מינוף סריקת מיקרו-CT לניתוח אינטראקציות טפיליות בין צמח למארח

Summary

Micro-CT הוא כלי לא הרסני שיכול לנתח מבנים צמחיים בתלת מימד. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הכנת הדגימה כדי למנף מיקרו-CT לניתוח מבנה ותפקוד צמחים טפיליים. מינים שונים משמשים כדי להדגיש את היתרונות של שיטה זו בשילוב עם תכשירים ספציפיים.

Abstract

סריקת מיקרו-CT הפכה לכלי מבוסס בחקירת מבנה ותפקוד הצמח. טבעו הלא הרסני, בשילוב עם האפשרות של הדמיה תלת מימדית וחתך וירטואלי, איפשר ניתוח חדשני ומפורט יותר ויותר של איברי צמח מורכבים. ניתן לחקור גם אינטראקציות בין צמחים, כולל בין צמחים טפיליים לפונדקאים שלהם. עם זאת, הכנת הדגימה לפני הסריקה הופכת להיות קריטית בשל האינטראקציה בין צמחים אלה, אשר לעתים קרובות שונים בארגון הרקמה ובהרכבה. יתר על כן, יש לקחת בחשבון את המגוון הרחב של צמחים פורחים טפיליים, החל מגופי צומח מצומצמים מאוד ועד עצים, עשבי תיבול ושיחים, במהלך הדגימה, הטיפול וההכנה של חומר פונדקאי טפיל. כאן מתוארות שתי גישות שונות להחדרת תמיסות ניגוד לטפיל ו/או לצמחים פונדקאים, תוך התמקדות בניתוח האוסטוריום. איבר זה מקדם חיבור ותקשורת בין שני הצמחים. בעקבות גישה פשוטה, ניתן לחקור פרטים על ארגון רקמת האוסטוריום באופן תלת-ממדי, כפי שמוצג כאן עבור מינים טפיליים של אופיטואידים, גפנים ודבקונים. בחירת חומרי ניגוד ספציפיים וגישות יישום מאפשרות גם תצפית מפורטת על התפשטות אנדופרזיט בגוף הפונדקאי ואיתור קשר ישיר בין כלי דם לכלי דם בין טפיל לפונדקאי, כפי שמוצג כאן עבור טפיל שורש מחייב. לפיכך, ניתן ליישם את הפרוטוקול הנדון כאן על המגוון הרחב של צמחים פורחים טפיליים כדי לקדם את הבנת התפתחותם, מבנהם ותפקודם.

Introduction

טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת של קרני רנטגן ברזולוציה גבוהה (micro-CT) היא שיטת הדמיה שבה צילומי רנטגן מרובים (הקרנות) של דגימה נרשמים מזוויות צפייה שונות ומשמשים מאוחר יותר כדי לספק שחזור וירטואלי של המדגם¹. לאחר מכן ניתן לנתח, לתפעל ולפלח אובייקט וירטואלי זה, המאפשר חקירה לא הרסנית בשלושה ממדים². מיקרו-CT, שתוכנן בתחילה עבור ניתוחים רפואיים ומאוחר יותר עבור יישומים תעשייתיים, מציע גם את היתרון של הדמיה של איברים פנימיים ורקמות ללא צורך בהליכים פולשניים³. כמו צורות אחרות של הדמיה, מיקרו-CT עובד עם פשרה בין שדה הראייה לגודל הפיקסל, מה שאומר שהדמיה ברזולוציה גבוהה של דגימות גדולות היא כמעט בלתי מושגת⁴. התקדמות בשימוש במקורות רנטגן עתירי אנרגיה (כלומר, סינכרוטרון) והגדלה אופטית משנית נעשים כל הזמן, ומאפשרים לרזולוציה הקטנה ביותר להגיע מתחת ל -100 ננומטר ^5,6. עם זאת, זמני סריקה ארוכים יותר נחוצים עבור דגימות גדולות, מה שמגדיל את הסיכוי לממצאים עקב תנועת הדגימה או עיוות בתוך הסורק. יתר על כן, מיקרו-CT מוגבל בדרך כלל על ידי שינויים בצפיפות הטבעית בתוך הדגימה וכיצד הדגימה מתקשרת עם קרני רנטגן. בעוד שמינון גבוה יותר של קרני רנטגן הוא הטוב ביותר לחדירה לדגימות צפופות יותר, הוא פחות יעיל בלכידת שינויים בצפיפות בתוך ובין הדגימה לבין המדיום הסובב אותה⁷. מצד שני, מינון רנטגן נמוך יותר מציע פחות כוח חדירה ולעתים קרובות דורש זמני סריקה ארוכים יותר אך רגישות רבה יותר בזיהוי צפיפות⁷.

הגבלות אלה הקשו זה מכבר על השימוש במיקרוטומוגרפיה למדעי הצמח, בהתחשב בכך שרוב רקמות הצמח מורכבות מרקמה קלה (לא צפופה) עם ספיגת רנטגן נמוכה⁸. היישומים הראשונים של מיקרו-CT התמקדו במיפוי רשתות שורשים בתוך מטריצת הקרקע ^9,10. מאוחר יותר, מבנים צמחיים עם הבדלים משמעותיים יותר בצפיפות הרקמות, כגון עץ, החלו להיחקר. זה איפשר חקירות של פונקציונליות xylem^11,12, פיתוח של ארגוני רקמות מורכבים 13,14, ואינטראקציות בין צמחים^15,16,17. ניתוח רקמות רכות והומוגניות הופך נפוץ בשל חומרי ניגוד, שהם כיום הליך סטנדרטי בהכנות לסריקת מיקרו-CT של דגימות צמחים. עם זאת, פרוטוקולים להצגת ניגודיות יכולים לקבל תוצאות שונות בהתאם לנפח הדגימה, המאפיינים המבניים וסוג התמיסה שבה נעשה שימוש⁸. באופן אידיאלי, חומר הניגוד צריך לשפר את ההבחנה בין רקמות שונות, לאפשר הערכת פונקציונליות רקמות/איברים, ו / או לספק מידע ביוכימי על רקמה¹⁸. לכן, טיפול מדגימה נאות, הכנה והרכבה לפני הסריקה הופכים קריטיים לכל ניתוח מיקרו-CT.

מיקרו-CT של הצמח הטפילי haustorium
צמחים פורחים טפיליים מייצגים קבוצה פונקציונלית מובחנת של אנגיוספרמים המאופיינת על ידי איבר המכונה haustorium¹⁹. איבר רב-תאי זה, הכלאה התפתחותית בין גבעול שעבר שינוי לבין שורש, פועל על התקשרות, חדירה ומגע של הפונדקאי על ידי טפיל²⁰. מסיבה זו, האוסטוריום נחשב כ"מגלם את עצם הרעיון של טפילות בקרב צמחים"²¹. הבנה מפורטת של התפתחותו, מבנהו ותפקודו של איבר זה חיונית לאקולוגיה של צמחים טפיליים, אבולוציה ומחקרי ניהול. אף על פי כן, המורכבות הכוללת של צמחים טפיליים והמבנה והאוסטוריה המשופרים מעכבים לעתים קרובות ניתוח מפורט והשוואה. קשרי האוסטוריום הם גם בדרך כלל נרחבים ואינם הומוגניים בהתפלגות הרקמות והתאים (איור 1). בהקשר זה, בעוד שעבודה עם שברי רקמות קטנות מאפשרת מניפולציה קלה יותר ורזולוציה גבוהה יותר, היא עלולה להוביל למסקנות שגויות לגבי הארכיטקטורה התלת-ממדית של מבנים מורכבים, כגון האוסטוריום הצמחי הטפילי.

אף על פי שקיימת ספרות ענפה על אנטומיה של האוסטרויום ומבנה העל עבור רוב מיני הצמחים הטפיליים, הארגון התלת-ממדי והקשר המרחבי בין טפיל לרקמות פונדקאי עדיין נחקרים בצורה גרועה¹⁷. בעבודה שנערכה לאחרונה על ידי Masumoto et ^al.22, יותר מ-300 קטעי מיקרוטום סדרתיים דקים למחצה צולמו ושוחזרו לאובייקט וירטואלי תלת-ממדי המייצג את האוסטוריום של שני מיני טפילים. רמת הפירוט המצוינת של שיטה זו מספקת תובנות חסרות תקדים על המבנה התלת-ממדי התאי והאנטומי של האוסטויום. עם זאת, טכניקה כזו הגוזלת זמן רב תאסור ניתוח דומה בטפילים עם קשרים נרחבים יותר של האוסטוריום. השימוש במיקרו-CT מתגלה ככלי מצוין לניתוח תלת-ממדי של צמחים טפיליים מורכבים ולעתים קרובות מגושמים. למרות שאינו מהווה תחליף לחתכים אנטומיים מפורטים וצורות משלימות אחרות של ניתוח מיקרוסקופיה^17,23, תוצאות המתקבלות באמצעות סריקת מיקרו-CT, במיוחד עבור דגימות גדולות, יכולות לשמש גם כמדריך לכוון את תת-הדגימה של מקטעים קטנים יותר, אשר לאחר מכן ניתן לנתח באמצעות כלים אחרים, כגון מיקרוסקופ קונפוקלי ואלקטרונים^, או לנתח מחדש עם מערכות מיקרו-CT ברזולוציה גבוהה.

איור 1: צמחים טפיליים מקבוצות פונקציונליות שונות שמשתמשים בהם בפרוטוקול הזה. טפיל Euphytoid Pyrularia pubera (A), endoparasite Viscum minimum (B) עם פירות ירוקים (עיגול שחור מקווקו), גפן טפילית Cuscuta americana (C), דבקון Struthanthus martianus (D), טפיל שורש מחייב Scybalium fungiforme (E). מקטעים של שורש הפונדקאי (Hr) או הגבעול (Hs) מאפשרים את יישום הניגוד לתוך הטפיל haustorium (P). הימצאות שורש אם/גבעול הטפיל (חיצים) בדגימה מאפשרת ניתוח של ארגון כלי האוסטוריום. מלבנים מציינים מקטעים של המדגם המשמשים לניתוח. פסי קנה מידה = 2 ס"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

ככל שמיקרו-CT הופך לטכניקה פופולרית יותר ויותר במדעי הצמח, ישנם מדריכים, פרוטוקולים וספרות העוסקים בסריקת דגימות, שחזור תלת מימדי, סגמנטציה וניתוח ^3,10,24. לפיכך, צעדים אלה לא יידונו כאן. כמו בכל טכניקת דמיון, טיפול מתאים והרכבה של דגימות הם בסיסיים, אם כי לעתים קרובות להיות הליך התעלמות. מסיבה זו, פרוטוקול זה מתמקד בהכנת דגימות haustorium עבור סריקת micro-CT. באופן ספציפי יותר, פרוטוקול זה מתאר שתי גישות להחדרת חומרי ניגוד לדגימות האוסטוריום כדי לשפר את ההדמיה של רקמות וסוגי תאים שונים בהאוסטוריום, להקל על זיהוי רקמות טפיליות בתוך השורש/גזע הפונדקאי, ולנתח קשרי כלי דם בין טפיל למארח בשלושה ממדים. ההכנות המתוארות כאן יכולות להיות מותאמות גם לניתוח של מבני צמחים אחרים.

חמישה מינים שימשו כדי להמחיש טוב יותר את הנוחות של הפרוטוקול המתואר כאן. כל מין מייצג אחת מחמש הקבוצות הפונקציונליות של צמחים פורחים טפיליים, ובכך מתייחס לנקודות ספציפיות הקשורות לפונקציונליות של כל קבוצה. Pyrularia pubera (Santalaceae) נבחר לייצג טפילים אופיטואידים, הנובטים באדמה ויוצרים מספר אוסטוריה המחברים את הטפיל לשורשי פונדקאיו²⁵ . האוסטוריה שנוצרת על-ידי הצמחים האלה היא לעתים קרובות רופפת ונקרעת בקלות מהפונדקאי²⁶ (איור 1A), ולכן דורשת תהליך טיפול עדין יותר. אנדופרזיטים מיוצגים כאן על ידי Viscum minimum (Viscaceae). מינים בקבוצה הפונקציונלית הזו נראים רק מחוץ לגוף המארחים שלהם לפרקי זמן קצרים (איור 1B), וחיים את רוב מחזורי החיים שלהם כגדילי תאים מופחתים ודמויי תפטיר שמוטבעים בתוך רקמות מארחות²⁵. קבוצה פונקציונלית שלישית כוללת גפנים טפיליות, שנובטות על הקרקע אך יוצרות שורשים בסיסיים בלבד, תוך הסתמכות על הוסטוריה מרובה שמתחברת לגבעולים של צמחים פונדקאים²⁵ (איור 1C). כאן, קבוצה פונקציונלית זו מיוצגת על ידי Cuscuta americana (Convolvulaceae). בניגוד לגפנים טפיליות, דבקונים נובטים ישירות על ענפי הצמחים המארחים שלהם ומפתחים אוסטוריה מרובה או בודדת²⁵. המין שנבחר כדי להמחיש את הקבוצה הפונקציונלית הזו הוא Struthanthus martianus (Loranthaceae), אשר יוצר קשרים שונים עם הענף המארח (איור 1D). ניתוח של דבקון בודד באמצעות שילוב של מיקרו-CT ומיקרוסקופ אור ניתן למצוא ב Teixeira-Costa & Ceccantini¹⁷. לבסוף, טפילי שורש חייבים הם מינים הנובטים על הקרקע וחודרים לשורשי הצמחים המארחים, שבהם הם תלויים לחלוטין משלבי הצמיחה המוקדמים ביותר²⁵ . הצמחים האלה מיוצגים כאן על-ידי פטריות סקיבליום (Balanophoraceae), שמייצרות אוסטוריה גדולה דמוית פקעת (איור 1E).

כל דגימות הצמחים ששימשו בפרוטוקול זה תוקנו באלכוהול של 70% חומצה אצטית פורמלית (FAA 70). הקיבוע בעת הדגימה חיוני לשימור רקמות הצמח, במיוחד אם יש צורך בניתוחים אנטומיים עוקבים. במקרה של האוסטורימה צמחית טפילית, קיבוע הוא גם חיוני, כמו איבר זה מורכב לעתים קרובות בעיקר של תאי parenchyma non-lignified²⁰. פרוטוקולים מפורטים לקיבוע רקמות צמחים, כולל הכנת תמיסות קיבוע, ניתן למצוא במקום אחר²⁷. מצד שני, במידה רבה יותר או פחות, קיבועים יכולים לגרום לשינויים בתכונות הפיזיקליות והכימיות של הדגימה, מה שהופך אותה ללא מתאימה לניתוחים ביומכניים והיסטוכימיים ספציפיים. לכן, דגימות טריות, כלומר, חומר לא קבוע שנאסף מיד לפני ההכנה, יכול לשמש גם עם פרוטוקול זה. פרטים על אופן הטיפול בדוגמאות טריות והצעות לפתרון בעיות עבור חומר מקובע מופיעים בסעיף הדיון.

Protocol

1. בחירת דגימת צמחים טפיליים

1. אספו את כל האוסטוריום של הצמח הטפילי, כולל הגבעול/שורש הפונדקאי המצורף ומקטעים של שני הקצוות הפרוקסימליים והדיסטליים של האיבר המארח הטפילי; האורך האידיאלי של כל קטע שווה להכפיל את קוטר האוסטוריום.
   הערה: עבור האוסטוריה לטרלית, כלול חלק מגבעול/שורש האם של הטפיל שממנו נוצר ההאוסטוריום (איור 1A,B,D). עבור אנדופרזיטים, אספו מקטע של הגבעול/שורש הפונדקאי שבו נראים סימנים של הטפיל (איור 1B). במקרה של חיבורי טרמינל, יש לאסוף את כל הצמח (איור 1E).
2. השקיעו את כל הדגימה בתמיסה מקבעת (לדוגמה, FAA) ביחס נפחי של 1:10 (מדגם: קיבוע). השאירו דגימות בקיבוע לפחות יום אחד, בהתאם לגודל המדגם²⁷.
   הערה: ניתן לאחסן דגימות בקיבוע לפני הסריקה או להעביר אותן לתמיסה משמרת (למשל, אתנול 70%). ניתן להשתמש בדגימות טריות גם אם הניתוח האנטומי הבא אינו מוצדק (ראה סעיף דיון). אם עובדים עם חומר טרי, להגדיר את המנגנון עבור זילוח של פתרון ניגודיות, ולאחר מכן לאסוף את המדגם. אין לתת לדגימה להתייבש.

2. יישום פתרונות מנוגדים

1. בחר את שיטת היישום שבה יש להשתמש. השתמשו בשיטת ואקום (שלב 2.3) עבור דגימות קטנות (איור 1A) או לא עציות (איור 1B). השתמשו בשיטת הזילוח עבור דגימות גדולות יותר, בתנאי שהיא כוללת קטע של הגבעול/שורש המארח (איור 1A,C-E).
2. יש ללבוש כפפות גומי וציוד הגנה אישי מתאים אחר (לדוגמה, מעיל מעבדה) בעת טיפול הדגימה, ללא קשר לגישה שנבחרה בשלבים הבאים.
   זהירות: כל הפתרונות המנוגדים כוללים מלחי מתכת כבדים בהרכבם, ולכן אין לטפל בהם ללא ציוד הגנה אישי מתאים ומתחת למכסה מנוע.
3. עבור שיטת ואקום, בצע את השלבים המוזכרים להלן.
   1. בחרו בקבוקון מתאים ותייגו אותו. הבקבוקון חייב להיות גדול מספיק כדי להכיל את הדגימה ואת הפתרון הניגוד, בדרך כלל ביחס של 1:10. בדוק את הוראות היצרן כדי לוודא שהבקבוקון יכול לעמוד בוואקום נמוך עד בינוני.
      הערה: אין למלא את הבקבוקון עד אפס מקום, מכיוון שהלחץ השלילי (ואקום) עלול לגרום לנוזל להישפך.
   2. הניחו את הדגימה בבקבוקון עם התמיסה המנוגדת (1% יוד או 3% פוספוטונגסטט, ראו טבלת חומרים). לאחר מכן הניחו את הבקבוקון בתא ואקום או מייבש המחובר למשאבת ואקום. הסירו את המכסה מהבקבוקון וסגרו את תא הוואקום או את מייבש הכביסה.
   3. בדקו שאין סדקים בתא הוואקום/מייבש ושמשאבת הוואקום מכילה מספיק שמן.
   4. סגור את שסתום התשישות של המשאבה כדי למנוע הצטברות אוויר ופתח את שסתום התשישות של החדר/מייבש כדי לדחוף את האוויר החוצה.
   5. הפעל את המשאבה והמתן עד שהלחץ יגיע לכ-20 אינץ' כספית.
      זהירות: תהליך זה הוא בדרך כלל מהיר, לכן אל תשאירו את מערכת הוואקום ללא השגחה.
      הערה: בעוד שיחידת המערכת המטרית ללחץ היא פסקל (Pa), מדי לחץ ברוב משאבות ואקום המעבדה מציגים לחץ בסנטימטרים של כספית ("כספית"), פאונד לאינץ' מרובע (psi) או ברים. 20 אינץ' כספית שווה לערך 67.7 Pa, 10 psi או 0.7 bar.
   6. סגור את שסתום הפליטה של התא/מייבש כדי למנוע כניסת אוויר מחדש, ולאחר מכן כבה במהירות את המשאבה.
   7. השאר את הדגימה תחת ואקום לפחות 2 שעות; דגימות גדולות יותר דורשות זמן רב יותר כדי שהפתרון המנוגד יחדור אליו.
   8. לאחר התקופה הרצויה, הסר את הדגימה מהפתרון המנוגד כדי להכין אותה לסריקה.
   9. פתחו באיטיות את שסתום התשישות של החדר/מייבש כדי לאפשר כניסת אוויר לתוכו.
   10. המתן עד שהלחץ בתא/מייבש ימוצה במלואו (כלומר, מד הלחץ מגיע קרוב ל-0), ואז פתח אותו בזהירות כדי לאחזר את הדגימה.
   11. השליכו את הפתרון המנוגד כראוי ושמרו את הדגימה לקראת הסריקה.
4. עבור שיטת הזלוף, בצע את השלבים המוזכרים להלן.
   1. בחר מיכל אספקה לפתרון הניגוד בהתאם לגודל המדגם. השתמשו במזרק של 50 מ"ל (ללא מחט או בוכנה) עבור דגימות קטנות (איור 2A) או בערכה רפואית תוך ורידית של 1 ליטר עבור דגימות גדולות (איור 2B).
   2. חברו קצה אחד של צינור פלסטיק שקוף (ראו טבלת חומרים) למיכל האספקה, ולאחר מכן חברו את הקצה השני לשסתום דו-כיווני או תלת-כיווני. חברו צינור שני לשקע אחר בשסתום (איור 2A,B).
   3. אבטח את מיכל האספקה במיקום מוגבה מבלי לפרק את המנגנון שהוקם בשלב הקודם.
      הערה: המרחק האנכי בין המיכל לדגימה יכתיב את לחץ הזלוף של התמיסה (איור 2B). מרחק של 20-50 ס"מ מספיק עבור דגימות קטנות. עבור דגימות גדולות, מרחק של 1 מ 'הוא מספיק יותר.
   4. סגרו את השסתום התלת-כיווני (איור 2C) או הדו-כיווני (איור 2D) כדי למנוע יציאת נוזלים ממערכת הצינורות, ואז שפכו את התמיסה המנוגדת למיכל האספקה. אם אתה משתמש בערכה רפואית תוך ורידית, מלא את השקית בתמיסה וסגור את השסתום לפני אבטחת המכשיר במיקום מוגבה.
   5. ודאו שלא נוצרות בועות אוויר גדולות לאורך מערכת הצינורות (איור 2E). במידת הצורך, אפשרו לתמיסת הניגוד לזרום החוצה מהצינור עד להסרת הבועה. סגור שוב את השסתום והשאר את המנגנון במקומו.
   6. כדי להכין את הדגימה לזילוח של תמיסת הניגוד, השאירו אותה שקועה בנוזל (מים, אתנול או קיבוע) וחתכו את קצה הקצה הפרוקסימלי של הגבעול/שורש המאכסן בדגימה (איור 2F).
   7. הסר את הדגימה מהנוזל שבו היא אוחסנה ועטוף אותה בסרט פרפין כדי למנוע התייבשות. שמור את הדגימה בקרבת מקום ומוכנה לחיבור למנגנון.
   8. פתח בזהירות את השסתום כדי לאפשר לתמיסת הניגוד לזרום לאט ומלא את צינורות הפלסטיק המחוברים למיכל תוך החזקת הקצה הפתוח של המערכת במיקום מוגבה מעט כדי למנוע את שפיכת התמיסה המנוגדת. שוב, ודא שלא נוצרות בועות אוויר גדולות לאורך הצינור.
   9. חברו את הקצה הפרוקסימלי של הגבעול/שורש המארח בדגימה לקצה הפתוח של מערכת הצינורות (איור 2B, אזור מוגדל). הימנע מהחדרת בועות אוויר למערכת במהלך שלב זה. במידת הצורך, נתק את הדגימה מהמנגנון והסר בועות אוויר מהמערכת על ידי מתן אפשרות לתמיסה לזרום.
   10. תוך שמירה על הדגימה מחוברת למנגנון, הניחו אותה בתוך מיכל כדי למנוע דליפה של התמיסה המנוגדת לאזור שבו נערך הניסוי. השתמשו בצינורות בקטרים שונים, באזיקונים מפלסטיק ובמתאמי שסתומים (איור 2G) כדי לוודא שכל החיבורים במכשיר מתאימים היטב, מתאימים לענפים מארחים בגדלים שונים, ושהפתרון אינו דולף החוצה ממערכת הצינורות (איור 2B, אזור מוגדל).
   11. תן לתמיסה לחורר את הדגימה במשך שעתיים לפחות, או עד שהתמיסה מצטברת בתוך המיכל.
   12. סגור את השסתום ונתק בזהירות את הדגימה מהמנגנון. מסננים את שארית התמיסה למיכל ומשליכים אותה בהתאם.
   13. הסר את סרט הפרפין מהדגימה כהכנה לסריקה.

איור 2: גישת זילוח ליישום ניגודיות. גרסאות קטנות (A) וגדולות (B) של מנגנון הזילוח כוללות מיכל אספקה (st) ושני צינורות פלסטיק (t1 ו-t2) המחוברים באמצעות שסתום (va). הקצה הפרוקסימלי של גבעול הפונדקאי (H) הנושא טפיל (P) המחובר אליו דרך האוסטוריום (ha) מחובר לקצה הפתוח של המערכת (B, מורחב). שסתום תלת-כיווני (C) או דו-כיווני (D) משמש למניעת היווצרות בועות אוויר בתוך מערכת הצינורות, אשר חוסמות את המעבר של תמיסה מנוגדת (E). קצה הקצה הפרוקסימלי של גזע הפונדקאי (H) נחתך מתחת למים כדי לאפשר מעבר של תמיסת הניגוד (F). אזיקונים, מתאמי שסתומים וצינורות בקטרים שונים מסייעים לאבטח חיבורים הדוקים יותר ולמנוע דליפה במערכת (G). איורים 2B, D ו-F נוצרו באמצעות BioRender. פסי קנה מידה = 2 ס"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. הכנת מדגם והרכבה

1. שטפו את הדגימה על ידי טבילתה במים למשך 2 דקות.
   אזהרה: אין לשטוף דגימות בכיור, מכיוון שכל התמיסות המנוגדות כוללות מלחי מתכת כבדים בהרכבן. חשבו על המים המשמשים לשטיפה כתמיסת ניגוד מדוללת והשליכו אותם בהתאם.
2. הניחו את הדגימה במגבת נייר בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לעודפי המים להתאדות למשך 2-5 דקות, בהתאם לגודל הדגימה. לחלופין, יבשו מעט את הדגימה בעזרת מגבת נייר. אין לאפשר לדגימה להתייבש לחלוטין.
3. עטפו את הדגימה בסרט פרפין על ידי מתיחתו לשכבה דקה. הימנעו מקיפול סרט הפרפין על גבי הדגימה.
4. הרכיבו את הדגימה העטופה על מחזיק דגימה, ושמרו עליה יציבה ובמקומה בזמן שהיא מסתובבת במהלך הסריקה. השתמש בסרט הדבקה, קצף בצפיפות נמוכה, קצוות פיפטה ו / או מיכלי פלסטיק שקופים כדי לאבטח את הדגימה במקומה.
5. סרוק את הדגימה ונתח את התמונות בהתאם לפרוטוקולים והנחיות ספציפיים שנקבעו עבור מערכת המיקרו-CT הזמינה.

תוצאות

האוסטוריום של צמחים טפיליים הוא איבר מורכב המורכב מרקמות וסוגי תאים שונים המשתלבים ומתחברים לרקמות של צמח אחר, המשמש כפונדקאי²⁰. ניתן למנף סריקת מיקרו-CT כדי להבין טוב יותר את המבנה המורכב הזה בדרך לא הרסנית ותלת ממדית בעת ניתוח האוסטוריה קטנה (איור 1A-C) וגד?...

Discussion

השימוש בתמיסות מתכות כבדות לשיפור הניגודיות של רקמות הצמח הפך לשלב מכריע בהכנת הדגימות לניתוח מיקרו-CT. מספר תרכובות הזמינות בדרך כלל במעבדות מיקרומורפולוגיה של צמחים נבדקו על ידי Staedler et al., אשר ממליצים להשתמש phosphotungstate כסוכן היעיל ביותר בחדירה דגימות והגדלת מדד הניגוד⁸. תוצאו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D X-ray microscope (XRM) system		Zeiss Versa 620	used to scan Pyrularia pubera
3D X-ray microscope + A2:D22	Zeiss	Versa 620	Used for scanning the species P. pubera
CT-Pro 3D software	Nikon	version XT 3.1.11	Used for three-dimensional reconstruction of scans
CT-Vox software	Bruker	version 3.3.1	Used for analyses and acquisition of images and videos
Dragonfly software	Object Research Systems - ORS	version	Used for analyses and acquisition of images and videos
Glass vials	Glass Vials Inc. SE	V2708C-FM-SP	Sold by VWR - USA; make sure that vials are able to withstand vacuum at ca. 10 psi
Inspect-X	Zeiss	version XT 3.1.11	Used for controlling the Nikon X-Tek HMXST225 system
Iodine solution 0.0282 N	WR Chemicals BDH	BDH7422-1	Sold by VWR - USA
Lead Nitrate II PA 500 g	Vetec	361.08	Sold by SPLab
Microtomography scanner	Bruker	Skyscan1176	Used for scanning the species C. americana, S. martianus, and S. fungiforme
Microtomography scanner	Nikon	X-Tek HMXST225	Used for scanning the species V. minimum
NRecon software	Bruker	version 1.0.0	Used for three-dimensional reconstruction
Phosphotungstic acid hydrate 3% in aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	101410-756	Sold by VWR - USA
Plastic film (Parafilm)	Heathrow Scientific	PM996	Sold by VWR - USA
Plastic IV bag 500 mL	Taylor	3478	Sold by Fibra Cirurgica Produtos para Saude
PVC tubing 3/4''	Nalge Nunc International	SC63013-164	Sold by VWR - USA
Scanning system		Nikon X-Tek HMXST225	used to scan Viscum minimum
Scanning system		Bruker Skyscan 1176	used to scan C. americana
Scout-and-ScanTM software	Zeiss	version 16	Used for controlling the Zeiss Versa 620 system and for three-dimensional reconstruction of scans
Three-way valve	ToToT	DMTWVS-5	Sold by Amazon USA
Two-part syringe	HSW Henke-Ject	4850001000	Used without the plunger
Vacuum chamber	Binder	80080-434	Sold by VWR - USA; includes pump and connecting tubes
VG Studio Max software	Volume Graphics	version 3.0	Used for analyses and acquisition of images and videos