Использование микро-КТ-сканирования для анализа паразитических взаимодействий между растением и хозяином

Резюме

Микро-КТ - это неразрушающий инструмент, который может анализировать структуры растений в трех измерениях. В настоящем протоколе описана пробоподготовка с использованием микро-КТ для анализа структуры и функции паразитарных растений. Различные виды используются, чтобы подчеркнуть преимущества этого метода в сочетании с конкретными препаратами.

Аннотация

Микро-КТ-сканирование стало признанным инструментом для исследования структуры и функции растений. Его неразрушающий характер в сочетании с возможностью трехмерной визуализации и виртуального разреза позволил по-новому и все более детально анализировать сложные органы растений. Также могут быть изучены взаимодействия между растениями, в том числе между растениями-паразитами и их хозяевами. Однако подготовка образца перед сканированием становится решающей из-за взаимодействия между этими растениями, которые часто различаются по организации и составу тканей. Кроме того, при отборе проб, обработке и подготовке материала паразита-хозяина необходимо учитывать широкое разнообразие паразитических цветковых растений, начиная от сильно редуцированных вегетативных тел и заканчивая деревьями, травами и кустарниками. Здесь описаны два различных подхода к введению контрастных растворов в растения-паразиты и/или растения-хозяева, уделяя особое внимание анализу гаустория. Этот орган способствует связи и общению между двумя растениями. Следуя простому подходу, детали организации ткани гаустория могут быть исследованы в трех измерениях, как показано здесь для видов эуфотоидов, виноградной лозы и омелы. Выбор специфических контрастных агентов и подходов к применению также позволяет детально наблюдать за распространением эндопаразита в организме хозяина и обнаруживать прямую связь между сосудами и хозяином, как показано здесь для облигатного корневого паразита. Таким образом, обсуждаемый здесь протокол может быть применен к широкому разнообразию паразитических цветковых растений для улучшения понимания их развития, структуры и функционирования.

Введение

Рентгеновская микрокомпьютерная томография высокого разрешения (микро-КТ) представляет собой метод визуализации, при котором несколько рентгенограмм (проекций) образца записываются под разными углами обзора и в дальнейшем используются для обеспечения виртуальной реконструкции образца¹. Затем этот виртуальный объект можно анализировать, манипулировать и сегментировать, что позволяет проводить неразрушающее исследование в трех измерениях². Первоначально разработанная для медицинских анализов, а затем для промышленного применения, микро-КТ также предлагает преимущество визуализации внутренних органов и тканей без необходимости инвазивных процедур³. Как и другие формы визуализации, микро-КТ работает с компромиссом между полем зрения и размером пикселя, что означает, что визуализация больших образцов с высоким разрешением практически недостижима⁴. Постоянно делаются успехи в использовании высокоэнергетических источников рентгеновского излучения (например, синхротрона) и вторичного оптического увеличения, что позволяет наименьшему разрешению достигать менее 100 нм ^5,6. Тем не менее, для больших образцов требуется более длительное время сканирования, что увеличивает вероятность появления артефактов из-за движения или деформации образца внутри сканера. Кроме того, микро-КТ обычно ограничена естественными изменениями плотности в образце и тем, как образец взаимодействует с рентгеновскими лучами. В то время как более высокая доза рентгеновского излучения лучше всего подходит для проникновения в более плотные образцы, она менее эффективна для улавливания изменений плотности внутри и между образцом и окружающей его средой⁷. С другой стороны, меньшая доза рентгеновского излучения обеспечивает меньшую проникающую способность и часто требует более длительного времени сканирования, но большей чувствительности при обнаружении плотности⁷.

Эти ограничения долгое время препятствовали использованию микротомографии в науках о растениях, учитывая, что большинство растительных тканей состоят из легкой (неплотной) ткани с низким поглощением рентгеновского излучения⁸. Первые применения микро-КТ были сосредоточены на картировании корневых сетей в почвенной матрице ^9,10. Позже стали исследоваться растительные структуры с более значительными различиями в плотности тканей, такие как древесина. Это позволило исследовать функциональность ксилемы 11,12, развитие сложных тканевых организаций^13,14 и взаимодействия между растениями^15,16,17. Анализ мягких и однородных тканей получает широкое распространение благодаря контрастным веществам, которые в настоящее время являются стандартной процедурой при подготовке к микро-КТ-сканированию образцов растений. Однако протоколы введения контраста могут иметь разные результаты в зависимости от объема образца, структурных свойств и типа используемого раствора⁸. В идеале контрастное вещество должно усиливать различие между различными тканями, позволять оценивать функциональность ткани/органа и/или предоставлять биохимическую информацию о ткани¹⁸. Таким образом, адекватная обработка, подготовка и монтаж образца перед сканированием приобретают решающее значение для любого микро-КТ-анализа.

Микро-КТ паразитического растения гаустория
Паразитические цветковые растения представляют собой отдельную функциональную группу покрытосеменных растений, характеризующихся органом, известным как гаусторий¹⁹. Этот многоклеточный орган, являющийся гибридом развития между модифицированным стеблем и корнем, воздействует на прикрепление, проникновение и контакт паразита²⁰ с хозяином. По этой причине считается, что гаусторий «воплощает саму идею паразитизма среди растений»²¹. Детальное понимание развития, структуры и функционирования этого органа имеет решающее значение для изучения экологии, эволюции и управления паразитическими растениями. Тем не менее, общая сложность паразитических растений и сильно измененная структура и гаустория часто препятствуют детальному анализу и сравнению. Гаусторийные связи также обычно обширны и неоднородны по распределению тканей и клеток (рис. 1). В этом контексте, хотя работа с небольшими фрагментами тканей позволяет легче манипулировать и иметь более высокое разрешение, это может привести к ошибочным выводам о трехмерной архитектуре сложных структур, таких как паразитический гаусторий растений.

Несмотря на то, что существует обширная литература по анатомии и ультраструктуре гаустория для большинства видов растений-паразитов, трехмерная организация и пространственные отношения между тканями паразита и хозяина остаются плохо изученными¹⁷. В недавней работе Masumoto et ^al.22 более 300 серийных полутонких срезов микротома были изображены и реконструированы в трехмерный виртуальный объект, представляющий гаусторий двух видов паразитов. Превосходный уровень детализации этого метода обеспечивает беспрецедентное понимание клеточной и анатомической 3D-структуры гаустория. Однако такой трудоемкий метод запретил бы аналогичный анализ у паразитов с более обширными гаусторийными связями. Использование микро-КТ становится отличным инструментом для трехмерного анализа сложных и часто громоздких гаусторий растений-паразитов. Несмотря на то, что результаты, полученные с помощью микро-КТ-сканирования, особенно для больших образцов, не заменяют подробное анатомическое срезирование и другие дополнительные формы микроскопического анализа^17,23, они также могут служить руководством для направления субвыборки более мелких сегментов, которые затем могут быть проанализированы с использованием других инструментов, таких как конфокальная и электронная микроскопия^, или повторно проанализированы с помощью систем микро-КТ с высоким разрешением.

Рисунок 1: Паразитические растения различных функциональных групп, используемые в этом протоколе. Эуфитоидный паразит Pyrularia pubera (A), эндопаразит Viscum minimum (B) с зелеными плодами (пунктирный черный круг), паразитическая лиана Cuscuta americana (C), омела Struthanthus martianus (D), облигатный корневой паразит Scybalium fungiforme (E). Сегменты корня хозяина (Hr) или стебля (Hs) облегчают применение контраста в гаустории паразита (P). Наличие в образце материнского корня/стебля паразита (стрелки) позволяет проанализировать организацию сосуда гаустория. Прямоугольниками обозначены сегменты образца, используемого для анализа. Масштабные линейки = 2 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

По мере того, как микро-КТ становится все более популярным методом в науках о растениях, существуют руководства, протоколы и литература, посвященные сканированию образцов, трехмерной реконструкции, сегментации и анализу ^3,10,24. Таким образом, эти шаги здесь обсуждаться не будут. Как и в случае с любой техникой воображения, надлежащая обработка и монтаж образцов являются фундаментальной, хотя и часто упускаемой из виду процедурой. По этой причине этот протокол фокусируется на подготовке образцов гаустория для микро-КТ-сканирования. Более конкретно, этот протокол описывает два подхода к введению контрастных веществ в образцы гаустория для улучшения визуализации различных тканей и типов клеток в гаустории, для облегчения обнаружения паразитарной ткани в корне / стебле хозяина и для анализа сосудистых связей паразит-хозяин в трех измерениях. Препараты, описанные здесь, также могут быть адаптированы для анализа других структур растений.

Пять видов были использованы, чтобы лучше проиллюстрировать удобство протокола, описанного здесь. Каждый вид представляет одну из пяти функциональных групп паразитических цветковых растений, тем самым обращаясь к конкретным моментам, связанным с функциональностью каждой группы. Pyrularia pubera (Santalaceae) была выбрана для представления эуфитоидных паразитов, которые прорастают в землю и образуют множественные гаустории, которые соединяют паразита с корнями его хозяев²⁵. Гаустории, создаваемые этими растениями, часто разрежены и легко отрываются от хозяина²⁶ (рис. 1А), что требует более деликатного процесса обращения. Эндопаразиты представлены здесь Viscum minimum (Viscaceae). Виды этой функциональной группы видны вне тела своих хозяев только в течение коротких периодов времени (рис. 1B) и живут большую часть своих жизненных циклов в виде значительно редуцированных и мицелиальноподобных нитей клеток, встроенных в ткани хозяина²⁵. Третья функциональная группа включает паразитические лианы, которые прорастают на земле, но образуют только рудиментарные корни, опираясь на множественные гаустории, которые прикрепляются к стеблям растений-хозяев²⁵ (рис. 1С). Здесь эта функциональная группа представлена Cuscuta americana (Convolvulaceae). В отличие от паразитических лиан, омела прорастает непосредственно на ветвях растений-хозяев и развивает либо множественную, либо одиночную гаусторию²⁵. Видом, выбранным для иллюстрации этой функциональной группы, является Struthanthus martianus (Loranthaceae), который образует различные связи с ветвью хозяина (рис. 1D). Анализ одиночной гаустории омелы с использованием комбинации микро-КТ и световой микроскопии можно найти в Teixeira-Costa & Ceccantini¹⁷. Наконец, облигатные корневые паразиты включают виды, которые прорастают на земле и проникают в корни растений-хозяев, от которых они полностью зависят с самых ранних стадий роста²⁵. Эти растения представлены здесь Scybalium fungiforme (Balanophoraceae), которые производят крупные клубневидные гаустории (рис. 1E).

Все образцы растений, использованные в этом протоколе, были зафиксированы в 70% спирте формалиновой уксусной кислоты (FAA 70). Фиксация при отборе проб имеет решающее значение для сохранения растительных тканей, особенно если необходимы последующие анатомические анализы. В случае паразитического гаустория растений фиксация также необходима, так как этот орган часто в основном состоит из неодревесневших клеток паренхимы²⁰. Подробные протоколы фиксации растительной ткани, включая приготовление фиксирующих растворов, можно найти в другом месте²⁷. С другой стороны, в большей или меньшей степени фиксаторы могут вызывать изменения физических и химических свойств образца, делая его непригодным для конкретных биомеханических и гистохимических анализов. Таким образом, свежие образцы, т.е. нефиксированный материал, собранный непосредственно перед подготовкой, также могут быть использованы с этим протоколом. Подробная информация о том, как работать со свежими образцами, и предложения по устранению неполадок с фиксированным материалом приведены в разделе обсуждения.

протокол

1. Отбор образцов растений-паразитов

1. Соберите весь паразитический гаусторий растения, включая прикрепленный стебель/корень хозяина и сегменты как проксимального, так и дистального концов паразитированного органа хозяина; Идеальная длина каждого сегмента эквивалентна удвоенному диаметру гаустория.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для латеральной гаустории включите часть материнского стебля/корня паразита, из которого образовался гаусторий (рис. 1A, B, D). Для эндопаразитов соберите сегмент стебля/корня хозяина, в котором видны признаки паразита (рис. 1B). В случае клеммных соединений следует собирать всю установку (рис. 1E).
2. Погрузите весь образец в фиксирующий раствор (например, FAA) в объемной пропорции 1:10 (образец: фиксатор). Оставляют пробы в фиксаторе не менее 1 суток в зависимости от размера пробы²⁷.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы можно хранить в фиксаторе перед сканированием или переводить в консервирующий раствор (например, этанол 70%). Свежие образцы также могут быть использованы, если последующий анатомический анализ не оправдан (см. раздел «Обсуждение»). Если вы работаете со свежим материалом, настройте аппарат для перфузии контрастного раствора, затем соберите образец. Нельзя допускать высыхания образца.

2. Применение контрастных решений

1. Выберите способ нанесения, который будет использоваться. Используйте вакуумный метод (этап 2.3) для небольших (рис. 1А) или недревесных (рис. 1Б) образцов. Используйте метод перфузии для более крупных образцов при условии, что он включает сегмент стебля/корня хозяина (рис. 1A, C-E).
2. Надевайте резиновые перчатки и другие соответствующие средства индивидуальной защиты (например, лабораторный халат) при манипуляциях с образцом независимо от подхода, выбранного на следующих этапах.
   ВНИМАНИЕ: Все контрастные растворы включают в свой состав соли тяжелых металлов, и поэтому с ними нельзя обращаться без соответствующих средств индивидуальной защиты и под вытяжным шкафом.
3. Для вакуумного метода выполните шаги, указанные ниже.
   1. Выберите подходящий флакон и промаркируйте его. Флакон должен быть достаточно большим, чтобы вместить образец и контрастный раствор, обычно в пропорции 1:10. Ознакомьтесь с инструкциями производителя, чтобы убедиться, что флакон выдерживает низкий или умеренный вакуум.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не наполняйте флакон до краев, так как отрицательное давление (вакуум) может привести к разливу жидкости.
   2. Поместите образец во флакон с контрастным раствором (1% йода или 3% фосфовольфрамата, см. Таблицу материалов). Затем поместите флакон в вакуумную камеру или эксикатор, подключенный к вакуумному насосу. Снимите крышку с флакона, затем закройте вакуумную камеру или эксикатор.
   3. Убедитесь, что на вакуумной камере/эксикаторе нет трещин и достаточно масла в вакуумном насосе.
   4. Закройте выпускной клапан насоса, чтобы предотвратить утечку воздуха, и откройте выпускной клапан камеры/эксикатора, чтобы вытеснить воздух.
   5. Включите насос и подождите, пока давление не достигнет примерно 20 дюймов ртутного столба.
      ВНИМАНИЕ: Этот процесс обычно быстрый, поэтому не оставляйте вакуумную систему без присмотра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как метрической системной единицей измерения давления является Паскаль (Па), манометры в большинстве лабораторных вакуумных насосов показывают давление в дюймах ртутного столба («Hg»), фунтах на квадратный дюйм (psi) или барах. 20 дюймов ртутного столба равны ок. 67,7 Па, 10 фунтов на квадратный дюйм или 0,7 бар.
   6. Закройте выпускной клапан камеры/эксикатора, чтобы предотвратить повторный поступление воздуха, затем быстро выключите насос.
   7. Оставьте образец в вакууме не менее чем на 2 часа; Более крупным образцам требуется больше времени, чтобы контрастный раствор проник в него.
   8. По истечении нужного срока извлеките образец из контрастного раствора, чтобы подготовить его к сканированию.
   9. Медленно откройте выпускной клапан камеры/эксикатора, чтобы воздух проник в него.
   10. Подождите, пока давление в камере/эксикаторе полностью исчерпается (т. е. манометр достигнет почти 0), затем осторожно откройте его, чтобы извлечь образец.
   11. Выбросьте контрастный раствор соответствующим образом и держите образец при подготовке к сканированию.
4. Для метода перфузии выполните шаги, указанные ниже.
   1. Выберите резервуар для подачи контрастного раствора в соответствии с размером образца. Используйте шприц объемом 50 мл (без иглы или поршня) для небольших образцов (рис. 2A) или аптечку для внутривенного введения 1 л для больших образцов (рис. 2B).
   2. Подсоедините один конец прозрачной пластиковой трубки (см. Таблицу материалов) к подающему баку, затем другой конец подсоедините к двухходовому или трехходовому клапану. Подсоедините вторую трубку к другому выходному отверстию клапана (рис. 2A, B).
   3. Закрепите резервуар подачи на возвышении, не разбирая устройство, установленное на предыдущем шаге.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вертикальное расстояние между резервуаром и образцом будет определять давление перфузии раствора (рис. 2B). Для небольших образцов достаточно расстояния в 20-50 см. Для больших образцов более адекватно расстояние в 1 м.
   4. Закройте трехходовой (рис. 2C) или двухходовой (рис. 2D) клапан, чтобы предотвратить выход жидкости из системы трубок, затем залейте контрастный раствор в подающий бак. Если вы используете внутривенную медицинскую аптечку, наполните пакет раствором и закройте клапан, прежде чем закрепить аппарат в возвышенном положении.
   5. Убедитесь, что вдоль системы трубок не образуются крупные пузырьки воздуха (рис. 2E). При необходимости дайте контрастному раствору вытечь из трубки до тех пор, пока пузырь не будет удален. Снова закройте клапан и оставьте аппарат на месте.
   6. Чтобы подготовить образец к перфузии контрастного раствора, держите его погруженным в жидкость (воду, этанол или фиксатор) и отрежьте кончик проксимального конца стебля/корня хозяина в образце (рис. 2F).
   7. Извлеките образец из жидкости, в которой он хранился, и заверните его в парафиновую пленку, чтобы избежать высыхания. Держите образец поблизости и будьте готовы к подключению к устройству.
   8. Осторожно откройте клапан, чтобы контрастный раствор протекал медленно, и заполните пластиковую трубку, соединенную с резервуаром, удерживая открытый конец системы в слегка приподнятом положении, чтобы предотвратить разлив контрастного раствора. Опять же, убедитесь, что вдоль трубки не образуются большие пузырьки воздуха.
   9. Подсоедините проксимальный конец основного стебля/корня в образце с открытым концом системы трубок (рис. 2B, увеличенная область). Избегайте попадания пузырьков воздуха в систему на этом этапе. При необходимости отсоедините образец от аппарата и удалите пузырьки воздуха из системы, позволив раствору течь.
   10. Удерживая образец подключенным к аппарату, поместите его в контейнер, чтобы избежать утечки контрастного раствора в область, где проводился эксперимент. Используйте трубки разного диаметра, пластиковые стяжки и переходники клапанов (рис. 2G), чтобы убедиться, что все соединения в аппарате хорошо подогнаны, вмещают хост-ветви различных размеров и что раствор не вытекает из системы трубок (рис. 2B, увеличенная область).
   11. Дайте раствору перфузировать образец в течение не менее 2 ч или до тех пор, пока раствор не накопится внутри контейнера.
   12. Закройте клапан и осторожно отсоедините образец от аппарата. Слейте остатки раствора в контейнер и утилизируйте его соответствующим образом.
   13. Удалите парафиновую пленку с образца при подготовке к сканированию.

Рисунок 2: Перфузионный подход для нанесения контраста. Малая (А) и большая (В) версии перфузионного аппарата включают в себя подающий резервуар (st) и две пластиковые трубки (t1 и t2), соединенные клапаном (va). Проксимальный конец стебля хозяина (H), несущий паразита (P), прикрепленного к нему через гаусторий (ha), соединен с открытым концом системы (B, расширенный). Трехходовой (C) или двухходовой (D) клапан используется для предотвращения образования пузырьков воздуха внутри системы трубок, которые блокируют прохождение контрастного раствора (E). Кончик проксимального конца стебля-хозяина (H) разрезают под водой, чтобы обеспечить прохождение контрастного раствора (F). Застежки-молнии, переходники клапанов и трубки разного диаметра помогают закрепить более плотные соединения и избежать утечек в системе (G). Рисунки 2B, D и F были созданы с помощью BioRender. Масштабные линейки = 2 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Подготовка образцов и монтаж

1. Промойте образец, погрузив его в воду на 2 минуты.
   ВНИМАНИЕ: Не мойте образцы в раковине, так как все контрастные растворы включают в свой состав соли тяжелых металлов. Рассматривайте воду, используемую для стирки, как разбавленный контрастный раствор и утилизируйте ее соответствующим образом.
2. Поместите образец в бумажное полотенце при комнатной температуре, чтобы лишняя вода испарилась в течение 2-5 минут в зависимости от размера образца. В качестве альтернативы слегка подсушите образец с помощью бумажного полотенца. Не допускайте полного высыхания образца.
3. Заверните образец в парафиновую пленку, растянув ее до тонкого слоя. Не сворачивайте парафиновую пленку поверх образца.
4. Установите обернутый образец на держатель образца, сохраняя его устойчивым и в нужном положении, пока он вращается во время сканирования. Используйте клейкую ленту, пенопласт низкой плотности, наконечники для пипеток и/или прозрачные пластиковые контейнеры, чтобы закрепить образец на месте.
5. Отсканируйте образец и проанализируйте изображения в соответствии с конкретными протоколами и рекомендациями, установленными для доступной системы микро-КТ.

Результаты

Гаусторий растений-паразитов представляет собой сложный орган, состоящий из различных тканей и типов клеток, которые переплетаются и соединяются с тканями другого растения, используемого в качестве хозяина²⁰. Микро-КТ-сканирование может быть использовано для ?...

Обсуждение

Использование растворов тяжелых металлов для улучшения контраста тканей растений стало важным шагом в подготовке образцов для микро-КТ-анализа. Несколько соединений, обычно доступных в лабораториях микроморфологии растений, были протестированы Staedler et al., которые рекомендуют использ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D X-ray microscope (XRM) system		Zeiss Versa 620	used to scan Pyrularia pubera
3D X-ray microscope + A2:D22	Zeiss	Versa 620	Used for scanning the species P. pubera
CT-Pro 3D software	Nikon	version XT 3.1.11	Used for three-dimensional reconstruction of scans
CT-Vox software	Bruker	version 3.3.1	Used for analyses and acquisition of images and videos
Dragonfly software	Object Research Systems - ORS	version	Used for analyses and acquisition of images and videos
Glass vials	Glass Vials Inc. SE	V2708C-FM-SP	Sold by VWR - USA; make sure that vials are able to withstand vacuum at ca. 10 psi
Inspect-X	Zeiss	version XT 3.1.11	Used for controlling the Nikon X-Tek HMXST225 system
Iodine solution 0.0282 N	WR Chemicals BDH	BDH7422-1	Sold by VWR - USA
Lead Nitrate II PA 500 g	Vetec	361.08	Sold by SPLab
Microtomography scanner	Bruker	Skyscan1176	Used for scanning the species C. americana, S. martianus, and S. fungiforme
Microtomography scanner	Nikon	X-Tek HMXST225	Used for scanning the species V. minimum
NRecon software	Bruker	version 1.0.0	Used for three-dimensional reconstruction
Phosphotungstic acid hydrate 3% in aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	101410-756	Sold by VWR - USA
Plastic film (Parafilm)	Heathrow Scientific	PM996	Sold by VWR - USA
Plastic IV bag 500 mL	Taylor	3478	Sold by Fibra Cirurgica Produtos para Saude
PVC tubing 3/4''	Nalge Nunc International	SC63013-164	Sold by VWR - USA
Scanning system		Nikon X-Tek HMXST225	used to scan Viscum minimum
Scanning system		Bruker Skyscan 1176	used to scan C. americana
Scout-and-ScanTM software	Zeiss	version 16	Used for controlling the Zeiss Versa 620 system and for three-dimensional reconstruction of scans
Three-way valve	ToToT	DMTWVS-5	Sold by Amazon USA
Two-part syringe	HSW Henke-Ject	4850001000	Used without the plunger
Vacuum chamber	Binder	80080-434	Sold by VWR - USA; includes pump and connecting tubes
VG Studio Max software	Volume Graphics	version 3.0	Used for analyses and acquisition of images and videos