuprofen)	Johnson & Johnson Consumer Inc	30043308	Acts as pain killer after surgeries
AutoStereota	NIDA/IRP	github.com/liang-bo/autostereota	For GRIN lens implantation
Behavior Recoding Software (Point Grey FlyCap2)	Point Grey	Point Grey Research Blackfly BFLY-PGE-12A2C	For recording behavior
Brass hex nut	McMASTER-CARR	92736A112	For GRIN lens implantation
Buprenorphine	Par Pharmaceuticals	NDC 4202317905	For GRIN lens implantation
Calcium chloride	Sigma	10043-52-4	For preparing aCSF
Commutator	NIDA/IRP	Custom-designed	Component of image acquisition system
Compressed Oxygen and Caxbondioxide tank	Rocky Mountain Air Solutions	BI-OX-CD5C-K	For GRIN lens implantation
Compressed Oxygen tank	Rocky Mountain Air Solutions	OX-M-K	For virus injection
Cordless Microdrill	KF technology	8000037800	For craniotomy
Cyanoacrylate	Henkel Coorporation	# 1811182	For GRIN lens implantation
Data acquisition controller	NIDA/IRP	Custom-designed	Component of image acquisition system
Data transmission cable	NIDA/IRP	Custom-designed	Component of image acquisition system
Dental cement set	C&B Metabond and Catalyst	A00253revA306 and A00168revB306	For GRIN lens implantation
Dental cement set	Duralay	2249D	For GRIN lens implantation
Dexamethasone	VETone	NDC 1398503702	For GRIN lens implantation
Dextrose	Sigma	50-99-7	For preparing aCSF
Diet gel	Clear H20	72-06-5022	Diet Supplement for mouse
GRIN lens	GRINTECH	NEM-100-25-10-860-S	For GRIN lens implantation
Heating Pad	Physitemp Instruments LLC.	#10023	To keep the mouse body warm during surgeries
Isoflurane	VETone	V1 502017	Anesthesia
Ketamine	VETone	V1 501072	For GRIN lens implantation
Lidocaine	WEST-WARD	NDC 0143-9575-01	Local anesthesia
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	7791-18-6	For preparing aCSF
Microliter syringe (Hamilton)	Hamilton	7653-01	For virus injection
MicroSyringe Pump Controller	World Precision Instrument	#178647	For virus injection
Miniscope	NIDA/IRP	Custom-designed	For imaging
Miniscope base	Protolabs	Custom-designed	For mounting the base
Miniscope holding arm	NIDA/IRP	Custom-designed	For mounting the base
Miniscope protection cap	Protolabs	Custom-designed	For protecting the miniscope
Motorized controller	Thorlabs	KMTS50E	For mounting the base
NeuView	NIDA/IRP	https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0	For in vivo imaging
Ophthalmic ointment	Puralube Vet Ointment	NDC 17033-211-38	Ophthalmic
PCR tube	Thermo Scientific	AB-0622	For GRIN lens implantation
Pinch Clamp	World Precision Instrument	14040	For clamping the tubing
Polytetrafluoroethylene (PTFE) tape	TegaSeal PTFE Tape	A-A-58092	For fastening miniScope to the base
Potassium chloride	Sigma	7447-40-7	For preparing aCSF
Robotic arm	NIDA/IRP	Custom-designed	For GRIN lens implantation
Saline	Hospira	RL 7302	For both surgeries
Set screw	DECORAH LLC.	3BT-P9005-00-0025	For screwing the brass hex nut in miniscope base
Silicone Rubber tubing, 0.062”ID, 1/8”OD	McMaster	2124T3	For irrigation of aCSF
Sodium bicarbonate	Sigma	144-55-8	For preparing aCSF
Sodium chloride	Sigma	7647-14-5	For preparing aCSF
Sodium phosphate monobasic	Sigma	7558-80-7	For preparing aCSF
Stereotaxic stage	KOPF	Model 962 Dual Ultra Precise Small Animal Stereotaxic	For both surgeries
Sterile cotton swab	Puritan	REF 806-WC	For both surgeries
Surgical tools	Fine Science tools	11251-35	For surgeries
Suture	Sofsilk	REF SS683	For virus injection
Syringe filter (0.22 µm)	Millex	SLGVR33RS	For filtering aCSF during GRIN lens implantation
Viral suspension (AAV1-CamKII-GCamp6f)	Addgene	100834-AAV1	For virus injection
		Titre: 2.8 X 10^13 GC/ml
Xylazine	VETone	V1 510650	For GRIN lens implantation