原発性患者特異的大動脈平滑筋細胞の単離とインビトロでの半定量的リアルタイム収縮測定

要約

本稿では、初代患者特異的なヒト大動脈平滑筋細胞および皮膚線維芽細胞を単離および培養するための外植培養ベースの方法について説明する。さらに、細胞収縮の測定およびその後の分析のための新規な方法が提示され、これはこれらの細胞における患者特異的な差異を研究するために使用することができる。

要約

平滑筋細胞(SMC)は、大動脈媒体における優勢な細胞型である。それらの収縮機構は、大動脈における力の伝達に重要であり、血管収縮および血管拡張を調節する。SMC収縮装置タンパク質をコードする遺伝子の変異は、胸部大動脈瘤などの大動脈疾患と関連している。SMC収縮を インビトロ で測定することは、特にハイスループット方式で困難であり、これは患者材料をスクリーニングするために不可欠である。現在利用可能な方法は、この目的には適していません。本稿では、電気セル基板インピーダンスセンシング(ECIS)に基づく新しい方法を提示する。まず、大動脈瘤の研究のために、大動脈生検および患者特異的ヒト原発性皮膚線維芽細胞から患者特異的ヒト原発性SMCを単離するための外植プロトコルが記載されている。次に、これらの細胞の収縮応答を測定するための新しい収縮方法の詳細な説明が与えられ、その後の分析および異なるグループを比較するための提案を含む。この方法は、翻訳(心臓血管)研究および患者および薬物スクリーニング研究の文脈における接着細胞の収縮を研究するために使用することができる。

概要

平滑筋細胞(SMC)は、大動脈内側層、大動脈の最も厚い層における優勢な細胞型である。壁内では、それらは放射状に配向しており、他の機能の中でも特に、血管収縮および血管拡張^{に関与する1}。このSMC収縮機構は、細胞外マトリックス²との機能的リンクを介して大動脈における力の伝達に関与している。平滑筋ミオシン重鎖(MYH11)および平滑筋アクチン(ACTA2)などのSMC収縮装置のタンパク質をコードする遺伝子の変異は、家族性胸部大動脈瘤の症例に関連しており、大動脈の構造的および機能的完全性の維持におけるSMC収縮の関連性を強調している^1,2.さらに、TGFβシグナル伝達経路の変異は大動脈瘤とも関連しており、大動脈瘤の病態生理におけるそれらの効果も皮膚線維芽細胞3において研究^{することができる。}

インビトロでのSMC収縮のハイスループット測定は困難です。SMCの収縮性はヒトのインビボでは測定できないため、ヒト細胞に対するインビトロアッセイは実現可能な代替手段を提示します。さらに、動物モデルにおける腹部大動脈瘤(AAA)の発生は、例えばエラスター....

プロトコル

注:大動脈生検は、アムステルダム大学医療センター、VU大学医療センター、アムステルダム、ザーンメディッシュセントラム、ザーンダムおよびダイクランダー病院、ホールン、オランダで開腹動脈瘤修復中に得られた。コントロール大動脈組織は、腎臓移植のために採取した腎動脈に付着した大動脈の小片から得た。18歳以上の患者のみが含まれ、すべての患者が研究に参加するインフォームドコンセントを与えた。すべての資料は、ヘルシンキのWMA宣言の規制およびVU医療センターの医療倫理委員会の機関ガイドラインに従って収集されました。すべての実験および実験プロトコールは、施設のガイドラインに従って実施され、VU医療センターの医療倫理委員会によって承認された。使用される対照および患者細胞株に関する完全な情報については、 ⁸を参照されたい。

1. 大動脈生検から原発性ヒトSMCを単離する

メモ: 滅菌組織培養層流フードの下で次の手順を実行します。手袋を着用し、ヒトの血液およびヒト組織サンプルを取り扱う際には、標準的な無菌技術を使用してください。SMCは、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、および SMC培地と呼ばれる平滑筋成長サプリメントを添加した231ヒト血管平滑筋細胞基礎培地で培養される。

1. 2組....

結果

この方法の再現性をテストするために、この方法は最初に制御SMCのみを使用して検証されました。実験間測定再現性を決定するために、全ての含まれた対照細胞株および患者細胞株の2つの独立した測定値をBland-Altmanプロットとしてプロットした(図3B)。プロットは、この方法が1つの外れ値細胞株を除いて、信頼区間外の変動性を示さないことを実証した。さらに、これ?.......

ディスカッション

本稿では、インピーダンスと表面占有の変化に基づいて、 SMC収縮をin vitroで測定する方法を提示する。まず、患者固有の初代ヒトSMCおよび皮膚線維芽細胞の単離、培養、および拡大について説明し、続いて収縮測定にそれらを使用する方法を説明する。

この研究の限界は、外植プロトコルを介して細胞を得ることに関連している。生検から増殖する細胞は、 ?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well Array	Applied Biophysics	96W10idf PET	Array used to measure contraction in the ECIS setup
Custodiol	Dr. Franz Höhler Chemie GmbH	RVG 12801	Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	472301	Solution used to dilute ionomycin
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140079	Addition to cell culture medium
Ham's F-10 Nutrient Mix	Gibco	11550043	Medium used to culture skin fibroblasts
Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium (formerly ''Medium 231'')	Gibco	M231500	Medium used to culture smooth muscle cells
Invitrogen countess II	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000	Automated cell counter
Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatus	Sigma-Aldrich	I0634-1MG	Compound used for contraction stimulation
NaCl 0.9%	Fresenius Kabi	B230561	Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Antibiotics used for cell culture medium
Phospathe buffered saline	Gibco	10010023	Used to wash cells
Quick-RNA Miniprep Kit	Zymo Research	R1055	Kit used for RNA isolation
Smooth Muscle Growth Supplement (SMGS)	Gibco	S00725	Supplement which is added to smooth muscle cell culture medium
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit	Thermo Fisher Scientific	11754250	Kit used for cDNA synthesis
SYBR Green PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4309155	Reagent for qPCR
Trypsin-EDTA	Gibco	15400-054	Used to trypsinize cells
ZTheta	Applied Biophysics	ZTheta	ECIS instrument used for contraction measurements