בדיקת הזנת ממברנה סטנדרטית לזיהוי זיהום פלסמודיום פלציפרום בווקטורים של יתושים אנופלס

Summary

בדיקת הזנת הממברנה הסטנדרטית (SMFA) נחשבת לתקן הזהב להערכה וזיהוי של תרכובות פוטנציאליות נגד מלריה. מערכת האכלה מלאכותית זו משמשת להדבקת יתושים כדי להעריך עוד יותר את ההשפעות של תרכובות כאלה על העוצמה והשכיחות של טפיל פלסמודיום falciparum .

Abstract

מלריה נותרה אחת המחלות ההרסניות ביותר בעולם, ועד כה, האזור האפריקאי עדיין אחראי ל -94% מכלל המקרים ברחבי העולם. מחלה טפילית זו דורשת טפיל פרוטוזואי, וקטור יתוש אנופלס ופונדקאי בעל חוליות. הסוג אנופלס כולל יותר מ -500 מינים, מתוכם 60 ידועים כווקטורים של הטפיל. הסוג טפיל פלסמודיום מורכב מ-250 מינים, ו-48 מהם מעורבים בהעברת מחלות. יתר על כן, טפיל הפלסמודיום פלציפרום תרם בשנים האחרונות לכ-99.7% ממקרי המלריה באפריקה שמדרום לסהרה.

גמטוציטים מהווים חלק מהשלב המיני של הטפיל והם נבלעים על ידי נקבת היתוש כאשר הם ניזונים מפונדקאי אנושי נגוע. התפתחות נוספת של הטפיל בתוך היתוש משופרת על ידי תנאים סביבתיים נוחים באמצע היתוש. כאן מתרחש המיזוג של הגמטות הנקביות והזכריות, ומקורם של האוקינטים התנועתיים. האוקינטים נכנסים לאפיתל midgut של היתוש, ואוקינטים בוגרים יוצרים oocysts, אשר, בתורם, מייצרים ספורוזואיטים תנועתיים. ספורוזואיטים אלה נודדים לבלוטות הרוק של היתוש ומוזרקים כאשר יתוש לוקח ארוחת דם.

למטרות גילוי תרופות, יתושים הודבקו באופן מלאכותי בדם נגוע בגמטוציטים בבדיקת הזנת הממברנה הסטנדרטית (SMFA). כדי לזהות זיהום בתוך היתוש ו/או כדי להעריך את היעילות של תרכובות נגד מלריה, הוסרו היתושים של נקבות היתושים לאחר ההדבקה והוכתמו במרקורוכרום. שיטה זו שימשה כדי לשפר את הזיהוי החזותי של oocysts תחת מיקרוסקופ לקביעה מדויקת של שכיחות oocyst ועוצמה.

Introduction

מלריה, הידועה כאחת המחלות ההרסניות ביותר בעולם, עדיין מהווה איום גדול על מספר מדינות - במיוחד אלה באזור אפריקה - ותורמת לכ-95% מהמקרים ברחבי העולם¹. מחלה זו נגרמת על ידי טפיל פרוטוזואי, יחד עם וקטור יתוש Anopheles שלה, האשמים האלה יכולים לגרום נזק רב המארח האנושי². ליתר דיוק, המין falciparum של סוג טפיל פלסמודיום אחראי על כ 99% ממקרי המלריה באפריקה שמדרום לסהרה¹. בנוסף לכך, ניתן להאשים מספר וקטורים עיקריים של יתושי אנופלס (כולל An. gambiae Giles, An. arabiensis Patton, An. coluzzii Coetzee & Wilkerson sp.n., ו- An. funestus Giles) ביותר מ-95% מהעברת הטפילים ברחבי העולם 3,4,5,6,7,8 . כדי להקים את החברות האידיאלית של טפיל-וקטור, וקטור היתוש צריך להיות רגיש לטפיל ולהיות מסוגל להעביר אותו⁹. יתר על כן, גם הווקטור וגם הטפיל צריכים להתגבר על מחסומים פיזיים כדי ליצור את השילוב הזיהומי המושלם - וקטור היתוש צריך להיות מסוגל לקיים את התפתחות הטפיל, והטפיל צריך להיות בעל יכולת להתגבר על מנגנוני ההגנה של הפונדקאי^10,11.

גמטוציטים, השלב המיני של טפיל P. falciparum, ממלאים תפקיד מכריע בחיבור בין השותפים הווקטוריים והטפילים¹². ההתפתחות המינית מתרחשת in vivo, וגמטוציטוגנזה מתארת את תהליך ההתמיינות של גמטוציטים בוגרים למיקרוגמטות זכריות תנועתיות ומקרוגמטות נקביות¹³. תהליך נוסף המתרחש בתוך היתוש הוא exflagellation - התהליך שבמהלכו הגמטוציט הזכרי הופך לגמטות ומגיח מתוך תאי הדם האדומים שנלקחו במהלך ארוחת דם¹¹. תהליך ההסתגרות מוצע עוד יותר להיות משופר על ידי שינוי חיובי בסביבה של יתוש midgut¹⁴. לאחר exflagellation, זיגוטה נוצרת על ידי מיזוג של גמטות זכר ונקבה¹³. מן הזיגוטה, אוקינט תנועתי עולה ועובר מארוחת הדם לאפיתל של היתוש midgut¹³. כאן, ookinete מתבגר, ו oocyst נוצר, אשר, בתורו, מייצר sporozoites תנועתי^13,15. לאחר מכן הספורוזואיטים נודדים לבלוטות הרוק של היתושים, וכאשר היתוש לוקח ארוחת דם מהפונדקאי שלו, ספורוזואיטים אלה מוזרקים לזרם הדם של הפונדקאי¹⁵.

התערבויות בקרת מלריה, המשלבות אסטרטגיות בקרת וקטורים ושימוש בתרופות יעילות נגד מלריה, הפכו חיוניות במאבק במחלה זו¹⁵. עם העלייה בעמידות בפני טפילים ויתושים, הדחיפות לזיהוי תרכובות חדשות נגד מלריה עולה^ב-16. לכן, הערכת in vivo של תרכובות חוסמות שידור חשובה¹⁶. לאחר פיתוח של תרופות חוסמות העברה יעילות כאלה, SMFA שימש כדי להעריך אם תרכובות אלה מעכבות את ההתפתחות המינית של P. falciparum יתוש Anopheles ^17,18,19. בדיקה זו זכתה להכרה מאז שנות ה-70 וה-80 של המאה ה-20 כתקן הזהב להערכת חסימת תמסורת^20,21. בדיקה זו מספקת אלטרנטיבה זולה יותר מאשר בדיקות אחרות כגון RT-qPCR, הדורשת ציוד מיוחד. יתר על כן, אין צורך בחולים כדי לבצע את הניסויים. בדיקה זו כוללת גם מתן דם המושרה על ידי גמטוציטים ליתושים נקבות, אשר מנותחים לאחר מכן כדי להעריך אם התפתחות oocyst קיים²¹. זה מאפשר כימות גמטוציטים וזיהוי של oocysts מעוותים בגלל תרכובות²². כדי שתרכובת תסווג כיעילה, יש להעריך את השכיחות (שיעור היתושים שיש להם לפחות אוציסט אחד באמצע המעיים) ואת מספר האוציסטים (עוצמה) במידגוט היתושים כדי להעריך את עיכוב הזיהום 17,21,22.

Protocol

עיין באיור 1 להמחשה של הפרוטוקול. אישור אתי התקבל מוועדת האתיקה למדעי הבריאות של אוניברסיטת פרטוריה (506/2018) לנסיגה ושימוש בדם אנושי.

1. תרבות הגמטוציטים

הערה: לפני הקמת ה- SMFA, הוכנה תרבות גמטוציטים באוניברסיטת פרטוריה (ראה Reader et ^al.22 לפרוטוקול המלא).

1. הכינו תרבית גמטוציטים המורכבת מגמטוציטים שלב V מזן הטפיל NF54.
2. ודא כי gametocytemia של התרבית הוא בין 1.5% ל 2.5%, עם hematocrit 50% בסרום זכר A+, שאליו מוסיפים תאי דם אדומים טריים.
3. יש להפריד את התרבית לצלוחיות שונות ולהוסיף 2 מיקרומטר מכל תרכובת לכל טיפול בהתאמה 48 שעות לפני ביצוע ה-SMFA. השאירו את קבוצת הביקורת ללא טיפול.
4. הערך את תרבות הגמטוציטים זמן קצר לפני ביצוע ה- SMFA כדי להבטיח את ההצפה של גמטות זכריות, עם נוכחות של יחס נקבה:זכר 3:1.

2. זיהום מלאכותי של יתושים דרך SMFA

הערה: בטיחות ביולוגית: יתושים נגועים צריכים להיות מאוחסנים במתקן בטיחות ביולוגית ברמה 2 (BSL2) עם גישה מוגבלת.

1. באמצעות שואב הפה, הכניסו 25 יתושי An. gambiae נקבות לא מזוהמות לכוס האכלה של 350 מ"ל. עשו את אותו הדבר עבור כל טיפול ותייגו את הכוסות בצורה ברורה בהתאם לשאלה אם יש להשתמש בהן כקבוצות ביקורת או טיפול. בחר את מספר הכוסות לכל טיפול בהתאם למספר המשכפלים הטכניים הכלולים.
   הערה: יתושי מושבה בני 5 עד 7 ימים משמשים בהערכת תרכובת חוסמת העברה טיפוסית. הרעבת יתושים במשך 3-4 שעות או יותר לפני הזנת הדם תקל על ספיגת הדם במהלך SMFA.
2. חבר את מערכת הזנת הזכוכית לאמבטיית המים ושמור על הטמפרטורה ב 37 מעלות צלזיוס.
   הערה: מזין הזכוכית מורכב משתי זרועות, המחוברות לצינורות הסיליקון שאליהם מחוברת אמבט המים (איור 2). המבנה החלול של המזין מאפשר למים לזרום דרך ותחזוקה של הטמפרטורה של הדם.
3. הכינו את המעי של הפרה (או הקרום הסינתטי) על ידי שטיפתו במי ברז וחתכו אותו לחתיכות המותאמות לכל מאכיל. מכסים כל מזין ומהדקים את הממברנה עם רצועה אלסטית.
   הערה: לא היה צורך באישור אתי למעי, מכיוון שהוא נקנה מקצבייה מקומית, שם הוא נמכר לציבור להכנת מזון.
4. הניחו את כוסות הזיהום מתחת למאכילים, כאשר הממברנה מונחת על גבי רשת הכוס.
5. הוסף 1 מ"ל של דם נגוע בגמטוציטים למזיני כוסות הבקרה ודם נגוע בגמטוציטים עם תרכובת נוספת לכל מזין תרכובת וכוס מתאימים.
6. השאירו את היתושים להאכיל במשך כ 40 דקות עם המזינים חשופים.
   הערה: האכלות מתבצעות בתנאי חרקים (25 מעלות צלזיוס, 80% לחות יחסית) בחושך. קוטר המזין הוא כ -13 מ"מ.
7. לאחר ההאכלה, להסיר את המזינים מן הכוסות, לשטוף את המאכילים, ולטפל הדם עודף עם hypochlorite.
8. הסר את היתושים הלא מזוהמים מהכוס על ידי הפלת כל היתושים על הקרח (למשך 1-2 דקות) והפרדת היתושים הלא מזוהמים מאלה שלקחו ארוחת דם. חפשו בטן נפוחה ואדומה (מה שמעיד על דם) כדי להבחין בין היתושים שניזונו במלואם לבין אלה שלא ניזונים (איור 3).
9. הניחו את כוסות הזיהום בתא הבטיחות הביולוגית (איור משלים S1) וספקו לכל כרית מי סוכר של 10%, תוך החלפת מי הסוכר בימים חלופיים למשך 8-10 ימים.

3. הכנת יתושים נגועים

הערה: חלק זה של הפרוטוקול מתרחש בחדר ההדבקה BSL2. רק צוות מורשה ומיומן רשאי להיכנס לחדר ההדבקה שבו שוכנים יתושים נגועים. היתושים נשמרים בכוסות מהונדסות המכילות נקודת כניסה אחת בלבד, אשר אוטמת באופן אוטומטי כאשר מסירים את שואב הפה. כוסות אלה מונחות בתוך מיכל תרמופלסטי שקוף כדי למנוע בריחה. המכולה ממוקמת בחדר ההדבקה מאחורי מערכת דלת כפולה. כל הפרוטוקולים הדרושים חייבים להיות במקום לחשיפה מקרית ליתושים נגועים (קובץ משלים S1). הפרוטוקולים הם ספציפיים למדינה ותלויים בדרישות המוסד.

1. בימים 8-10 לאחר האכלת הזיהום, הפילו את היתושים הנגועים על ידי הנחתם על קרח והעברתם לצינורות מסומנים עם 70% אתנול (שמירה על היתושים של כל קבוצת ביקורת וטיפול בנפרד).
2. ודא כי כל היתושים מתים לפני היציאה מחדר ההדבקה.

4. נתיחות של יתושים נגועים

הערה: חלק זה של הפרוטוקול מתבצע במעבדה.

1. העבירו את היתושים לצלחות פטרי מסומנות מרופדות בנייר סינון, תוך שמירה על הפרדה בין קבוצות הביקורת והבדיקה.
2. הניחו טיפה של תמיסת מלח עם אגירת פוספטים (PBS) על שקופית מיקרוסקופית (המסומנת על פי קבוצת הביקורת/בדיקה) והעבירו יתוש בודד מנייר הסינון ל-PBS.
3. הסר את המותניים מהדגימה המשותקת והנגועה על ידי הצמדת בית החזה של היתוש עם מחט החיתוך תוך משיכת מקטע הבטן^השביעי עם המלקחיים.
4. כאשר המעיים חשופים ונראים לעין, חפשו את הצינוריות המלפיגיאניות (איור 4A,B) כדי להבחין בין המעיים לבין השחלות. מוציאים אותו מה-PBS, מעבירים אותו לטיפה של 0.1% מרקורוכרום במגלשה חדשה במיקרוסקופ, ומשאירים את המעיים להכתים למשך 8-10 דקות.
5. לאחר ההכתמה, הניחו כיסוי על המעיים המוכתמים וצפו במעיים תחת תאורת שדה בהיר בהגדלה של 20x-40x (איור 4C,D).
6. רשום את הנוכחות של ומספר oocysts לכל midgut עבור כל קבוצת ביקורת וטיפול (קובץ משלים S2).
7. חשב את פעילות חסימת השידור באמצעות משוואה (1):
   %TBA (1)
   כאשר TBA = פעילות חוסמת שידור (ירידה בשכיחות oocyst); p = שכיחות oocyst; C = שליטה; ו- T = טיפול.
8. חשב את הפעילות המפחיתה את השידור באמצעות משוואה (2):
   %TRA = (2)
   כאשר TRA = פעילות מפחיתה תמסורת (הפחתה בעוצמת oocyst); I = עוצמת אוסיסט; C = שליטה; ו- T = טיפול.
   הערה: ייתכן שה-TBA לא יופחת באופן משמעותי, אך ניתן להבחין בהבדל משמעותי ב-TRA ולהיפך. זה תלוי בחומר הכימי המוערך.
9. בצע ניתוח סטטיסטי באמצעות מבחן t שאינו פרמטרי (Mann-Whitney).

תוצאות

המספר הכולל של דגימות הבקרה שנותחו היה 47, עם שכיחות ממוצעת של 89% ועוצמה של 9.5 oocysts לכל midgut (טבלה 1, כפי שפורסם קודם^{לכן 22}). עבור התרכובת MMV1581558, גודל המדגם הגיע לסך של 42 דגימות, עם שכיחות של 36% oocyst ועוצמה ממוצעת של 1.5 oocysts. זה מראה ירידה בשכיחות oocyst של 58% ו- TRA של 82% על פני כל שלושת ...

Discussion

כדי שפרוטוקול זה יבוצע בהצלחה, יש לתת תשומת לב לכל שלב, למרות שזה עשוי להיות תהליך מייגע ומייגע. אחד הצעדים החשובים ביותר הוא להבטיח כי תרבות gametocyte הוא באיכות טובה וכי הוא מורכב gametocytes בוגרים, עם יחס זכר:נקבה הנכון, לפני תחילת SMFA^23,24. במהלך ה-SMFA, חשוב גם לשמור על ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine intestine/	Butchery
Compound MMV1581558	MMV		Pandemic response box
Dissecting needles	WRIM		Custom made
falcon tube	Lasec
Glass feeders	Glastechniek Peter Coelen B.V.
Graphpad Prism (8.3.0)	Graphpad
Mercurochrome	Merck (Sigma-Aldrich)	129-16-8
Microscope slides	Merch (Sigma-Aldrich)	S8902
Parafilm	Cleansafe
PBS tablets	ThermoFisher Scientific	BP2944
Perspex biosafety cabinet	Wits University		Made by the contractors at Wits
Plastic cups (350 mL)	Plastic Land