בידוד של תאי שריר חלק אבי העורקים העיקריים הספציפיים למטופל ומדידות כיווץ חצי-קוונטיטיביות בזמן אמת במבחנה

Summary

מאמר זה מתאר שיטה מבוססת תרבית אקספלנט לבידוד וגידול של תאי שריר חלקים ראשוניים של אבי העורקים האנושיים הספציפיים לחולה ופיברובלסטים עוריים. יתר על כן, מוצגת שיטה חדשנית למדידת התכווצות תאים וניתוח לאחר מכן, אשר ניתן להשתמש בה כדי לחקור הבדלים ספציפיים לחולה בתאים אלה.

Abstract

תאי שריר חלקים (SMCs) הם סוג התא השולט במדיה אבי העורקים. המכונות החוזיות שלהם חשובות להעברת כוח באבי העורקים ומווסתות את כלי הדם ואת הרחבת כלי הדם. מוטציות בגנים המקודדים לחלבונים של מנגנון החוזה SMC קשורות למחלות אבי העורקים, כגון מפרצות אבי העורקים החזי. מדידת התכווצות SMC במבחנה היא מאתגרת, במיוחד באופן בעל תפוקה גבוהה, החיוני לסינון חומר המטופל. השיטות הזמינות כיום אינן מתאימות למטרה זו. מאמר זה מציג שיטה חדשנית המבוססת על חישת עכבה חשמלית של מצע התא (ECIS). ראשית, פרוטוקול אקספלנט מתואר כדי לבודד את ה-SMCs הראשוניים האנושיים הספציפיים למטופל מביופסיות אבי העורקים ופיברובלסטים עוריים ראשוניים אנושיים ספציפיים למטופל לצורך חקר מפרצות אבי העורקים. לאחר מכן, תיאור מפורט של שיטת כיווץ חדשה ניתן כדי למדוד את תגובת ההתכווצות של תאים אלה, כולל הניתוח הבא והצעה להשוואת קבוצות שונות. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לחקור את התכווצות התאים הדבקים בהקשר של מחקרים תרגומיים (לב וכלי דם) ומחקרי סינון חולים ותרופות.

Introduction

תאי שריר חלקים (SMCs) הם סוג התא השולט בשכבה המדיאלית של אבי העורקים, השכבה העבה ביותר של אבי העורקים. בתוך הקיר, הם מכוונים רדיאלית ומעורבים, בין שאר הפונקציות, vasoconstriction ו vasodlitation¹. מנגנון התכווצות SMC מעורב בהעברת כוח באבי העורקים באמצעות הקשר הפונקציונלי עם המטריצה החוץ-תאית². מוטציות בגנים המקודדים לחלבונים של מנגנון התכווצות SMC, כגון שרשרת כבדה של מיוזין שרירי חלק (MYH11) ואקטין שריר חלק (ACTA2), היו קשורות למקרים של מפרצות אבי העורקים החזי המשפחתי, מה שמדגיש את הרלוונטיות של התכווצות SMC בשמירה על השלמות המבנית והתפקודית של אבי העורקים ^1,2 . יתר על כן, מוטציות במסלול האיתות TGFβ קשורות גם למפרצת אבי העורקים, וניתן לחקור את השפעותיהן בפתופיזיולוגיה של מפרצת אבי העורקים גם בפיברובלסטים בעור³.

מדידת תפוקה גבוהה של התכווצות SMC במבחנה היא מאתגרת. מכיוון שלא ניתן למדוד את התכווצות ה-SMC in vivo בבני אדם, בדיקות במבחנה על תאים אנושיים מהוות חלופה אפשרית. יתר על כן, התפתחות מפרצת אבי העורקים הבטני (AAA) במודלים של בעלי חיים מושרית כימית על ידי, למשל, זלוף אלסטאז, או נגרמת על ידי מוטציה ספציפית. לכן, נתוני בעלי חיים אינם דומים להתפתחות AAA בבני אדם, שלרוב יש לה גורם רב-גורמי, כגון עישון, גיל ו/או טרשת עורקים. במבחנה התכווצות SMC נמדדה עד כה בעיקר על ידי מיקרוסקופיית כוח מתיחה ^4,5, כימות של שטפי סידן תוך תאיים פלואורסצנטיים של Fura-2⁶, ומבחני קולגן מתקתקים⁷. בעוד שמיקרוסקופיית כוח המתיחה מספקת תובנה מספרית שלא תסולא בפז לגבי הכוחות הנוצרים על ידי תא יחיד, היא אינה מתאימה לסינון בתפוקה גבוהה בשל עיבוד הנתונים המתמטי המורכבים וניתוח של תא אחד בכל פעם, כלומר לוקח זמן רב למדוד מספר מייצג של תאים לכל תורם. מבחני צבע Fura-2 וקירור קולגן מאפשרים קביעה שטחית של התכווצות ואינם נותנים תפוקה מספרית מדויקת, מה שהופך אותם לפחות מתאימים להבחנה בהבדלים ספציפיים למטופל. פגיעה בהתכווצות SMC בתאים שמקורם באבי העורקים של חולי מפרצת באבי העורקים הבטני הודגמה לראשונה על ידי אופטימיזציה של שיטה חדשנית למדידת התכווצות SMC במבחנה⁸. זה נעשה על ידי ייעוד מחדש של שיטת חישת העכבה של המצע התא החשמלי (ECIS). ECIS הוא מבחן בתפוקה בינונית בזמן אמת לכימות התנהגות התאים הדבקים והתכווצות ^9,10,11 כגון גדילה והתנהגות של SMC במבחני ריפוי ונדידה של פצעים 12,13,14. השיטה המדויקת מתוארת בסעיף הפרוטוקול. בדרך אופטימלית זו, ניתן להשתמש ב- ECIS גם כדי לחקור התכווצות פיברובלסטים בשל גודלם ומורפולוגיה דומים.

מטרת מאמר זה היא לספק תיאור מעמיק של השיטה למדידת התכווצות SMC במבחנה באמצעות ECIS⁸ והשוואת ההתכווצות בין בקרת עסקים קטנים ובינוניים למטופלים. ראשית, מוסבר הבידוד והתרבות של עסקים קטנים ובינוניים ראשוניים מביופסיות בקרה ואבי העורקים של המטופל, אשר יכולות לשמש למדידת התכווצות. שנית, מתוארים מדידות וניתוחים של התכווצות, לצד אימות ביטוי סמן SMC. יתר על כן, מאמר זה מתאר את השיטה לבידוד של פיברובלסטים עוריים ספציפיים לחולה, אשר ניתן למדוד את התכווצותם באמצעות אותה מתודולוגיה. תאים אלה יכולים לשמש למחקרים ספציפיים לחולה המתמקדים במפרצת אבי העורקים או בפתולוגיות קרדיווסקולריות אחרות¹⁵ או למחקרים פרוגנוסטיים באמצעות פרוטוקול טרנסדיפרנטיזציה המאפשר מדידת התכווצות לפני ניתוח מפרצת¹⁶.

Protocol

הערה: ביופסיות אבי העורקים התקבלו במהלך תיקון מפרצת פתוחה במרכזים הרפואיים של אוניברסיטת אמסטרדם, המרכז הרפואי של אוניברסיטת VU, אמסטרדם, זאנס מדיש צנטרום, בית החולים זאנדאם ודייקלנדר, הורן, הולנד. רקמת אבי העורקים של הבקרה התקבלה מחתיכת אבי העורקים המחוברת לעורק הכליה שנקטפה להשתלת כליה. רק חולים מעל גיל 18 נכללו, וכל המטופלים נתנו את הסכמתם מדעת להשתתף במחקר. כל החומר נאסף בהתאם לתקנות הצהרת WMA של הלסינקי ולהנחיות המוסדיות של הוועדה האתית הרפואית של המרכז הרפואי VU. כל הניסויים והפרוטוקולים הניסוייים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות ואושרו על ידי הוועדה האתית הרפואית של המרכז הרפואי VU. לקבלת מידע מלא על קווי הבקרה ותאי המטופל שבהם נעשה שימוש, עיין ב ^{- 8}.

1. בידוד עסקים קטנים ובינוניים אנושיים ראשוניים מביופסיות אבי העורקים

הערה: בצע את השלבים הבאים תחת מכסה מנוע זרימה למינרי סטרילי של תרבית רקמה. ללבוש כפפות ולהשתמש בטכניקות אספטיות סטנדרטיות בעת טיפול בדגימות דם אנושיות ורקמות אנושיות. עסקים קטנים ובינוניים מתורבתים ב-231 תווך בסיסי של תאי שריר חלק בכלי דם אנושיים בתוספת 100 פניצילין U/mL, סטרפטומיצין של 100 מיקרוגרם/מ"ל, ותוסף גדילת שרירים חלק המכונה מדיום SMC.

1. לעקר שני זוגות מלקחיים כירורגיים ואזמל על ידי טבילתם ב-70% אתנול ולאחר מכן לנגב אותם יבשים.
2. פיפט 2 מ"ל של מדיום SMC בצלחת פטרי שבה תבוצע כריתת הרקמה.
3. פיפט 2.5 מ"ל של SMC בינוני לתוך שני צלוחיות T25. סובבו את הצלוחיות כך שהנפח הקטן של המדיום יכסה את כל פני השטח.
4. להעביר את הביופסיה של דופן אבי העורקים האנושי שנקטפה מחדר הניתוח למעבדה על קרח בצינור פלסטיק סטרילי עם תמיסת העברת רקמות קרה וסטרילית (ראו טבלת החומרים) או 0.9% NaCl.
5. פתחו את הצינור עם הרקמה בתוך מכסה המנוע של תרבית הרקמה. הוציאו את הביופסיה מהצינור באמצעות המלקחיים המעוקרים והניחו אותה בצלחת פטרי (איור 1A).
6. בדקו באופן חזותי את הביופסיה כדי לזהות את שלוש השכבות של אבי העורקים, את ה-tunica intima (הפנימי), המדיה (האמצעית) והאדוונטיטיה (השכבה החיצונית). חפשו את נוכחותם של פלאקים טרשת עורקים בצד האינטימה ורקמת חיבור דקה בצד ההרפתקני (איור 1B) כדי להבחין בין השכבות.
7. כדי לבודד עסקים קטנים ובינוניים מהמדיה, הסר את שתי השכבות האחרות. הניחו תחילה את הרקמה עם רובד האינטימה בצד למעלה (איור 1B). הסר את הרובד המוצק על ידי משיכתו מהרקמה באמצעות מלקחיים תוך דחיפת הרקמה כלפי מטה עם זוג המלקחיים האחרים. הסר את השכבות הבאות של לוח עד שהשכבה המדיאלית הוורודה והאחידה נראית לעין.
8. הפוך את הרקמה (איור 1C). חזור על אותו הליך, כמו בשלב 1.7, על-ידי משיכת השכבה ההרפתקנית (איור 1D). הקפד להסיר את כל החלקים הגלויים בכמה ניסיונות שיידרשו, מכיוון ששכבה זו לא תתנתק מהתקשורת בקלות.
   הערה: חיוני להסיר כראוי את השכבות האינטימיות וההרפתקניות כדי להשיג אוכלוסיית SMC נקייה ככל האפשר.
9. לאחר בידוד השכבה המדיאלית, חותכים את הרקמה לקוביות של כ-1 מ"מ x 1 מ"מ x 1 מ"מ. לחץ את המדיה כלפי מטה עם מלקחיים וחתך את הרקמה בכיוון אחד באמצעות האזמל. אל תקצצו הלוך ושוב; לבצע חיתוכים נקיים וחד כיווניים כדי למזער נזקים. נסו ליצור כמה שיותר קוביות, בהתחשב בגודל הביופסיה (איור 1E).
10. מקם את חלקי הרקמה ברבע העליון של בקבוק T25 באמצעות המלקחיים. הניחו 10-20 קוביות לכל בקבוק אם כמות החומר מאפשרת זאת (איור 1F).
    הערה: השתמש במלקחיים חלקים כדי למזער את ההידבקות של הרקמה לצלעות המלקחיים ולנתק בקלות את הרקמה לתוך הבקבוקון.
11. דגירה של קוביות הרקמה בצלוחיות T25 למשך כ-10 ימים ב-5% CO₂ ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור.
    הערה: צמיחת תאים ראשונה צפויה בערך באותו זמן. התאים הנודדים בתחילה עשויים להיראות קטנים יותר מ-SMCs רגילים.
12. לאחר שנצפתה צמיחת התאים, הוסיפו 2.5 מ"ל של מדיום לבקבוקון, והקפידו לא לטפטף אותו על חלקי הרקמה כדי למנוע מהם להתנתק.
13. לאחר כ-5 ימים נוספים, כאשר מקבצים של תאים נצפים סביב חלקי הרקמה, משנים את מדיום התרבית. אם חתיכות טישו מתנתקות, הסר אותן מכיוון שהן לא יתחברו מחדש.
14. ברגע שהתאים נפגשים ב-80-90%, מעבירים אותם לבקבוקון T75 וממשיכים להתרבות בפורמט זה.
    הערה: מומלץ יחס מפוצל של 1:2 או 1:3. להקפיא גיבוי של התאים במעבר מוקדם. התאים בדרך כלל שומרים על תכונותיהם עד מעבר 10; אין להשתמש בקטעים מאוחרים יותר לניסויים.

2. בידוד פיברובלסטים עוריים ראשוניים מביופסיות עור

הערה: בצע את השלבים הבאים תחת מכסה מנוע זרימה למינרי סטרילי של תרבית רקמה. ללבוש כפפות ולהשתמש בטכניקות אספטיות סטנדרטיות בעת טיפול בדגימות דם אנושיות ורקמות אנושיות. פיברובלסטים מתורבתים במדיום בזלתי בתוספת 10% סרום בקר עוברי, 100 פניצילין U/mL ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, המכונה מדיום פיברובלסט.

1. לעקר שני זוגות מלקחיים כירורגיים ואזמל על ידי טבילתם ב-70% אתנול ולאחר מכן ניגובם יבש.
2. פיפטה 2 מ"ל של מדיום פיברובלסט בצלחת פטרי שבה תבוצע כריתת הרקמה.
3. פיפטה 2.5 מ"ל של מדיום פיברובלסט לשני צלוחיות T25. סובבו את הצלוחיות כך שהנפח הקטן של המדיום יכסה את כל פני השטח.
4. העבירו את ביופסיית העור שנקטפה מחדר הניתוח למעבדה על קרח בתמיסת העברת רקמות קרה וסטרילית (ראו טבלת החומרים) או 0.9% NaCl בצינור פלסטיק סטרילי.
5. פתחו את הצינור עם הרקמה בתוך מכסה המנוע של תרבית הרקמה. הוציאו את הביופסיה מהצינור באמצעות המלקחיים המעוקרים והניחו אותה בצלחת פטרי (איור 2A).
6. בדקו ויזואלית את הביופסיה כדי לזהות את שלוש שכבות העור, האפידרמיס, הדרמיס והשומן התת עורי. חפשו משטח עור מוכר, לפעמים עם שיער גלוי, כדי לזהות את האפידרמיס. בצד הנגדי, חפשו את השומן התת עורי, שהוא לעתים קרובות צהוב ורזה. זהה את השכבה שבין האפידרמיס לשומן התת-עורי כדרמיס - המקור לפיברובלסטים בני קיימא (איור 2B).
7. כדי לבודד פיברובלסטים מהדרמיס, הסירו את שתי השכבות האחרות והניחו את הרקמה על צידה כך שכל שלוש השכבות יהיו גלויות לעין.
   הערה: שלא כמו רקמת אבי העורקים, לא ניתן להפריד בין שכבות העור זו מזו; לפיכך, יש לחתוך אותם. הרקמה היא גם גומי יותר, מה שמקשה על החיתוך. השתמשו באזמל חד.
8. החזיקו את הרקמה עם מלקחיים. חותכים במקביל לגבול בין האפידרמיס לדרמיס. חותכים את כל האפידרמיס. נסו לחתוך בקו נקי אחד ואל תזוזו קדימה ואחורה כדי למנוע נזק לרקמות.
9. להפוך את הרקמה. חזור על אותו הליך כמו בשלב 2.8; הפעם, לחתוך בתוך דרמיס במקביל לגבול עם השומן התת עורי.
10. לאחר בידוד הדרמיס, חתכו את הרקמה לקוביות בערך 1 x 1 x 1 x 1 מ"מ³. לחץ את הרקמה כלפי מטה עם מלקחיים וחתך את הרקמה בכיוון אחד באמצעות האזמל. אל תקצצו הלוך ושוב; לבצע חיתוכים נקיים וחד כיווניים כדי למזער נזקים. נסו ליצור כמה שיותר קוביות, בהתחשב בגודל הביופסיה (איור 2C).
11. מקם את חלקי הרקמה ברבע העליון של בקבוק T25 באמצעות המלקחיים. הניחו 10-20 קוביות לכל בקבוק אם כמות החומר מאפשרת זאת (איור 2D).
    הערה: השתמש במלקחיים חלקים כדי למזער את ההדבקה של הרקמה לצלעות המלקחיים ולנתק בקלות את הרקמה לתוך הבקבוקון.
12. דגירה של קוביות הרקמה בצלוחיות T25 למשך כ-10 ימים ב-5% CO₂ ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור.
    הערה: צמיחת התאים הראשונה צפויה בערך אז. התאים הנודדים בתחילה עשויים להיראות קטנים יותר מפיברובלסטים רגילים.
13. לאחר שנצפתה צמיחת התאים, הוסיפו 2.5 מ"ל של מדיום לבקבוקון, והקפידו לא לטפטף אותו על חלקי הרקמה כדי למנוע מהם להתנתק.
14. לאחר כ -5 ימים נוספים, כאשר ניתן לראות אשכולות של תאים סביב חלקי הרקמה, לשנות את מדיום התרבית. אם חתיכות טישו מתנתקות, הסר אותן מכיוון שהן לא יתחברו מחדש.
15. ברגע שהתאים נפגשים ב-80-90%, מעבירים אותם לבקבוקון T75 וממשיכים להתרבות בפורמט זה.
    הערה: מומלץ יחס מפוצל של 1:2 או 1:3. להקפיא גיבוי של התאים במעבר מוקדם. התאים בדרך כלל שומרים על תכונותיהם עד מעבר 10; אין להשתמש בקטעים מאוחרים יותר לניסויים.

3. מדידת התכווצות (דוגמה לעסקים קטנים ובינוניים)

1. הכינו מערך ECIS של 96w10e (ראו איור 3A לתמונה מייצגת של המערך עם אלקטרודות מוגדלות ותאים שנזרעו על האלקטרודות).
   הערה: בצע את השלבים הבאים תחת מכסה מנוע זרימה למינרי סטרילי של תרבית רקמה.
   1. מצפים מערך סטרילי של 96w10e עם 200 μL של 10 mM L-ציסטאין לבאר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
   2. שטפו את הצלחת פעמיים במים סטריליים. תנו לצלחת להתייבש למשך הלילה במכסה הרקמה עם המכסה מעט פתוח.
      הערה: ציפוי הצלחת ב- L-ציסטאין נחוץ רק בעת שימוש בצלחת בפעם הראשונה.
   3. למחרת, צלחת ומכסה לעקר UV במשך 30 דקות. סובבו את המכסה כלפי מעלה כך שהחלק הפנימי מעוקר. לאחר עיקור הצלחת, אין לפתוח את הצלחת מחוץ למכסה המנוע.
2. זריעת תאים במערך ECIS
   1. תמיסת ג'לטין סטרילית מלפני חימום 1% באמבט המים למשך 30 דקות.
      הערה: התמיסה מאוחסנת במקרר ועלולה להתמצק, מה שמקשה על פיפטה.
   2. לאחר מכן, מצפים את הבארות עם 100 μL של תמיסת ג'לטין 1% לכל באר ודגירה את הצלחת ב 37 °C (64 °F) למשך שעה אחת לפחות.
   3. לשאוף את הג'לטין מהבארות.
   4. ספרו את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי וזרעו את ה-SMCs במשולש בצפיפות זריעה של 30,000 תאים/באר ב-200 μL של מדיום SMC.
   5. מניחים את הצלחת עם ה-SMCs לתוך מחזיק הבאר ECIS 96 בחממת תרביות התאים. לחץ פעמיים על תוכנת ECIS Applied Biophysics כדי לפתוח את התוכנית וללחוץ על כפתור ההתקנה .
   6. בדוק אם לכל האלקטרודות יש מגע עם המחזיק (ירוק; אדום אם אין חיבור) בלוח התחתון השמאלי שכותרתו תצורת Well. אם האלקטרודות אינן מחוברות כראוי, התאם את הלוחית במחזיק לפני תחילת המדידה.
   7. בחר את סוג הלוח (מערך 96 בארות) באותו פאנל על-ידי לחיצה על סוג מערך.
   8. בהגדרת איסוף הנתונים של הלוח העליון הימני, לחץ על תדר יחיד ושנה את ערך העכבה ל - 4000 הרץ ואת המרווח ל - 8 שניות.
   9. לחץ על לחצן התחל כדי להתחיל מדידות. המתן עד שייפתח פאנל חדש, שבו ניתן לשמור את קובץ ה- ECIS.
   10. אפשרו לתאים להתחבר ולהקים חד שכבתי במשך 48 שעות.
       הערה: החיבור וההתפשטות של תאים על האלקטרודות יוצרים ערך התנגדות בסיסי (איור 3B).
3. גירוי של תאים כדי לגרום להתכווצות
   1. לגרום להתכווצות SMC על ידי גירוי התאים עם 10 מיקרוגרם /מ"ל של יונופור סידן, יונומיצין.
      הערה: Ionomycin יגרום לזרם של Ca²⁺ חוץ-תאי, ויפעיל את מפל ההתכווצות; ראו איור 4A לתמונות מייצגות של תאים מכווצים שאינם מגורה ומעוררים.
   2. יש לדלל 1 מ"ג של אבקת יונומיצין ב-100 μL של דימתיל-סולפוקסיד כדי ליצור תמיסת מלאי של 10 מ"ג/מ"ל, ולאחסן 10 μL aliquots בטמפרטורה של -20°C. לפני השימוש, יש לדלל את תמיסת היונומיצין 1:10 במדיום SMC כדי להכין את תמיסת העבודה שתתווסף לתאים.
   3. בצע את גירוי התא כאשר המערך עדיין נמצא במערך בתוך חממת תרביות התאים והאלקטרודות מחוברות למערכת.
      1. כדי לעורר את התאים, להסיר את המכסה ולהניח אותו על משטח סטרילי בתוך האינקובטור. הכינו שתי פיפטות, ברזולוציה של 2 μL ו-150 μL.
      2. לפני שתתחיל את הגירוי, לחץ על מארק בתוכנה והנח הערה.
         הערה: פעולה זו תקל על מציאת התזמון המדויק של הגירוי בעת ניתוח הנתונים.
      3. פיפט 2 μL של תמיסת העבודה של היונומיצין לתוך כל באר במהירות האפשרית. לאחר שכל התאים היו מגורה, ערבבו את המדיום בבארות באמצעות הפיפטה השנייה.
         הערה: בשל ההשפעות המהירות, אין צורך לשנות עצות בין קווי תאים שונים ותנאים שונים. לעבוד במהירות תוך כדי גירוי וערבוב כי ionomycin יש השפעה חריפה. בעת גירוי צלחת מלאה, לעורר מקסימום של 3 עמודים בבת אחת. לאחר כל גירוי, המתן לפחות 30 דקות עד לגירוי הבא כדי לאפשר לתאים להתאושש מהטמפרטורה ושינוי ה- CO₂ שנגרם על ידי פתיחת דלת האינקובטור.
      4. מיד לאחר סיום הגירוי, לחץ שוב על מארק כדי להוסיף הערה שהגירוי נעשה.
   4. סיום ניסוי הגירוי
      1. רשום את ערכי העכבה במשך כ-5 דקות לאחר גירוי היונומיצין. סיים את ההקלטה על-ידי הקשה על סיום.
      2. השתמש שוב במערכי ECIS עד שלוש פעמים: לשטוף את הבארות פעמיים עם מים סטריליים, ולדגום את הצלחת ב 37 °C (74 °F) במשך 2-3 שעות עם טריפסין או מגיב דומה. חזור על שלבים 3.1.2 ו- 3.1.3.
4. ייצוא הנתונים
   1. כדי לייצא את הנתונים, לחץ על קובץ | ייצוא נתונים | ל- Excel (נבחר). בחר תיקיה לשמירת הקובץ.
   2. לחץ על הפרד כאשר התוכנית מבקשת לשלב או להפריד גליונות.
5. ניתוח פלט ההתכווצות
   1. כדי לחשב את תגובת ההתכווצות, השתמש במשוואה הבאה (1), כאשר C מציין כיווץ (המבוטא באחוזי שינוי בהשוואה לנקודת ההתחלה), פרסטימולציה (PrS) מציינת את ערך ההתנגדות (המבוטא Ω) ממש לפני גירוי יונומיצין ולאחר גירוי (PoS) מציין את ההתנגדות (המתבטאת Ω) 2 דקות לאחר סיום הגירוי.
      (1)
      הערה: כפי שמוצג במשוואה (1), ערך העכבה של מדיום תרבית מלא היטב ללא תאים מחוברים (ערך של 290 Ω) מופחת מכל התוצאות בחישוב הסופי. מומלץ למדוד תגובות התכווצות במשולש בכל ניסוי ולבצע שלושה ניסויים עצמאיים עם אותו קו תאים כדי להסביר כל וריאציה בין-ניסויית ותוך-ניסיונית.
   2. לאחר ביצוע שלושת הניסויים הבלתי תלויים, קבץ את הנתונים יחד על ידי חישוב הממוצע של שלוש המדידות, כולל סטיית התקן (SD).
6. השוואת קבוצות שונות
   1. כדי להגדיר את טווח ההתכווצות הנורמלית ולחקור את שאלות המחקר הספציפיות הבאות, השתמש בקבוצת הביקורת כדי להגדיר "התכווצות נורמלית" ולהשוות אותה לתגובת ההתכווצות של המטופלים או קבוצות הטיפול.
   2. חשב את הממוצע וה-SD של כל קבוצת הביקורת, כלומר של ערכי הקצה עבור כל קווי התאים, כמתואר בשלב 3.5.2.
   3. השתמש בטווח של הממוצע ± 2SD כדי לזהות תאים בקבוצה השנייה שנמצאים מחוץ לטווח זה, מה שמצביע על כך שיש להם תגובת התכווצות שונה.
      הערה: המנגנון העומד מאחורי תגובת ההתכווצות שהשתנה כפוף לשאלות מחקר ספציפיות והוא תלוי בתאים ובתנאים ולא יידון בפרוטוקול זה.

4. זיהוי נוכחות של סמנים ספציפיים ל- SMC

1. בידוד RNA
   1. זרעו את אותם קווי תאים ספציפיים לחולה המשמשים למדידות התכווצות בצלחות של 6 בארות, באר אחת לכל קו תא. ספרו את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי וזרעו את התאים בצפיפות זריעה של 200,000 תאים/באר במדיום SMC ואפשרו להם להתחבר למשך הלילה.
   2. לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS סטרילי.
   3. לבודד את התאים ולבודד את התאים על פי הוראות היצרן.
2. סינתזת cDNA
   1. בצע סינתזת cDNA ב-20 μL של תערובת תגובות שעתוק הפוכה. לדלל את הריכוזים של סך הרנ"א המבודד על פי ההוראות שסופקו על ידי היצרן.
3. qPCR
   1. מדוד את ביטוי הגנים של גנים של סמן SMC, למשל, ACTA2, CNN1, SMTN ו - TAGLN כדי לאשר שהתאים המבודדים הם אכן SMCs ולזהות סמני SMC. בדוק את המתאם של התוצאות עם פלט התכווצות.
   2. השתמש לפחות בשני גנים של משק בית כדי לנרמל את הנתונים, למשל, YWHAZ ו - TBP.
      הערה: ניתן לבצע את הריצה והניתוח של qPCR באמצעות מכונות PCR שונות ותוכנות תואמות, בהתאם למה שזמין וממוטב במעבדה. ראה טבלה משלימה S1 עבור רצפי פריימרים.

תוצאות

כדי לבדוק את יכולת השכפול של שיטה זו, השיטה אומתה לראשונה באמצעות SMCs בקרה בלבד. כדי לקבוע את יכולת השכפול של מדידה בין-ניסיונית, שתי מדידות בלתי תלויות של כל קווי השליטה ותאי המטופל הכלולים הותוו כעלילה של בלנד-אלטמן (איור 3B). העלילה הראתה כי שיטה זו אינה מראה שונות מחוץ למרו?...

Discussion

מאמר זה מציג שיטה למדידת התכווצות SMC במבחנה, בהתבסס על השינויים בעכבה ובעיסוק פני השטח. ראשית, מתואר הבידוד, התרבות וההתרחבות של עסקים קטנים ובינוניים אנושיים ראשוניים ספציפיים למטופל ופיברובלסטים של העור, ולאחר מכן כיצד להשתמש בהם למדידות התכווצות.

מגבלה של המחקר קשו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well Array	Applied Biophysics	96W10idf PET	Array used to measure contraction in the ECIS setup
Custodiol	Dr. Franz Höhler Chemie GmbH	RVG 12801	Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	472301	Solution used to dilute ionomycin
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140079	Addition to cell culture medium
Ham's F-10 Nutrient Mix	Gibco	11550043	Medium used to culture skin fibroblasts
Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium (formerly ''Medium 231'')	Gibco	M231500	Medium used to culture smooth muscle cells
Invitrogen countess II	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000	Automated cell counter
Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatus	Sigma-Aldrich	I0634-1MG	Compound used for contraction stimulation
NaCl 0.9%	Fresenius Kabi	B230561	Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Antibiotics used for cell culture medium
Phospathe buffered saline	Gibco	10010023	Used to wash cells
Quick-RNA Miniprep Kit	Zymo Research	R1055	Kit used for RNA isolation
Smooth Muscle Growth Supplement (SMGS)	Gibco	S00725	Supplement which is added to smooth muscle cell culture medium
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit	Thermo Fisher Scientific	11754250	Kit used for cDNA synthesis
SYBR Green PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4309155	Reagent for qPCR
Trypsin-EDTA	Gibco	15400-054	Used to trypsinize cells
ZTheta	Applied Biophysics	ZTheta	ECIS instrument used for contraction measurements