Parazitik bitki-konakçı etkileşimlerini analiz etmek için mikro-BT taramasından yararlanma

Özet

Mikro-BT, bitki yapılarını üç boyutlu olarak analiz edebilen tahribatsız bir araçtır. Mevcut protokol, parazitik bitki yapısını ve işlevini analiz etmek için mikro-BT'den yararlanmak için numune hazırlamayı açıklamaktadır. Belirli preparatlarla birleştirildiğinde bu yöntemin avantajlarını vurgulamak için farklı türler kullanılır.

Özet

Mikro-BT taraması, bitki yapısını ve işlevini araştırmada yerleşik bir araç haline gelmiştir. Tahribatsız doğası, üç boyutlu görselleştirme ve sanal bölümleme olasılığı ile birleştiğinde, karmaşık bitki organlarının yeni ve giderek daha ayrıntılı analizine izin vermiştir. Paraziter bitkiler ve konakçıları da dahil olmak üzere bitkiler arasındaki etkileşimler de araştırılabilir. Bununla birlikte, taramadan önce numune hazırlama, genellikle doku organizasyonu ve kompozisyonunda farklılık gösteren bu bitkiler arasındaki etkileşim nedeniyle çok önemli hale gelir. Ayrıca, parazitik çiçekli bitkilerin geniş çeşitliliği, oldukça azaltılmış bitkisel gövdelerden ağaçlara, bitkilere ve çalılara kadar, parazit konakçı materyalin örneklenmesi, işlenmesi ve hazırlanması sırasında dikkate alınmalıdır. Burada, haustoryumu analiz etmeye odaklanarak parazit ve / veya konakçı bitkilere kontrast çözeltileri sokmak için iki farklı yaklaşım açıklanmaktadır. Bu organ iki bitki arasındaki bağlantıyı ve iletişimi teşvik eder. Basit bir yaklaşımı takiben, haustorium doku organizasyonunun ayrıntıları, burada öfitoid, asma ve ökse otu parazitik türleri için gösterildiği gibi üç boyutlu olarak araştırılabilir. Spesifik zıt ajanların seçilmesi ve uygulama yaklaşımları, burada zorunlu bir kök parazit için gösterildiği gibi, konakçı vücutta endoparazit yayılımının ayrıntılı olarak gözlemlenmesine ve parazit ile konakçı arasındaki doğrudan damardan damara bağlantının tespit edilmesine de olanak tanır. Bu nedenle, burada tartışılan protokol, gelişimlerinin, yapılarının ve işlevlerinin anlaşılmasını ilerletmek için parazitik çiçekli bitkilerin geniş çeşitliliğine uygulanabilir.

Giriş

Yüksek çözünürlüklü röntgen mikrobilgisayarlı tomografi (mikro-BT), bir numunenin çoklu radyografilerinin (projeksiyonlarının) farklı görüş açılarından kaydedildiği ve daha sonra numunenin sanal bir rekonstrüksiyonunu sağlamak için kullanıldığı bir görüntüleme yöntemidir¹. Bu sanal nesne daha sonra analiz edilebilir, manipüle edilebilir ve bölümlere ayrılabilir, böylece üç boyutlu^2'de tahribatsız keşif yapılabilir. Başlangıçta tıbbi analizler ve daha sonra endüstriyel uygulamalar için tasarlanan mikro-BT, invaziv prosedürlere gerek kalmadan iç organları ve dokuları görselleştirme avantajı da sunar³. Diğer görüntüleme biçimleri gibi, mikro-BT de görüş alanı ve piksel boyutu arasında bir denge ile çalışır, bu da büyük örneklerin yüksek çözünürlüklü görüntülemesinin neredeyse ulaşılamaz olduğu anlamına gelir⁴. Yüksek enerjili X-ışını kaynaklarının (yani senkrotron) ve ikincil optik büyütmenin kullanımındaki ilerlemeler sürekli olarak yapılmakta ve en küçük çözünürlüğün 100 nm ^5,6'nın altına ulaşmasına izin verilmektedir. Bununla birlikte, büyük numuneler için daha uzun tarama süreleri gereklidir, bu da tarayıcı içindeki numune hareketi veya deformasyonu nedeniyle artefakt olasılığını artırır. Ayrıca, mikro-BT genellikle numune içindeki doğal yoğunluk değişimleri ve numunenin X-ışınları ile nasıl etkileşime girdiği ile sınırlıdır. Daha yoğun numunelere nüfuz etmek için daha yüksek bir X-ışını dozu en iyisi olsa da, numune ile çevresindeki ortam⁷ içindeki ve arasındaki yoğunluk değişikliklerini yakalamada daha az etkilidir. Öte yandan, daha düşük bir X-ışını dozu daha az penetrasyon gücü sunar ve genellikle daha uzun tarama süreleri gerektirir, ancak yoğunluk algılamada daha fazla hassasiyet gerektirir⁷.

Bu kısıtlamalar, çoğu bitki dokusunun düşük X-ışını emilimine sahip hafif (yoğun olmayan) dokudan oluştuğu göz önüne alındığında, bitki bilimleri için mikrotomografi kullanımını uzun zamandır engellemiştir⁸. Mikro-BT'nin ilk uygulamaları, toprak matrisi ^9,10 içindeki kök ağlarının haritalandırılmasına odaklanmıştır. Daha sonra, ahşap gibi doku yoğunluğunda daha önemli farklılıklar gösteren bitki yapıları araştırılmaya başlandı. Bu, ksilem işlevselliğinin 11,12, karmaşık doku organizasyonlarının gelişiminin 13,14 ve bitkiler arasındaki etkileşimlerin^{araştırılmasına} izin vermiştir 15,16,17. Yumuşak ve homojen doku analizi, bitki örneklerinin mikro-BT taraması için preparatlarda artık standart prosedür olan kontrast maddeler nedeniyle yaygınlaşmaktadır. Bununla birlikte, kontrast tanıtımı protokolleri, numune hacmine, yapısal özelliklere ve kullanılan çözeltinin türüne bağlı olarak farklı sonuçlara sahip olabilir⁸. İdeal olarak, kontrast madde farklı dokular arasındaki ayrımı arttırmalı, doku/organ işlevselliğinin değerlendirilmesini sağlamalı ve/veya bir doku hakkında biyokimyasal bilgi sağlamalıdır¹⁸. Bu nedenle, taramadan önce yeterli numune tedavisi, hazırlanması ve montajı, herhangi bir mikro-BT analizi için çok önemli hale gelir.

Parazitik bitki haustoriumunun mikro-BT'si
Parazitik çiçekli bitkiler, haustorium¹⁹ olarak bilinen bir organ ile karakterize edilen anjiyospermlerin ayrı bir fonksiyonel grubunu temsil eder. Modifiye edilmiş bir kök ve bir kök arasındaki gelişimsel bir melez olan bu çok hücreli organ, konakçının bağlanmasına, nüfuz etmesine ve bir parazit²⁰ ile temasına etki eder. Bu nedenle, haustoriumun "bitkiler arasındaki parazitizm fikrini somutlaştırdığı"²¹ düşünülmektedir. Bu organın gelişiminin, yapısının ve işleyişinin ayrıntılı bir şekilde anlaşılması, parazitik bitki ekolojisi, evrimi ve yönetimi çalışmaları için çok önemlidir. Bununla birlikte, parazitik bitkilerin genel karmaşıklığı ve yüksek oranda değiştirilmiş yapısı ve haustoria genellikle ayrıntılı analiz ve karşılaştırmayı engellemektedir. Haustorium bağlantıları da genellikle geniştir ve doku ve hücre dağılımında homojen değildir (Şekil 1). Bu bağlamda, küçük doku parçaları ile çalışmak daha kolay manipülasyon ve daha yüksek çözünürlük sağlarken, parazitik bitki haustorium gibi karmaşık yapıların üç boyutlu mimarisi hakkında hatalı sonuçlara yol açabilir.

Çoğu parazitik bitki türü için haustorium anatomisi ve ultrayapısı hakkında geniş bir literatür olmasına rağmen, parazit ve konakçı dokular arasındaki üç boyutlu organizasyon ve mekansal ilişki hala yeterince araştırılmamıştır¹⁷. Masumoto ve ^ark.22 tarafından yapılan yakın tarihli bir çalışmada, 300'den fazla seri yarı ince mikrotom bölümü görüntülendi ve iki parazit türünün haustoriumunu temsil eden üç boyutlu bir sanal nesneye yeniden yapılandırıldı. Bu yöntemin mükemmel ayrıntı seviyesi, haustoriumun hücresel ve anatomik 3-D yapısı hakkında benzeri görülmemiş bilgiler sağlar. Bununla birlikte, böyle zaman alıcı bir teknik, daha kapsamlı haustorium bağlantılarına sahip parazitlerde benzer bir analizi yasaklayacaktır. Mikro-BT kullanımı, parazitik bitkilerin karmaşık ve genellikle hacimli haustorialarının üç boyutlu analizi için mükemmel bir araç olarak ortaya çıkmaktadır. Ayrıntılı anatomik kesitleme ve mikroskopi analizlerinin diğer tamamlayıcı formlarının yerine geçmese de^17,23, özellikle büyük numuneler için mikro-BT taraması yoluyla elde edilen sonuçlar, daha sonra konfokal ve elektron mikroskobu gibi diğer araçlar kullanılarak analiz edilebilen veya yüksek çözünürlüklü mikro-BT sistemleriyle yeniden analiz edilebilen daha küçük segmentlerin alt örneklemesini yönlendirmek için bir rehber görevi görebilir.

Şekil 1: Bu protokolde kullanılan farklı fonksiyonel gruplara ait paraziter bitkiler. Euphytoid parazit Pyrularia pubera (A), endoparazit Viscum minimum (B) yeşil meyveler (kesikli siyah daire), parazitik asma Cuscuta americana (C), ökse otu Struthanthus martianus (D), zorunlu kök paraziti Scybalium fungiforme (E). Konakçı kökün (Hr) veya gövdenin (Hs) segmentleri, parazit haustoriuma (P) kontrast uygulanmasını kolaylaştırır. Numunede parazit ana kökü/gövdesinin (okların) varlığı, haustorium damar organizasyonunun analizine olanak sağlar. Dikdörtgenler, analiz için kullanılan numunenin segmentlerini gösterir. Ölçek çubukları = 2 cm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Mikro-BT, bitki bilimlerinde giderek daha popüler bir teknik haline geldikçe, örnek tarama, üç boyutlu rekonstrüksiyon, segmentasyon ve analiz ^3,10,24 ile ilgili kılavuzlar^, protokoller ve literatür bulunmaktadır. Bu nedenle, bu adımlar burada tartışılmayacaktır. Herhangi bir hayal etme tekniğinde olduğu gibi, numunelerin uygun şekilde işlenmesi ve montajı, çoğu zaman göz ardı edilen bir prosedür olmasına rağmen, temel bir prosedürdür. Bu nedenle, bu protokol mikro-BT taraması için haustorium örneklerinin hazırlanmasına odaklanmaktadır. Daha spesifik olarak, bu protokol, haustoriumdaki farklı dokuların ve hücre tiplerinin görselleştirilmesini iyileştirmek, konakçı kök / kök içindeki parazitik dokunun tespitini kolaylaştırmak ve parazit-konakçı vasküler bağlantılarını üç boyutlu olarak analiz etmek için haustoryum örneklerine kontrast maddeler sokmak için iki yaklaşımı açıklamaktadır. Burada açıklanan preparatlar, diğer bitki yapılarının analizine de uyarlanabilir.

Burada açıklanan protokolün rahatlığını daha iyi göstermek için beş tür kullanılmıştır. Her tür, parazitik çiçekli bitkilerin beş fonksiyonel grubundan birini temsil eder, böylece her grubun işlevselliği ile ilgili belirli noktaları ele alır. Pyrularia pubera (Santalaceae), toprakta çimlenen ve paraziti konakçılarının köklerine bağlayan çoklu haustoria oluşturan öfitoid parazitleri temsil etmek üzere seçildi²⁵. Bu bitkiler tarafından yaratılan haustoria genellikle zayıftır ve konakçı^26'dan kolayca ayrılır (Şekil 1A), bu nedenle daha hassas bir işleme süreci gerektirir. Endoparazitler burada Viscum minimum (Viscaceae) ile temsil edilir. Bu fonksiyonel gruptaki türler sadece kısa süreler için konakçılarının vücudunun dışında görülebilir (Şekil 1B) ve yaşam döngülerinin çoğunu konakçı dokuların içine gömülü hücrelerin önemli ölçüde azalmış ve miselli benzeri iplikçikleri olarak yaşarlar²⁵. Üçüncü bir fonksiyonel grup, zeminde çimlenen, ancak konakçı bitkilerin gövdelerine bağlanan çoklu haustorialara dayanan sadece ilkel kökler oluşturan parazitik asmalardan oluşur²⁵ (Şekil 1C). Burada, bu fonksiyonel grup Cuscuta americana (Convolvulaceae) ile temsil edilmektedir. Parazitik asmaların aksine, ökse otu doğrudan konakçı bitkilerinin dalları üzerinde çimlenir ve çoklu veya yalnız haustoria²⁵ geliştirir. Bu fonksiyonel grubu göstermek için seçilen tür, konakçı dal ile çeşitli bağlantılar oluşturan Struthanthus martianus'tur (Loranthaceae). Mikro-BT ve ışık mikroskobu kombinasyonu kullanılarak yalnız ökse otu haustoria'nın analizi Teixeira-Costa &; Ceccantini^17'de bulunabilir. Son olarak, zorunlu kök parazitleri, zeminde çimlenen ve en erken büyüme aşamalarından^25'ten itibaren tamamen bağımlı oldukları konakçı bitkilerin köklerine nüfuz eden türlerden oluşur. Bu bitkiler burada büyük yumru benzeri haustoria üreten Scybalium fungiforme (Balanophoraceae) ile temsil edilmektedir (Şekil 1E).

Bu protokolde kullanılan tüm bitki örnekleri% 70 formalin asetik asit alkolüne (FAA 70) sabitlenmiştir. Örnekleme üzerine sabitleme, özellikle daha sonraki anatomik analizlere ihtiyaç duyulduğunda, bitki dokularını korumak için çok önemlidir. Parazitik bitki haustorium durumunda, fiksasyon da önemlidir, çünkü bu organ genellikle öncelikle odunlaşmamış parankim hücrelerinden oluşur²⁰. Fiksatif çözeltilerin hazırlanması da dahil olmak üzere bitki dokusu fiksasyonu için ayrıntılı protokoller başka bir yerde bulunabilir²⁷. Öte yandan, fiksatifler az ya da çok bir dereceye kadar, bir numunenin fiziksel ve kimyasal özelliklerinde değişikliklere neden olabilir ve bu da numuneyi spesifik biyomekanik ve histokimyasal analizler için uygun hale getiremez. Böylece, taze numuneler, yani hazırlıktan hemen önce toplanan sabitlenmemiş malzeme de bu protokolle kullanılabilir. Yeni numunelerin nasıl işleneceğine ilişkin ayrıntılar ve sabitlenmiş malzeme için sorun giderme önerileri tartışma bölümünde verilmiştir.

Protokol

1. Paraziter bitki numune seçimi

1. Ekli konakçı kök / kök ve parazitli konakçı organın hem proksimal hem de distal uçlarının segmentleri dahil olmak üzere tüm parazitik bitki haustoriumunu toplayın; Her segmentin ideal uzunluğu, haustoriumun çapının iki katına eşdeğerdir.
   NOT: Lateral haustoria için, haustoriumun oluştuğu parazit ana sapının/kökünün bir kısmını ekleyin (Şekil 1A,B,D). Endoparazitler için, parazit belirtilerinin görülebildiği konakçı sapının / kökünün bir segmentini toplayın (Şekil 1B). Terminal bağlantıları söz konusu olduğunda, tüm tesis toplanmalıdır (Şekil 1E).
2. Tüm numuneyi fiksatif çözeltiye (örneğin, FAA) 1:10'luk hacimsel bir oranda batırın (numune: fiksatif). Numunenin büyüklüğüne bağlı olarak numuneleri en az 1 gün fiksatif olarak bırakın²⁷.
   NOT: Numuneler taramadan önce fiksatif olarak saklanabilir veya bir koruyucu çözeltiye aktarılabilir (örneğin, etanol% 70). Yeni numuneler, sonraki anatomik analizin garanti edilmediği durumlarda da kullanılabilir (Tartışma bölümüne bakınız). Taze malzeme ile çalışıyorsanız, kontrast çözeltisinin perfüzyonu için aparatı kurun, ardından numuneyi toplayın. Numunenin kurumasına izin verilmemelidir.

2. Zıt çözümlerin uygulanması

1. Kullanılacak uygulama yöntemini seçin. Küçük (Şekil 1A) veya odunsu olmayan (Şekil 1B) numuneler için vakum yöntemini (adım 2.3) kullanın. Konakçı sapının/kökünün bir segmentini içermesi koşuluyla daha büyük numuneler için perfüzyon yöntemini kullanın (Şekil 1A, C-E).
2. Aşağıdaki adımlarda seçilen yaklaşımdan bağımsız olarak numuneyi manipüle ederken lastik eldiven ve diğer uygun kişisel koruma ekipmanlarını (ör. laboratuvar önlüğü) giyin.
   DİKKAT: Tüm zıt çözeltiler, bileşimlerinde ağır metal tuzları içerir ve bu nedenle yeterli kişisel koruma ekipmanı olmadan ve bir duman davlumbazının altında kullanılmamalıdır.
3. Vakum yöntemi için aşağıda belirtilen adımları izleyin.
   1. Uygun bir şişe seçin ve etiketleyin. Flakon, numuneyi ve zıt çözeltiyi barındıracak kadar büyük olmalı, genellikle 1:10 oranında olmalıdır. Şişenin düşük ila orta vakuma dayanabileceğinden emin olmak için üreticinin talimatlarını kontrol edin.
      NOT: Negatif basınç (vakum) sıvının dökülmesine neden olabileceğinden, şişeyi ağzına kadar doldurmayın.
   2. Numuneyi zıt çözelti ile şişeye yerleştirin (% 1 iyot veya% 3 fosfotungstat, bakınız Malzeme Tablosu). Daha sonra şişeyi bir vakum pompasına bağlı bir vakum odasına veya kurutucuya yerleştirin. Kapağı şişeden çıkarın, ardından vakum odasını veya kurutucuyu kapatın.
   3. Vakum odasında/kurutucuda çatlak olmadığından ve vakum pompasında yeterli yağ bulunduğundan emin olun.
   4. Havanın dışarı akmasını önlemek için pompanın egzozyon valfini kapatın ve havayı dışarı çıkmaya zorlamak için haznenin/kurutucunun egzozyon valfini açın.
   5. Pompayı açın ve basınç yaklaşık 20" Hg'ye ulaşana kadar bekleyin.
      DİKKAT: Bu işlem genellikle hızlıdır, bu nedenle vakum sistemini gözetimsiz bırakmayın.
      NOT: Basınç için metrik sistem birimi Pascal (Pa) olsa da, çoğu laboratuvar vakum pompasındaki basınç göstergeleri basıncı inç cıva ("Hg"), inç kare başına pound (psi) veya çubuk cinsinden görüntüler. 20" Hg, yaklaşık 67,7 Pa, 10 psi veya 0,7 bar'a eşittir.
   6. Havanın tekrar girmesini önlemek için hazne/kurutucu egzoz valfini kapatın, ardından pompayı hızla kapatın.
   7. Numuneyi en az 2 saat vakum altında bırakın; Daha büyük numuneler, zıt çözeltinin nüfuz etmesi için daha uzun süre gerektirir.
   8. İstenilen süreden sonra, taramaya hazırlamak için numuneyi zıt çözeltiden çıkarın.
   9. Havanın içeri girmesine izin vermek için hazne/kurutucu egzoz valfini yavaşça açın.
   10. Odadaki/kurutucudaki basıncın tamamen tükenmesini bekleyin (yani, basınç göstergesi 0'a yaklaşır), ardından numuneyi almak için dikkatlice açın.
   11. Zıt çözeltiyi uygun şekilde atın ve numuneyi tarama için hazırlıkta tutun.
4. Perfüzyon yöntemi için aşağıda belirtilen adımları izleyin.
   1. Numunenin boyutuna göre zıt çözelti için bir besleme tankı seçin. Küçük numuneler için 50 mL'lik bir şırınga (iğne veya piston olmadan) veya büyük numuneler için 1 L intravenöz tıbbi kit kullanın (Şekil 2B).
   2. Şeffaf bir plastik borunun bir ucunu (bakınız Malzeme Tablosu) besleme tankına bağlayın, ardından diğer ucunu iki yönlü veya üç bir vanaya bağlayın. İkinci bir boruyu valfteki farklı bir prize bağlayın (Şekil 2A,B).
   3. Önceki adımda kurulan aparatı sökmeden besleme tankını yüksek bir konumda sabitleyin.
      NOT: Tank ile numune arasındaki dikey mesafe, çözelti perfüzyon basıncını belirleyecektir (Şekil 2B). Küçük numuneler için 20-50 cm'lik bir mesafe yeterlidir. Büyük numuneler için 1 m'lik bir mesafe daha yeterlidir.
   4. Sıvının boru sisteminden çıkmasını önlemek için üç (Şekil 2C) veya iki yönlü (Şekil 2D) valfi kapatın, ardından kontrast çözeltisini besleme tankına dökün. İntravenöz bir tıbbi kit kullanıyorsanız, torbayı çözelti ile doldurun ve aparatı yüksek bir konuma sabitlemeden önce valfi kapatın.
   5. Boru sistemi boyunca büyük hava kabarcıkları oluşmadığından emin olun (Şekil 2E). Gerekirse, kontrast çözeltisinin kabarcık çıkarılana kadar borudan akmasına izin verin. Vanayı tekrar kapatın ve aparatı yerinde bırakın.
   6. Numuneyi kontrast çözeltisinin perfüzyonuna hazırlamak için, sıvıya (su, etanol veya fiksatif) batırılmış halde tutun ve numunedeki konakçı sapının/kökün proksimal ucunun ucunu kesin (Şekil 2F).
   7. Numuneyi depolandığı sıvıdan çıkarın ve kurumasını önlemek için bir parafin filme sarın. Numuneyi yakınlarda tutun ve cihaza bağlanmaya hazır tutun.
   8. Zıt çözeltinin yavaşça akmasına izin vermek için vanayı dikkatlice açın ve zıt çözeltinin dökülmesini önlemek için sistemin açık ucunu hafifçe yükseltilmiş bir konumda tutarken tanka bağlı plastik boruyu doldurun. Yine, tüp boyunca büyük hava kabarcıkları oluşmadığından emin olun.
   9. Numunedeki konakçı gövdenin/kökün proksimal ucunu boru sisteminin açık ucuna bağlayın (Şekil 2B, büyütülmüş bölge). Bu adım sırasında sisteme hava kabarcıkları sokmaktan kaçının. Gerekirse, numuneyi aparattan ayırın ve çözeltinin akmasına izin vererek hava kabarcıklarını sistemden çıkarın.
   10. Numuneyi cihaza bağlı tutarken, zıt çözeltinin deneyin kurulduğu alana sızmasını önlemek için bir kabın içine yerleştirin. Cihazdaki tüm bağlantıların iyi oturduğundan, çeşitli boyutlardaki ana dalları barındırdığından ve çözeltinin boru sisteminden sızmadığından emin olmak için farklı çaplarda tüpler, plastik fermuarlı bağlar ve valf adaptörleri kullanın (Şekil 2B, büyütülmüş bölge).
   11. Çözeltinin numuneyi en az 2 saat boyunca veya çözelti kabın içinde birikinceye kadar perfüze etmesine izin verin.
   12. Vanayı kapatın ve numuneyi cihazdan dikkatlice ayırın. Çözeltinin geri kalanını kabın içine boşaltın ve uygun şekilde atın.
   13. Taramaya hazırlanırken parafin filmi numuneden çıkarın.

Şekil 2: Kontrast uygulaması için perfüzyon yaklaşımı. Perfüzyon cihazının küçük (A) ve büyük (B) versiyonları, bir besleme tankı (st) ve bir valf (va) ile bağlanmış iki plastik tüp (t1 ve t2) içerir. Haustorium (ha) aracılığıyla kendisine bağlı bir parazit (P) taşıyan konakçı sapın (H) proksimal ucu, sistemin açık ucuna (B, genişlemiş) bağlanır. Boru sistemi içinde, kontrast çözeltinin (E) geçişini engelleyen hava kabarcıklarının oluşumunu önlemeye yardımcı olmak için üç yönlü (C) veya iki yönlü (D) valf kullanılır. Konakçı sapın (H) proksimal ucunun ucu, kontrast çözeltisinin (F) geçişine izin vermek için su altında kesilir. Fermuarlı bağlar, valf adaptörleri ve farklı çaplardaki borular, daha sıkı bağlantıların güvence altına alınmasına ve sistemde sızıntının önlenmesine yardımcı olur (G). Şekil 2B, D ve F BioRender ile oluşturulmuştur. Ölçek çubukları = 2 cm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

3. Numune hazırlama ve montaj

1. Numuneyi 2 dakika suya batırarak yıkayın.
   DİKKAT: Numuneleri lavaboda yıkamayın, çünkü tüm zıt çözeltiler bileşimlerinde ağır metal tuzları içerir. Yıkama için kullanılan suyu seyreltilmiş kontrast bir çözelti olarak düşünün ve uygun şekilde atın.
2. Numunenin boyutuna bağlı olarak fazla suyun 2-5 dakika buharlaşmasını sağlamak için numuneyi oda sıcaklığında bir kağıt havluya koyun. Alternatif olarak, numuneyi bir kağıt havlu yardımıyla hafifçe kurulayın. Numunenin tamamen kurumasına izin vermeyin.
3. Numuneyi ince bir tabakaya gererek bir parafin filme sarın. Parafin filmi numunenin üzerine katlamaktan kaçının.
4. Sarılmış numuneyi bir numune tutucuya monte edin, tarama sırasında dönerken sabit ve yerinde tutun. Numuneyi yerine sabitlemek için yapışkan bant, düşük yoğunluklu köpük, pipet uçları ve/veya şeffaf plastik kaplar kullanın.
5. Numuneyi tarayın ve mevcut mikro-BT sistemi için oluşturulan belirli protokolleri ve yönergeleri izleyerek görüntüleri analiz edin.

Sonuçlar

Parazitik bitkilerin haustoriumu, konakçı olarak kullanılan başka bir bitkinin dokularıyla iç içe geçen ve bağlanan farklı doku ve hücre tiplerinden oluşan karmaşık bir organdır²⁰. Mikro-BT taraması, hem küçük (Şekil 1A-C) hem de büyük (Şekil 1D, E) haustoria'yı analiz ederken bu karmaşık yapıyı tahribatsız ve üç boyutlu bir şekilde daha iyi anlamak i?...

Tartışmalar

Bitki dokusu kontrastını iyileştirmek için ağır metal çözeltilerinin kullanılması, mikro-BT analizi için numune hazırlamada çok önemli bir adım haline gelmiştir. Bitki mikromorfolojisi laboratuvarlarında yaygın olarak bulunan çeşitli bileşikler, fosfotungstatın nüfuz eden numunelerde ve kontrast indeksi^8'in arttırılmasında en etkili ajan olarak kullanılmasını öneren Staedler ve ark. tarafından test edilmiştir. Burada P. pubera haustoriumunun analizinde elde...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D X-ray microscope (XRM) system		Zeiss Versa 620	used to scan Pyrularia pubera
3D X-ray microscope + A2:D22	Zeiss	Versa 620	Used for scanning the species P. pubera
CT-Pro 3D software	Nikon	version XT 3.1.11	Used for three-dimensional reconstruction of scans
CT-Vox software	Bruker	version 3.3.1	Used for analyses and acquisition of images and videos
Dragonfly software	Object Research Systems - ORS	version	Used for analyses and acquisition of images and videos
Glass vials	Glass Vials Inc. SE	V2708C-FM-SP	Sold by VWR - USA; make sure that vials are able to withstand vacuum at ca. 10 psi
Inspect-X	Zeiss	version XT 3.1.11	Used for controlling the Nikon X-Tek HMXST225 system
Iodine solution 0.0282 N	WR Chemicals BDH	BDH7422-1	Sold by VWR - USA
Lead Nitrate II PA 500 g	Vetec	361.08	Sold by SPLab
Microtomography scanner	Bruker	Skyscan1176	Used for scanning the species C. americana, S. martianus, and S. fungiforme
Microtomography scanner	Nikon	X-Tek HMXST225	Used for scanning the species V. minimum
NRecon software	Bruker	version 1.0.0	Used for three-dimensional reconstruction
Phosphotungstic acid hydrate 3% in aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	101410-756	Sold by VWR - USA
Plastic film (Parafilm)	Heathrow Scientific	PM996	Sold by VWR - USA
Plastic IV bag 500 mL	Taylor	3478	Sold by Fibra Cirurgica Produtos para Saude
PVC tubing 3/4''	Nalge Nunc International	SC63013-164	Sold by VWR - USA
Scanning system		Nikon X-Tek HMXST225	used to scan Viscum minimum
Scanning system		Bruker Skyscan 1176	used to scan C. americana
Scout-and-ScanTM software	Zeiss	version 16	Used for controlling the Zeiss Versa 620 system and for three-dimensional reconstruction of scans
Three-way valve	ToToT	DMTWVS-5	Sold by Amazon USA
Two-part syringe	HSW Henke-Ject	4850001000	Used without the plunger
Vacuum chamber	Binder	80080-434	Sold by VWR - USA; includes pump and connecting tubes
VG Studio Max software	Volume Graphics	version 3.0	Used for analyses and acquisition of images and videos