Iniezione virale stereotassica e impianto di lenti con indice di gradiente per l'imaging del calcio in vivo nel cervello profondo

Riepilogo

Miniscope in vivo calcium imaging è una potente tecnica per studiare le dinamiche neuronali e i microcircuiti in topi che si comportano liberamente. Questo protocollo descrive l'esecuzione di interventi chirurgici al cervello per ottenere una buona imaging del calcio in vivo utilizzando un miniscopio.

Abstract

Un microscopio a fluorescenza in miniatura (miniscopio) è un potente strumento per l'imaging del calcio in vivo da animali che si comportano liberamente. Offre diversi vantaggi rispetto ai tradizionali sistemi di imaging del calcio multi-fotone: (1) compatto; (2) leggero; (3) a prezzi accessibili; e (4) consente la registrazione da animali che si comportano liberamente. Questo protocollo descrive gli interventi chirurgici cerebrali per l'imaging del calcio in vivo del cervello profondo utilizzando un sistema di registrazione miniscopio sviluppato su misura. La procedura di preparazione consiste in tre fasi, tra cui (1) iniezione stereotassica del virus nella regione cerebrale desiderata di un cervello di topo per etichettare uno specifico sottogruppo di neuroni con sensore di calcio geneticamente codificato; (2) impianto di lenti a gradiente(GRIN) in grado di trasmettere l'immagine del calcio dalla regione profonda del cervello al sistema miniscopio; e (3) apporre il supporto del miniscopio sul cranio del mouse dove il miniscopio può essere collegato in seguito. Per eseguire l'imaging del calcio in vivo , il miniscopio viene fissato sul supporto e le immagini di calcio neuronale vengono raccolte insieme a registrazioni simultanee del comportamento. L'attuale protocollo chirurgico è compatibile con qualsiasi sistema di imaging a singolo fotone e due fotoni commerciale o personalizzato per l'imaging del calcio in vivo nel cervello profondo.

Introduzione

La segnalazione intracellulare di Ca²⁺ è un regolatore essenziale della crescita cellulare, proliferazione, differenziazione, migrazione, trascrizione genica, secrezione e apoptosi¹. Nei neuroni, la segnalazione di Ca²⁺ è controllata con precisione poiché il suo modello spazio-temporale è correlato a funzioni cruciali come l'eccitabilità della membrana, il rilascio di neurotrasmettitori e la plasticità sinaptica².

L'imaging del calcio in vivo è una potente tecnica che può essere utilizzata per decodificare la rappresentazione del circuito neurale elementare ai normali comportamenti animali, identificare attività neuronali aberranti in modelli animali di disturbi cerebrali e svelare potenziali bersagli terapeutici che possono normalizzare questi circuiti alterati. I due comuni sistemi di imaging del calcio in vivo sono la microscopia a fluorescenza a scansione laser a due fotoni 3,4,5,6 e la microscopia miniaturizzata montata sulla testa (miniscopio)7,8,9,10,11,12,13 . La microscopia convenzionale a due fotoni offre vantaggi impressionanti come una migliore risoluzione, un rumore inferiore e un minore fotosbiancamento; tuttavia, gli animali da esperimento devono essere fissati a testa in giù, limitando gli studi comportamentali che possono essere eseguiti 3,4,5,6. Al contrario, il sistema miniscopio montato sulla testa è piccolo e portatile, rendendo possibile studiare un'ampia varietà di test comportamentali utilizzando animali che si comportano liberamente 7,8,9,10,11,12,13.

Esistono due indicatori principali di Ca²⁺, indicatori chimici ^5,14 e indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI)^15,16. L'imaging Ca²⁺ è stato facilitato utilizzando GECI altamente sensibili forniti con vettori virali che consentono l'etichettatura specifica dei neuroni nel circuito mirato. Il continuo sforzo per migliorare la sensibilità, la longevità e la capacità di etichettare anche i compartimenti subcellulari, rende i GECI ideali per vari studi di imaging del calcio in vivo 17,18,19.

La dispersione della luce nel tessuto cerebrale durante l'imaging limita la penetrazione ottica in profondità, anche con la microscopia a due fotoni. Tuttavia, la lente Gradient Index (GRIN) supera questo problema in quanto la lente GRIN può essere incorporata direttamente nei tessuti biologici e trasmettere immagini dalla regione profonda del cervello all'obiettivo del microscopio. A differenza dell'obiettivo convenzionale realizzato in materiale otticamente omogeneo e richiede una superficie sagomata complicata per mettere a fuoco e creare immagini, le prestazioni dell'obiettivo GRIN si basano su un graduale cambiamento dell'indice di rifrazione all'interno del materiale dell'obiettivo che raggiunge la messa a fuoco con una superficie^{piana 20}. L'obiettivo GRIN può essere fabbricato fino a 0,2 mm di diametro. Pertanto, una lente GRIN miniaturizzata può essere impiantata nel cervello profondo senza causare troppi danni.

In questo articolo, viene presentato un protocollo chirurgico completo per l'imaging del calcio in vivo nel cervello profondo. A scopo dimostrativo, descriviamo gli interventi chirurgici al cervello specificamente mirati alla corteccia prefrontale mediale (mPFC) del cervello del topo e la registrazione dell'imaging del calcio in vivo tramite un sistema miniscopio personalizzato sviluppato dal gruppo del Dr. Lin presso il National Institute on Drug Abuse (NIDA / IRP) ^7,12. La procedura sperimentale prevede due importanti interventi chirurgici al cervello. Il primo intervento chirurgico consiste nell'iniezione stereotassica di un vettore virale che esprime GCaMP6f (un GECI) nella mPFC. Il secondo intervento chirurgico consiste nell'impiantare la lente GRIN nella stessa regione del cervello. Dopo il recupero da questi interventi chirurgici al cervello, la procedura successiva consiste nell'apporre il supporto del miniscopio (base) sul cranio del topo usando cemento dentale. In vivo L'imaging Ca²⁺ può essere eseguito in qualsiasi momento dopo aver montato il miniscopio sulla sua base. Il protocollo chirurgico per l'iniezione virale e l'impianto di lenti GRIN è compatibile con qualsiasi sistema di imaging a singolo fotone e due fotoni commerciale o personalizzato per l'imaging di calcio in vivo nel cervello profondo.

Protocollo

Il protocollo sperimentale segue le linee guida per la cura degli animali dell'Università del Wyoming. Il topo utilizzato in questo studio è C57BL/6J maschio di 6 mesi. La procedura può essere utilizzata per colpire qualsiasi regione profonda del cervello per l'imaging del calcio in vivo . Qui, per dimostrazione, l'area cerebrale mirata è l'mPFC del topo (anteriore e posteriore (A / P): 1,94 mm, mediale e laterale (M / L): 0,5 mm, dorsale e ventrale (D / V): 1,8 mm). Questo protocollo viene modificato in base al protocollo²¹ pubblicato in precedenza.

1. Iniezione stereotassica del virus nell'mPFC (Figura 1)

1. Preparazione per l'intervento chirurgico
   1. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici con un'autoclave e posizionarli su una superficie sterile.
   2. Preparare una siringa da 10 μL adescandola con soluzione salina e preriempendola con 5 μL di soluzione salina. Attaccare la siringa a una micropompa (vedere Tabella dei materiali).
   3. Accendere la piastra riscaldante e mantenere la temperatura a 35 °C.
2. Posizionare il mouse nella camera di induzione (5" x 10" x 4", lunghezza x larghezza x altezza) con il 5% di isoflurano e 1 L/min di portata di ossigeno. Osservare attentamente e contare la frequenza respiratoria del topo. Estrarre il mouse una volta che la sua frequenza respiratoria diminuisce a 1 respiro/i.
   NOTA: La frequenza respiratoria del topo può essere facilmente monitorata osservando il movimento del muscolo verso il basso e verso l'alto della schiena durante ogni inalazione.
3. Lasciare che il mouse si depositi su un'area da banco separata dall'area chirurgica. Con un taglia rasatura, radere i capelli dalla testa del topo fino alle prime vertebre cervicali.
4. Posizionare il mouse sullo stadio stereotassico (vedere Tabella dei materiali) e fissarne la posizione con le barre auricolari e la clip per il naso. Mantenere il flusso di isoflurano allo stadio stereotassico all'1,5% di isoflurano e 0,5 L/min di portata di ossigeno.
5. Applicare l'unguento oculare oftalmico lubrificante su entrambi gli occhi con un batuffolo di cotone pulito per prevenire la secchezza degli occhi durante l'intervento chirurgico. Valutare i riflessi del pedale sul mouse per confermare che il mouse è completamente anestetizzato prima di iniziare l'intervento chirurgico.
6. Disinfettare l'area glabra con una soluzione di povidone-iodio al 7,5% (vedi Tabella dei materiali) e al 70% di etanolo tre volte ciascuno utilizzando tamponi di cotone sterili.
7. Iniettare un piccolo volume (50 μL) di lidocaina al 2% sotto la pelle dell'area glabra.
8. Fai un'incisione di 2 cm attraverso la pelle lungo la linea mediana usando un bisturi per esporre la lambda e il bregma del cranio.
9. Rimuovere la fascia dal cranio con l'aiuto di tamponi di cotone asciutti e pinze appuntite.
10. Dopo che il bregma e il lambda sono visibili, utilizzare la punta di una bava dentale (0,5 mm di diametro) per misurare le coordinate Z di bregma e lambda (vedere Tabella dei materiali). Regolare l'altezza del nasello fino a quando il bregma e il lambda si trovano nella stessa posizione Z.
11. Posizionare la bava dentale da 0,5 mm in una posizione di A/P: 1,94 mm, M/L: 0,5 mm dal bregma. Perforare il cranio.
    NOTA: Qui, per dimostrazione, la regione del cervello mirata è l'mPFC del topo. Questo protocollo può essere utilizzato per colpire qualsiasi altra regione profonda del cervello. Ad esempio, se l'area cerebrale mirata è il Nucleus Accumbens (NAc), la posizione corrispondente dovrebbe essere A / P: 0,9 mm, M / L: 1,2 mm.
12. Rimuovere la dura utilizzando una punta dell'ago da 30 G e pulire tutti i pezzi di detriti ossei utilizzando pinze affilate angolate di 45 °.
    NOTA: Il sanguinamento è comune in quanto i piccoli vasi sanguigni possono rompersi durante la fase di pulizia. Utilizzare tamponi di cotone sterili per fermare il sanguinamento e applicare soluzione salina per lavare l'area. Applicare soluzione salina sulla zona del cranio esposta per mantenerla umida.
13. Caricare il virus nella siringa del microlitro utilizzando il pannello di controllo della micropompa. Prelevare 500 nL di bolla d'aria seguita da 800 nL del virus ad una portata di 50 nL/s.
    NOTA: A scopo dimostrativo, qui, un sierotipo 1 (AAV1) di virus adeno-associato che esprime GCaMP6f (un GECI), AAV1-CamKII-GCamp6f, viene iniettato nell'mPFC (vedere Tabella dei materiali). Il titolo del virus è 2,8 x 10¹³ GC / mL. È 1:2 diluito in soluzione salina prima dell'iniezione.
14. Posizionare la punta dell'ago sulla parte superiore del bregma per toccare semplicemente il bregma e annotare la coordinata Z di bregma. Spostare l'ago sopra il foro praticato e iniettare 100 nL del virus per assicurarsi che l'ago non sia intasato.
15. Spostare lentamente l'ago nel tessuto cerebrale fino alla coordinata Z mirata di D / V: 1,75 mm e quindi spostarlo leggermente fino alla coordinata Z di D / V: 1,65 mm.
    NOTA: Questo per creare una piccola tasca per la soluzione virale da infusare. Se la regione del cervello mirata è il NAc, la corrispondente coordinata Z mirata di D / V dovrebbe essere di 4,2 mm e quindi spostarsi leggermente fino a 4,1 mm.
16. Utilizzare il pannello di controllo per impostare la micropompa per iniettare 500 nL del virus alla portata di 50 nL/min. Premi il pulsante RUN sul pannello di controllo per iniettare il virus.
    NOTA: l'iniezione richiederà circa 10 minuti. Al termine dell'iniezione, attendere altri 5-10 minuti prima di estrarre l'ago dal cervello. Applicare frequentemente soluzione salina per mantenere umida l'area del cranio esposta durante il periodo di iniezione.
17. Muovi l'ago verso l'alto e fuori dal cervello. Iniettare 500 nL di volume due volte alla portata di 50 nL/s.
    NOTA: questo passaggio conferma che un volume adeguato del virus è stato somministrato nel cervello. Durante le prime iniezioni da 500 nL, il virus viene rilasciato, seguito da bolle d'aria. Durante la seconda iniezione da 500 nL, compaiono prima le bolle d'aria, seguite dalla soluzione salina. La siringa è ora pronta per caricare il virus per il mouse successivo. Una volta eseguito l'intervento chirurgico, la siringa e l'ago del microlitro vengono accuratamente puliti con acetone seguito da soluzione salina.
18. Allineare i bordi della pelle e chiudere con cura l'incisione con una sutura (taglia 4.0). Applicare un unguento antibiotico sulla zona cucita per prevenire l'infezione.
19. Rimuovere il mouse dallo stadio stereotassico e riportarlo nella sua gabbia di casa. Posizionare la gabbia domestica in un'incubatrice a 33 °C fino a quando il topo non è ambulatoriale.
    NOTA: di solito ci vogliono 10-15 minuti perché un topo si svegli dall'anestesia isoflurano prima che inizi a muoversi.
20. Dopo che il topo inizia a muoversi, somministrare farmaci antinfiammatori non steroidei per 3 giorni post-chirurgici (vedere Tabella dei materiali). Lascia che il topo si riprenda dall'intervento chirurgico per 14 giorni prima di perseguire l'impianto della lente GRIN.

2. Impianto della lente GRIN nell'mPFC (Figura 1)

1. Preparazione per l'intervento chirurgico
   1. Preparare il liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) contenente 124 mM di NaCl, 2,5 mM di KCl, 1,25 mM di NaH₂PO₄, 1,2 mM di MgCl₂, 25 mM di glucosio, 26 mM di NaHCO₃ e 2,4 mM di CaCl₂.
   2. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici con un'autoclave e posizionarli su una superficie sterile.
   3. Accendere la piastra riscaldante e mantenere la temperatura a 35 °C.
   4. Sciogliere l'1% di agarosio e conservarlo a bagnomaria a 42 °C fino all'uso.
      NOTA: L'agarosio fuso può essere conservato a bagnomaria per un paio d'ore.
   5. Disinfettare una lente GRIN (1 mm di diametro, 4,38 mm di lunghezza, Figura 2A) in etanolo al 70% per 15 minuti, trasferirla in un tubo riempito con soluzione salina per risciacquarla correttamente prima dell'impianto.
      NOTA: le lenti GRIN (vedi Tabella dei materiali) sono prodotte tramite scambio di ioni di argento e litio in occhiali speciali, rendendole atossiche e neuronali ^6,7. Tuttavia, molte lenti GRIN disponibili in commercio possono lisciviare residui tossici, causando neurodegenerazione, rendendole inadatte per l'impianto nel cervello vivo per studi di imaging in vivo a lungo termine. Queste lenti GRIN possono richiedere il rivestimento con agenti biocompatibili come il parylene-C per prevenire effetti collaterali tossici sui neuroni vicini²².
2. Pesare il topo e anestetizzarlo mediante iniezione intraperitoneale della miscela ketamina/xilazina (vedere Tabella dei materiali) (ketamina:100 mg/kg; Xilazina: 15 mg/kg).
   NOTA: un topo del peso di 30 g richiede 300 μL di miscela ketamina/xilazina (ketamina 100 mg/mL e xilazina 1,5 mg/mL) per la dose iniziale e 150 μL di ketamina (10 mg/mL) per dosi aggiuntive durante l'intervento chirurgico. Per mantenere il topo anestetizzato durante l'intero processo chirurgico, dosi aggiuntive di ketamina (50 mg / kg) devono essere somministrate almeno una volta all'ora. La fase di anestesia del mouse deve essere monitorata frequentemente valutando i riflessi del pedale.
3. Rasare i capelli dall'area chirurgica con un rasoio e pulire i capelli usando un tovagliolo di carta bagnato.
4. Posizionare il mouse nello stadio stereotassico e fissarne la posizione stringendo la clip per il naso e le barre auricolari. Applicare un unguento oculare oftalmico lubrificante su entrambi gli occhi con un batuffolo di cotone sterile. Verificare che il mouse sia completamente anestetizzato valutando i riflessi del pedale.
5. Disinfettare l'area glabra con una soluzione di povidone-iodio al 7,5% e etanolo al 70% tre volte ciascuno utilizzando tamponi di cotone sterili. Somministrare 2 mg/kg di desametasone per via intramuscolare nella coscia per ridurre il rischio di gonfiore e infiammazione correlati all'intervento chirurgico.
6. Iniettare 50 μL di lidocaina al 2% sotto la pelle dell'area chirurgica.
7. Utilizzare una forbice fine per asportare un'area della pelle triangolare di 1,5 cm (altezza) x 1,0 cm (base), dal lato anteriore tra gli occhi al lato posteriore dietro la lambda.
8. Rimuovere il tessuto del periostio dal cranio usando pinze sottili, micro-lame e tamponi di cotone.
   NOTA: Il cranio deve essere accuratamente pulito e asciugato prima di perseguire il passaggio successivo.
9. Applicare cianoacrilato (vedi Tabella dei materiali) sui bordi della pelle e attaccare la pelle al cranio. Attendere 5 minuti fino a quando il cianoacrilato si asciuga.
10. Con l'aiuto di una punta di bava da 0,5 mm, allineare il bregma e il lambda sullo stesso piano orizzontale regolando l'altezza della clip del naso.
11. Posizionare una bava per trapano dentale (1,2 mm di diametro) in una posizione di A/P: 1,94 mm, M/L: 0,8 mm dal bregma. Perforare il cranio. Rimuovere la dura utilizzando una punta dell'ago da 30 G e pulire tutti i pezzi di detriti ossei utilizzando pinze affilate angolate di 45 °.
    NOTA: questi detriti ossei possono bloccare la successiva fase di aspirazione se non rimossi completamente.
12. Attaccare un ago smussato da 27 G lucidato manualmente (Figura 2B) al supporto dell'ago accoppiato a un braccio robotico inclinato con un angolo di 10° (Figura 2C). Collegare l'altra estremità del supporto dell'ago al sistema di aspirazione della casa.
    NOTA: Il braccio robotico (vedi Tabella dei materiali) è sviluppato dal gruppo del Dr. Lin presso il NIDA / IRP ed è controllato da un software sviluppato su misura, attualmente ad accesso aperto, AutoStereota (https://github.com/liang-bo/AutoStereota)²³
13. Individuare la punta dell'ago per toccare semplicemente il bregma. Impostare la coordinata Z di bregma su 0 facendo clic sul pulsante Bregma su AutoStereota.
14. Impostare il valore Input X su 0,8, il valore Input Y su 1,94, il valore Input Z su 1,0, quindi fare clic sul pulsante Trova per spostare l'ago sulla parte superiore del foro praticato sul cranio.
15. Regolare la posizione dell'ago al centro dell'area del tessuto cerebrale esposta tramite AutoStereota.
    NOTA: per spostare l'ago in direzioni laterali o mediali, immettere il valore Step e fare clic sui pulsanti Laterale o Mediale su AutoStereota. Allo stesso modo, per spostare l'ago in direzioni anteriore o posteriore e dorsale o ventrale, fare clic rispettivamente sui pulsanti rostrale o caudale e dorsale o ventrale .
16. Accendere il vuoto e iniziare a risciacquare l'area del cervello esposta con ACSF attraverso un sistema di tubi a gravità controllata (vedere Tabella dei materiali) collegato a un ago da 30 G con una punta piegata. ACSF viene continuamente bollato con una miscela di gas del 95% O₂ e 5% CO₂ e filtrato attraverso un filtro da 0,2 μm.
    NOTA: la portata ACSF è ~ 1,5 ml / min. La pressione di uscita della miscela di gas viene mantenuta a ~ 3 psi.
17. Aspirare il tessuto cerebrale strato per strato con l'aiuto del software AutoStereota (Figura 3).
    NOTA: L'aspirazione del tessuto cerebrale viene completata in 4 colpi in modo da generare una tasca a colonna (1,8 mm di profondità e 1 mm di diametro).
    1. Nella sessione "zStep", fai clic e controlla la prima e la seconda riga. Impostare i valori per la prima riga su 0,2 e 1. Impostare i valori per la seconda riga su 0,15 e 4 (Figura 3A).
    2. Nella sessione "Modalità", impostare La dimensione dell'ago 27 Gauge e 1.2, impostare Dims 0.9. Tutti gli altri valori utilizzano valori predefiniti (Figura 3A).
    3. Fare clic in sequenza sui pulsanti Imposta, Mantieni zero e Start per avviare l'aspirazione.
       NOTA: Questo è il 1^° round di aspirazione. I valori di input indicano che la profondità di aspirazione è di 0,2 mm (dalla coordinata Z di 0) durante il primo passaggio con 1 strato; durante la seconda fase, la profondità di aspirazione è di 0,15 mm, ripetuta continuamente per 4 strati. La risoluzione di aspirazione è 1,2 e il diametro è di 0,9 mm. Durante l'aspirazione, la posizione istantanea della punta dell'ago può essere monitorata attraverso il pannello del grafico della traccia. Dopo aver completato questo round di aspirazione, viene generata una tasca a colonna con 0,8 mm di profondità e 1 mm di diametro. La punta dell'ago tornerà al centro con la coordinata Z di 0.
    4. Nella sessione "zStep", fai clic e controlla la prima e la seconda riga. Impostare i valori per la prima riga su 1 e 1. Impostare i valori per la seconda riga su 0,15 e 4 (Figura 3B).
    5. Nella sessione "Modalità", mantenere tutti i valori uguali all'arrotondamento precedente (Figura 3B).
    6. Fare clic in sequenza sui pulsanti Imposta, Mantieni zero e Start per avviare l'aspirazione.
       NOTA: Questo è il 2^° round di aspirazione. I valori di input indicano che la profondità di aspirazione è di 1 mm (dalla coordinata Z di 0) durante il primo passaggio con 1 strato; durante la seconda fase, la profondità di aspirazione è di 0,15 mm, ripetuta continuamente per 4 strati. Dopo aver completato questo round di aspirazione, viene generata la tasca della colonna con 1,6 mm di profondità e 1 mm di diametro.
    7. Nella sessione "zStep", fai clic e controlla solo la prima riga. Impostare i valori per la prima riga su 1.8 e 1 (Figura 3C).
    8. Nella sessione "Modalità", impostare la dimensione dell'ago 27 Gauge e 2.2. Tutti gli altri valori rimangono gli stessi dell'arrotondamento precedente (Figura 3C).
    9. Fare clic in sequenza sui pulsanti Imposta, Mantieni zero e Start per avviare l'aspirazione.
       NOTA: Questo è il 3^° round di aspirazione. I valori di input indicano che la profondità di aspirazione è di 1,8 mm (dalla coordinata Z di 0) con 1 strato. La risoluzione di aspirazione è 2.2. Dopo aver completato questo round di aspirazione, viene generata la tasca della colonna con 1,8 mm di profondità e 1 mm di diametro.
    10. Nella sessione "zStep", fai clic e controlla solo la prima riga. Impostare i valori per la prima riga su 1.6 e 1 (Figura 3D).
    11. Nella sessione "Modalità", impostare La dimensione dell'ago 27 Gauge e 2.2, impostare Dims 0.6 (Figura 3D).
    12. Fare clic in sequenza sui pulsanti Imposta, Mantieni zero e Start per avviare l'aspirazione.
        NOTA: Questo è il 4^° round di aspirazione. Lo scopo di questo passaggio è quello di ripulire il sangue accumulato nella tasca. Il sanguinamento è comune quando i piccoli vasi sanguigni si rompono durante il processo di aspirazione. Per pulire a fondo il sangue, interrompere l'irrigazione di ACSF per 5 minuti e quindi riattivare l'irrigazione. Ripeti il 4^° round di aspirazione più volte fino a quando la tasca è priva di sangue. Questo protocollo può essere utilizzato per colpire qualsiasi altra regione profonda del cervello. Ad esempio, se l'area del cervello mirata è il NAc, la coordinata Z finale corrispondente di D / V dovrebbe essere di 4,4 mm.
18. Fermare il vuoto e l'irrigazione di ACSF. Portare l'ago a +2 mm di coordinate Z e 0,5 mm anteriormente al centro. Posizionare l'obiettivo GRIN sterile da 1 mm nella tasca.
19. Tenere la punta dell'ago a contatto con l'obiettivo GRIN esposto per assicurarsi che l'obiettivo GRIN sia regolato con un angolo di 10°. Premere delicatamente la superficie superiore della lente GRIN con carta velina morbida sterile per assicurarsi che la superficie inferiore della lente GRIN sia a contatto con il tessuto cerebrale.
20. Applicare l'agarosio fuso nello spazio tra la lente GRIN e il tessuto cerebrale con l'aiuto di una spatola. Dopo che l'agarosio forma un gel, rimuovere l'agarosio in eccesso usando una micro-lama.
21. Pulire accuratamente il cranio con tamponi salini e di cotone. Lasciare asciugare il cranio prima della successiva applicazione del cemento dentale (vedi Tabella dei materiali).
22. Estrarre bene la miscelazione dal congelatore a -20 °C. Mescolare la polvere di cemento dentale e il liquido catalizzatore e applicare uno strato di cemento adesivo auto-polimerizzante sul cranio; in primo luogo, circondare la lente GRIN e quindi coprire l'intero cranio esposto.
23. Attendere 5 minuti e lasciare che si indurisca completamente. Rimuovere con attenzione l'ago di aspirazione.
24. In un pozzo di plastica pulito, mescolare la polvere di cemento dentale, il carbone nero con il liquido e applicare uno strato sottile della miscela sopra il 1 ° strato di cemento dentale. Attendere 5 minuti per lasciarlo indurire.
25. Proteggere la lente GRIN esposta coprendola con un cappuccio personalizzato ricavato da un tubo PCR (Figura 2D). Applicare il cianoacrilato per fissare il cappuccio al cemento dentale.
26. Iniettare 1 mL di soluzione salina preriscaldata per via sottocutanea nel topo, seguito da 0,1 mg/kg di buprenorfina. Rimetti il mouse nella sua gabbia di casa. Posizionare la gabbia domestica in un'incubatrice a 33 °C e monitorare il mouse fino a quando non è ambulatoriale. Di solito ci vogliono 20-40 minuti perché un topo si svegli dall'anestesia prima che inizi a muoversi.
27. Somministrare farmaci antinfiammatori non steroidei e monitorare il topo per almeno 3 giorni post-chirurgici. Lascia che il topo si riprenda dall'intervento chirurgico per 30 giorni.

3. Apposizione del supporto del miniscopio (base) sul cranio del topo (Figura 1)

1. Anestetizzare il topo in una camera di induzione con il 5% di isoflurano e 1 L/min di portata di ossigeno fino a quando la sua frequenza respiratoria diminuisce a 1 respiro/i.
2. Posizionare il mouse nello stadio stereotassico e fissarne la posizione con le orecchie e le clip per il naso. Mantenere un flusso continuo di isoflurano (1,5%) e ossigeno (0,5 L/min).
3. Applicare unguento oftalmico sui suoi occhi per mantenerli umidi. Accendere la piastra riscaldante e mantenere la temperatura a 35 °C. Verificare che il mouse sia completamente anestetizzato valutando i riflessi del pedale.
4. Rimuovere delicatamente il cappuccio che copre la lente GRIN utilizzando una pinza appuntita. Trivellare completamente i residui di cianoacrilato essiccati dal cemento dentale utilizzando un microdrill (vedi Tabella dei materiali).
5. Tagliare i capelli intorno all'area di cemento dentale con piccole forbici. Pulire i detriti con l'aiuto di uno spolverino ad aria compressa. Utilizzare un batuffolo di cotone imbevuto di acetone per pulire la superficie superiore della lente GRIN.
6. Preparare il miniscopio con il suo supporto (base).
   1. Posizionare un dado esagonale #00-90 (vedere Tabella dei materiali) nella fessura presente nella base e applicare il cianoacrilato per fissarlo lì (Figura 2E).
   2. Applicare un nastro in politetrafluoroetilene (PTFE) strettamente attorno al filo del miniscopio e tagliare il nastro supplementare (Figura 2F).
   3. Fissare il miniscopio alla base e utilizzare la vite di bloccaggio per fissare il miniscopio alla base (Figura 2G).
   4. Collegare il miniscopio al cavo e accendere il software personalizzato, attualmente ad accesso aperto, NeuView (vedere Tabella dei materiali).
      NOTA: il software NeuView è stato sviluppato su misura per l'imaging del calcio miniscopio in vivo dal gruppo del Dr. Lin al NIDA / IRP ^7,12. È ad accesso aperto (https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0).
   5. In NeuView, fare clic su Hardware, selezionare LED1 e fare clic sul pulsante Stream per visualizzare le immagini live (Figura 4A). Per interrompere lo streaming live, fai clic sul pulsante Stop .
   6. Posizionare il miniscopio in un braccio di tenuta del miniscopio personalizzato (Figura 2H) la cui posizione XYZ può essere manipolata utilizzando controller motorizzati (Figura 2I).
7. Posizionare il miniscopio appena sopra l'obiettivo GRIN esposto e renderlo parallelo alla superficie dell'obiettivo. Abbassare lentamente il miniscopio verso l'obiettivo GRIN e regolare la sua posizione Z fino a trovare il miglior piano di messa a fuoco.
   NOTA: Il miglior piano focale viene determinato confrontando diverse possibili posizioni Z e selezionando il piano focale con una chiara visualizzazione della maggior parte dei corpi cellulari.
8. Applicare con attenzione il primo strato di cemento dentale attorno alla base del miniscopio senza alterare la posizione del miniscopio. Dopo che il cemento è indurito, rimuovere delicatamente il braccio di tenuta in modo che il miniscopio possa stare da solo sulla testa del mouse.
   NOTA: il cemento dentale tende a ridursi dopo l'indurimento e trascinerà verso il basso il miniscopio lontano dal piano di messa a fuoco originale. In genere la posizione Z del miniscopio viene leggermente sollevata sopra il piano focale originale prima di applicare il cemento dentale per compensare il potenziale cambiamento.
9. Applicare un secondo strato di cemento dentale attorno alla base per riempire tutti gli spazi vuoti e assicurarsi che non vi siano perdite di luce LED dagli spazi vuoti. Lasciare che il cemento dentale si indurisca.
10. Rimuovere il mouse dallo stadio stereotassico. Allentare la vite di bloccaggio e staccare il miniscopio dalla base. Metti un cappuccio protettivo stampato in 3D nella base per proteggere la lente GRIN esposta e stringi la vite di bloccaggio nella base (Figura 2J).
11. Rimetti il mouse nella sua gabbia di casa.
    NOTA: di solito ci vogliono 10-15 minuti perché un topo si svegli dall'anestesia isoflurano prima che inizi a muoversi.

4. Montaggio miniscopio e imaging Ca²⁺ in vivo (Figura 1)

1. Montare il miniscopio alla base
   1. Anestetizzare brevemente il mouse nella camera di induzione (5% di isoflurano e 1 L/min di portata di ossigeno). Posizionare il mouse su una superficie di panca pulita.
   2. Allentare la vite di bloccaggio con un piccolo cacciavite, rimuovere il cappuccio protettivo e pulire la superficie della lente GRIN con un batuffolo di cotone imbevuto di acetone.
   3. Avvolgere saldamente un nastro in PTFE attorno al filo del miniscopio e fissare il miniscopio alla sua base sulla testa del mouse.
   4. Collegare il miniscopio al cavo (Figura 2K), accendere il software NeuView.
   5. In NeuView, fare clic su Hardware, selezionare LED1 e fare clic sul pulsante Stream per visualizzare le immagini live (Figura 4A).
   6. Identifica il miglior piano focale regolando la posizione del miniscopio rispetto alla base, stringendo leggermente o allentando con l'aiuto di pinze smussate.
      NOTA: Il miglior piano focale viene determinato confrontando diverse posizioni possibili e selezionando quella con una chiara visualizzazione della maggior parte dei corpi cellulari.
   7. Stringere la vite di bloccaggio e riposizionare il mouse nella sua gabbia di casa.
   8. In NeuView, regolare la potenza della luce LED al livello ottimale. Fai clic su Cattura e quindi sui pulsanti Trigger per avviare la registrazione e premi Stop dopo 150 fotogrammi.
      NOTA: la potenza più bassa possibile determina il livello ottimale di potenza del LED per ottenere un'immagine abbastanza luminosa. Lo scopo della registrazione di un breve video è quello di facilitare l'identificazione dello stesso piano focale in futuro per l'imaging ripetitivo.
   9. Scollegare il cavo dal miniscopio. Lascia che il mouse si riprenda per almeno 30 minuti prima di iniziare l'esperimento.
      NOTA: per proteggere il miniscopio, in genere, la bottiglia d'acqua e l'alimentatore di alimenti a filo vengono rimossi durante questo breve periodo di tempo. Se il topo ha bisogno di rimanere nella sua gabbia domestica più a lungo, si consiglia di fornire gel dietetico disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali) nella gabbia domestica.
2. Acquisizione dati per l'imaging in vivo del calcio
   NOTA: L'imaging del calcio in vivo può essere condotto contemporaneamente insieme a qualsiasi test comportamentale desiderato dal ricercatore. A scopo dimostrativo, l'esempio qui è l'imaging Ca ²⁺ in vivo durante un test in campo aperto. Per raggiungere questo obiettivo, sono necessari due computer. Un computer è dotato di software commerciale (vedere Tabella dei materiali) per controllare una telecamera per registrare automaticamente il comportamento del mouse. L'altro computer è dotato di NeuView per controllare il miniscopio e registrare le immagini Ca² +.
   1. Attivare il software della telecamera di comportamento (vedere Tabella dei materiali) per visualizzare l'arena di comportamento del mouse tramite una funzione Livestream. Regolare manualmente la messa a fuoco della fotocamera superiore (Figura 2L).
   2. Selezionare Trigger/Strobe e selezionare "Abilita/disabilita trigger" (Figura 4B). Fare clic sul pulsante Registra , utilizzare Sfoglia per selezionare la posizione in cui verranno salvate le registrazioni del comportamento, selezionare il formato immagine desiderato.
      NOTA: la funzione "Trigger Control" è abilitata per consentire al software NeuView di attivare la registrazione del comportamento in modo che i frame di comportamento e i corrispondenti fotogrammi di imaging del calcio siano temporaneamente accoppiati insieme. La registrazione del comportamento può essere salvata in qualsiasi formato desiderato. La registrazione del comportamento viene generalmente salvata in formato JPEG nella cartella designata.
   3. Avvicinare il mouse all'arena e collegare il miniscopio al cavo collegato al sistema di acquisizione dati (Figura 2L) (vedere Tabella dei materiali). Il mouse viene quindi posizionato al centro dell'arena.
   4. Con la funzione Livestream del software NeuView, regola la potenza del LED per ottimizzare la luminosità dell'immagine di calcio.
      NOTA: per l'imaging di calcio, la frequenza fotogrammi di registrazione è di 10 fotogrammi/s per impostazione predefinita.
   5. In NeuView, deseleziona LED1, fai clic su Cattura e quindi sui pulsanti Trigger per avviare la registrazione e premi Stop dopo 100 fotogrammi.
      NOTA: Questo per registrare immagini di sfondo per circa 100 fotogrammi con luce LED spenta.
   6. Nel software della telecamera comportamentale, fare clic su Avvia registrazione (Figura 4C). In NeuView, selezionare LED1, fare clic su Cattura, quindi attiva pulsanti per avviare la registrazione. Premi Stop dopo 3000 fotogrammi.
      NOTA: questo è per registrare l'imaging del calcio e il comportamento contemporaneamente. Il test in campo aperto dura 15 minuti, in genere suddiviso in tre sessioni di registrazione ciascuna di 5 minuti. Questo per evitare che il miniscopio si surriscaldi a causa dell'uso continuo.
   7. Salvare sia l'imaging del calcio che le registrazioni del comportamento nelle cartelle designate. Ripeti la registrazione per altre due sessioni mentre registri lo sfondo prima di ogni sessione e salva tutte le registrazioni nella cartella designata.
3. Staccare il miniscopio dalla sua base.
   1. Al termine della registrazione, scollegare il cavo dal miniscopio.
   2. Anestetizzare brevemente il mouse nella camera di induzione (5% di isoflurano e 1L/min di portata di ossigeno). Posizionare il mouse su una superficie pulita e calda.
4. Svitare la vite di bloccaggio nella base e staccare il miniscopio dalla base. Rimettere il cappuccio protettivo sopra la base e stringere la vite di bloccaggio. Rimetti il mouse nella sua gabbia di casa.

Risultati

La Figura 1 mostra la procedura sperimentale schematica, tra cui l'iniezione virale, l'impianto della lente GRIN, l'apposizione della base del miniscopio al cranio del topo e l'imaging del calcio in vivo tramite un miniscopio. L'intera procedura richiede ~ 2 mesi. La Figura 2 mostra i principali componenti descritti nel protocollo per l'imaging del calcio miniscopio in vivo. La Figura 3 mostra le interfacce del software AutoStereota durante l'impianto della lente GRIN. La Figura 4 mostra le interfacce di NeuView e il software di registrazione del comportamento durante l'imaging del calcio in vivo.

Il risultato dell'imaging del calcio in vivo dipende dal successo sia dell'iniezione virale che degli interventi chirurgici di impianto di lenti GRIN. La Figura 5 mostra una serie di risultati (cioè infruttuosi, non ottimali e buoni) dalle registrazioni di imaging del calcio in vivo . In casi non riusciti, l'immagine del calcio potrebbe apparire scura o luminosa, ma di solito non rivela alcun neurone attivo o pochissimi. In genere non perseguiamo esperimenti di registrazione del calcio in vivo se ci sono meno di cinque neuroni attivi. Una buona imaging del calcio in vivo rivela in genere diverse centinaia di neuroni attivi. Se una registrazione contiene meno di cento neuroni attivi, la consideriamo una registrazione non ottimale.

Sia nelle registrazioni subottimali che in quelle buone sono stati perseguiti esperimenti di imaging del calcio in vivo e la successiva analisi dei dati è stata eseguita. Il filmato 1 mostra una registrazione rappresentativa dell'imaging del calcio in vivo dal mPFC del topo. I video comportamentali e i dati di imaging del calcio vengono solitamente elaborati separatamente. I video sul comportamento del mouse possono essere valutati manualmente. I file di imaging del calcio vengono elaborati utilizzando il Toolbox di elaborazione delle immagini di calcio CaImAn²⁴. La Figura 6 mostra una mappa cellulare rappresentativa e diverse tracce di calcio da una buona registrazione di imaging del calcio in vivo .

Dopo aver completato l'imaging del calcio in vivo , il passo finale è confermare se l'iniezione virale e l'impianto della lente GRIN si sono verificati nella regione cerebrale desiderata. A tale scopo, il topo è stato perfuso con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) seguita da paraformaldeide (PFA) al 4%. Il cervello del topo è stato raccolto, postfisso in PFA al 4% per 12 ore e conservato in PBS a 4 °C. Il cervello del topo è stato quindi sezionato in fette spesse 50 μm con un vibratoma. Le fette di cervello sono state colorate con DAPI e osservate al microscopio (non descritte nel protocollo)¹². La Figura 7 è una fetta di cervello di topo ~ 1,94 mm anteriore al bregma di un topo sperimentale, che mostra la traccia in cui è stata impiantata la lente GRIN. La regione di fluorescenza verde sotto e intorno alla traccia dell'obiettivo GRIN indica l'espressione di GCaMP6f nella regione mPFC.

Figura 1: Panoramica schematica della procedura sperimentale. (A) Iniezione stereotassica di virus nell'mPFC. (B) Impianto della lente GRIN nell'mPFC. (C) Apposizione della base del miniscopio al cranio del topo. (D) Montaggio miniscopio e imaging del calcio in vivo . Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Componenti principali necessari per l'imaging del calcio in vivo . (A) Un obiettivo GRIN con diametro di 1 mm e lunghezza di 4,38 mm. (B) Un ago smussato da 27 G lucidato manualmente utilizzato per l'aspirazione del tessuto cerebrale. (C) Il braccio robotico accoppiato al supporto dell'ago. (D) Un cappuccio su misura da un tubo PCR per proteggere la lente GRIN esposta fino all'apposizione della base del miniscopio sul cranio del mouse. (E) Il supporto del miniscopio (base) con un dado esagonale. (F) Un miniscopio la cui parte filettata è avvolta con il nastro in PTFE. G) Un miniscopio fissato alla base con una vite di bloccaggio. H) Il braccio di tenuta del miniscopio. (I) Un controller motorizzato 3D personalizzato utilizzato per facilitare il movimento del miniscopio in posizioni XYZ. (J) Un cappuccio protettivo fissato alla base per proteggere la lente GRIN esposta mentre il mouse non esegue l'imaging del calcio in vivo . (K) Il miniscopio collegato al cavo. (L) Il sistema di acquisizione dati per l'imaging in vivo Ca² +. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Interfacce del software AutoStereota durante l'aspirazione del tessuto cerebrale strato per strato. (A) L'interfaccia corrispondente ai passaggi da 2.17.1 a 2.17.3. (B) L'interfaccia corrispondente ai passaggi da 2.17.4 a 2.17.6. (C) L'interfaccia corrispondente ai passaggi da 2.17.7 a 2.17.9. (D) L'interfaccia corrispondente ai passaggi da 2.17.10 a 2.17.12. Le caselle rosse evidenziano i valori di input. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Interfacce del software NeuView e del software di registrazione del comportamento durante l'imaging del calcio in vivo . (A) L'interfaccia di NeuView. (B,C) Le interfacce del software di registrazione del comportamento. Le caselle rosse evidenziano i pulsanti che devono essere cliccati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Mappe cellulari a fluorescenza a proiezione massima per mostrare la gamma di possibili risultati. (A,B) Imaging di calcio in vivo non riuscito che non è accettabile per la successiva analisi dei dati. (A) è scuro e contiene meno di 5 neuroni attivi. (B) è luminoso ma non ha neuroni attivi. (C) La mappa cellulare da un'immagine subottimale del calcio in vivo che contiene alcuni neuroni attivi. (D) La mappa cellulare da una buona immagine di calcio in vivo che include diverse centinaia di neuroni attivi. Barra di scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Mappa cellulare rappresentativa e transienti di calcio da un imaging di calcio in vivo di successo. Il pannello di sinistra è la mappa cellulare a fluorescenza di proiezione massima da una registrazione di imaging del calcio in vivo nell'mPFC durante un test in campo aperto. La registrazione dura 5 minuti. Il pannello di destra mostra i transienti di calcio provenienti da 15 regioni di interesse (a colori abbinati). Barra di scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Valutazione post mortem di un topo sperimentale. La valutazione post mortem per l'espressione di GCaMP6f e l'impianto della lente GRIN nell'mPFC di un topo sperimentale. L'area rettangolare indica il percorso per l'impianto della lente GRIN. L'area verde sotto la regione impiantata della lente GRIN conferma che GCaMP6f è stato espresso e la lente GRIN è stata impiantata precisamente nella regione del cervello desiderata. Cg, corteccia cingolata; PrL, corteccia prelimbica; IL, corteccia infralimbica. Barra di scala: 400 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Confronti del sistema di miniscopio su misura presso il NIDA con altri sistemi di miniscopio 7,8,9,10,11,13,25,26. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Filmato 1: Una registrazione di immagini di calcio in vivo dal mPFC del topo durante un test in campo aperto. A scopo dimostrativo, questo video mostra solo 1 minuto di registrazione. La frequenza fotogrammi di registrazione originale è di 10 fotogrammi/s. Il video è 6 volte più veloce della registrazione originale. Clicca qui per scaricare questo film.

Discussione

Una domanda centrale nelle neuroscienze è capire come le dinamiche neurali e i circuiti codificano e memorizzano le informazioni e come vengono alterate nelle malattie del cervello. Utilizzando un miniscopio in vivo Ca²⁺ sistema di imaging, l'attività neurale individuale di diverse centinaia di neuroni all'interno di un microcircuito locale può essere monitorata simultaneamente da un animale che si comporta liberamente. Qui, viene descritto un protocollo chirurgico dettagliato per l'iniezione virale e l'impianto di lenti GRIN per preparare i roditori per un cervello profondo in vivo Ca²⁺ imaging tramite un sistema di registrazione miniscopio sviluppato su misura. La tabella 1 mostra i confronti del nostro sistema miniscopio con altri sistemi miniscopi disponibili in commercio e personalizzati 7,8,9,10,11,13,25,26. Vale la pena notare che l'impianto di lenti GRIN utilizzando l'attuale protocollo chirurgico è compatibile con qualsiasi sistema di imaging a singolo fotone e due fotoni commerciale o personalizzato per un'imaging di calcio in vivo nel cervello profondo.

Dall'iniezione virale all'acquisizione dei dati del miniscopio in vivo per l'imaging del calcio, l'intera procedura sperimentale richiede almeno 2 mesi per essere completata. È un processo complicato e laborioso. Il successo finale dell'esperimento dipende da molteplici fattori, tra cui la corretta scelta dei GECI, l'iniezione di virus con precisione nell'area cerebrale mirata, una sufficiente espressione virale nella popolazione neurale desiderata, l'impianto della lente GRIN esattamente nella posizione desiderata, un adeguato recupero dagli interventi chirurgici, nonché se si verifica una grave infiammazione post-operatoria e se il comportamento dell'animale è gravemente influenzato dagli interventi chirurgici, E così via.

Due passaggi critici includono l'iniezione stereotassica del virus e l'impianto della lente GRIN. A scopo dimostrativo, la microiniezione stereotassica è stata eseguita nel mPFC del topo, con il virus adeno-associato (AAV1) che codifica GCaMP6f sotto il controllo del promotore CaMKII che etichetta selettivamente i neuroni piramidali nell'mPFC. GCaMP6f è stato scelto in quanto è uno degli indicatori di calcio più veloci e sensibili con un tempo di semidecosio di 71 ms¹⁵. Inoltre, l'espressione virale AAV di GCaMP6f è di lunga durata (cioè diversi mesi), rendendolo ideale per eseguire immagini ripetitive in vivo Ca²⁺ per un lungo periodo per studi longitudinali in modelli murini di malattie neurodegenerative²⁷. L'attuale protocollo chirurgico può essere adattato per colpire diverse popolazioni cellulari in qualsiasi altra regione del cervello. Vari strumenti virali disponibili consentono l'etichettatura selettiva di specifiche popolazioni neurali nella regione del cervello desiderata all'età desiderata. Inoltre, i ricercatori possono sfruttare il sistema di ricombinazione Cre-LoxP e vari modelli murini transgenici disponibili per effettuare modifiche genetiche e studiare l'esito dei circuiti comportamentali e neurali^28,29.

Una caratteristica unica del protocollo presentato è che l'aspirazione automatizzata del tessuto cerebrale strato per strato è stata eseguita prima dell'impianto della lente GRIN (1 mm di diametro). Ciò si ottiene attraverso un ago da 27 G collegato a un sistema di vuoto, controllato da un braccio robotico personalizzato e dal software²³. Sulla base della nostra esperienza, questo metodo genera una superficie uniforme per il contatto della lente GRIN e provoca meno danni al tessuto vicino rispetto all'aspirazione manuale del tessuto²³. Per questo motivo, questa procedura porta un ovvio vantaggio per le lenti GRIN con un diametro relativamente più ampio (ad esempio, 1 mm). Tuttavia, l'aspirazione del tessuto potrebbe non essere necessaria per impiantare una lente GRIN con un diametro inferiore (0,5 mm o 0,25 mm). Invece, può essere piantato direttamente lungo il binario principale realizzato con un ago 30 G²¹.

Oltre ai due passaggi critici discussi sopra, molti altri fattori devono essere attentamente considerati per un'operazione di successo. (1) Tutti gli strumenti che contattano il cervello devono essere sterilizzati per prevenire l'infezione. (2) Tutte le fasi chirurgiche devono essere eseguite per ridurre al minimo i danni al cervello per prevenire ulteriori infiammazioni e formazione eccessiva di tessuto cicatriziale. (3) Le dosi di anestesia somministrate inizialmente e mantenute durante l'intervento chirurgico, in particolare quelle somministrate per via intraperitoneale, devono essere attentamente considerate. Le dosi di anestesia possono essere modificate in base a diversi ceppi di topo, in quanto alcuni possono essere più suscettibili. (4) La condizione del topo deve essere costantemente monitorata durante l'intervento chirurgico. Infine, (5) i topi devono essere regolarmente monitorati dopo l'intervento chirurgico, poiché molte complicazioni possono verificarsi dopo l'intervento chirurgico.

Sebbene un pezzo di tessuto cerebrale venga rimosso unilateralmente durante la fase di impianto della lente GRIN, non abbiamo osservato alcun deficit comportamentale evidente ^7,12. Il peso del miniscopio è di circa 2 grammi e il cavo è progettato su misura per renderlo leggero e per garantire che il mouse possa facilmente trasportarlo. Il miniscopio e il cavo sono collegati all'animale solo prima dell'imaging in vivo e staccati dopo l'imaging. L'intero processo di imaging di solito non richiede più di 30 minuti. Pertanto, queste strumentazioni non impediscono al mouse di comportarsi liberamente. Le fasi di installazione e disinstallazione del miniscopio richiedono una breve anestesia (meno di 2 minuti) con isoflurano ai fini del contenimento degli animali. In genere lasciamo che il topo si riprenda dalla breve esposizione di isoflurano per 30 minuti prima di eseguire l'imaging in vivo. Abbiamo eseguito miniscope in vivo calcium imaging una volta alla settimana per alcune settimane senza notare alcun impatto sulla salute del topo e sul comportamento sociale del topo¹².

Una delle principali limitazioni dell'attuale sistema di registrazione del miniscopio è la necessità di collegare il microscopio a un cavo per l'acquisizione dei dati. La presenza del cavo a volte limita le prestazioni del compito del mouse e limita la registrazione di un animale alla volta. Recentemente, è stato sviluppato un miniscopio wireless^25,26. Ciò amplierà le prestazioni del compito e consentirà l'imaging simultaneo in vivo da più animali in un gruppo. Inoltre, lo sviluppo di GECI più sensibili con lunghezze d'onda separabili spettralmente combinate con un miniscopio a doppio colore offrirà possibilità più interessanti per la ricerca neuroscientifica.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.6mm and 1.2mm drill burrs	KF technology	8000037800	For craniotomy
27-G and 30-G needle	BD PrecisionGlide Needle	REF 305109 and REF305106	For both surgeries
45 angled forceps	Fine Science tools	11251-35	For surgeries
7.5% povidone-iodine solution (Betadine)	Purdue Products L.P.	NDC 67618-151-17	Surface disinfectant
Acetone	Sigma-Aldrich	179124-1L	GRIN lens cleaner
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539-25G	For GRIN lens implantation
Antibiotic ointment	HeliDerm Technology	81073087	For virus injection
Anti-inflamatory drug (Ibuprofen)	Johnson & Johnson Consumer Inc	30043308	Acts as pain killer after surgeries
AutoStereota	NIDA/IRP	github.com/liang-bo/autostereota	For GRIN lens implantation
Behavior Recoding Software (Point Grey FlyCap2)	Point Grey	Point Grey Research Blackfly BFLY-PGE-12A2C	For recording behavior
Brass hex nut	McMASTER-CARR	92736A112	For GRIN lens implantation
Buprenorphine	Par Pharmaceuticals	NDC 4202317905	For GRIN lens implantation
Calcium chloride	Sigma	10043-52-4	For preparing aCSF
Commutator	NIDA/IRP	Custom-designed	Component of image acquisition system
Compressed Oxygen and Caxbondioxide tank	Rocky Mountain Air Solutions	BI-OX-CD5C-K	For GRIN lens implantation
Compressed Oxygen tank	Rocky Mountain Air Solutions	OX-M-K	For virus injection
Cordless Microdrill	KF technology	8000037800	For craniotomy
Cyanoacrylate	Henkel Coorporation	# 1811182	For GRIN lens implantation
Data acquisition controller	NIDA/IRP	Custom-designed	Component of image acquisition system
Data transmission cable	NIDA/IRP	Custom-designed	Component of image acquisition system
Dental cement set	C&B Metabond and Catalyst	A00253revA306 and A00168revB306	For GRIN lens implantation
Dental cement set	Duralay	2249D	For GRIN lens implantation
Dexamethasone	VETone	NDC 1398503702	For GRIN lens implantation
Dextrose	Sigma	50-99-7	For preparing aCSF
Diet gel	Clear H20	72-06-5022	Diet Supplement for mouse
GRIN lens	GRINTECH	NEM-100-25-10-860-S	For GRIN lens implantation
Heating Pad	Physitemp Instruments LLC.	#10023	To keep the mouse body warm during surgeries
Isoflurane	VETone	V1 502017	Anesthesia
Ketamine	VETone	V1 501072	For GRIN lens implantation
Lidocaine	WEST-WARD	NDC 0143-9575-01	Local anesthesia
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	7791-18-6	For preparing aCSF
Microliter syringe (Hamilton)	Hamilton	7653-01	For virus injection
MicroSyringe Pump Controller	World Precision Instrument	#178647	For virus injection
Miniscope	NIDA/IRP	Custom-designed	For imaging
Miniscope base	Protolabs	Custom-designed	For mounting the base
Miniscope holding arm	NIDA/IRP	Custom-designed	For mounting the base
Miniscope protection cap	Protolabs	Custom-designed	For protecting the miniscope
Motorized controller	Thorlabs	KMTS50E	For mounting the base
NeuView	NIDA/IRP	https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0	For in vivo imaging
Ophthalmic ointment	Puralube Vet Ointment	NDC 17033-211-38	Ophthalmic
PCR tube	Thermo Scientific	AB-0622	For GRIN lens implantation
Pinch Clamp	World Precision Instrument	14040	For clamping the tubing
Polytetrafluoroethylene (PTFE) tape	TegaSeal PTFE Tape	A-A-58092	For fastening miniScope to the base
Potassium chloride	Sigma	7447-40-7	For preparing aCSF
Robotic arm	NIDA/IRP	Custom-designed	For GRIN lens implantation
Saline	Hospira	RL 7302	For both surgeries
Set screw	DECORAH LLC.	3BT-P9005-00-0025	For screwing the brass hex nut in miniscope base
Silicone Rubber tubing, 0.062”ID, 1/8”OD	McMaster	2124T3	For irrigation of aCSF
Sodium bicarbonate	Sigma	144-55-8	For preparing aCSF
Sodium chloride	Sigma	7647-14-5	For preparing aCSF
Sodium phosphate monobasic	Sigma	7558-80-7	For preparing aCSF
Stereotaxic stage	KOPF	Model 962 Dual Ultra Precise Small Animal Stereotaxic	For both surgeries
Sterile cotton swab	Puritan	REF 806-WC	For both surgeries
Surgical tools	Fine Science tools	11251-35	For surgeries
Suture	Sofsilk	REF SS683	For virus injection
Syringe filter (0.22 µm)	Millex	SLGVR33RS	For filtering aCSF during GRIN lens implantation
Viral suspension (AAV1-CamKII-GCamp6f)	Addgene	100834-AAV1	For virus injection
		Titre: 2.8 X 10^13 GC/ml
Xylazine	VETone	V1 510650	For GRIN lens implantation