Ensaio padrão de alimentação de membrana para a detecção de infecção por plasmodium falciparum em Vetores de Mosquito Anopheles

Resumo

O ensaio padrão de alimentação de membrana (SMFA) é considerado como o padrão-ouro para a avaliação e identificação de potenciais compostos antimaláricos. Este sistema de alimentação artificial é usado para infectar mosquitos para avaliar ainda mais os efeitos desses compostos na intensidade e prevalência do parasita Plasmodium falciparum .

Resumo

A malária continua sendo uma das doenças mais devastadoras do mundo e, até o momento, a região africana ainda é responsável por 94% de todos os casos em todo o mundo. Esta doença parasitária requer um parasita protozoário, um vetor de mosquito Anopheles e um hospedeiro de vertebrados. O gênero Anopheles compreende mais de 500 espécies, das quais 60 são conhecidas como vetores do parasita. O gênero parasita Plasmodium é composto por 250 espécies, e 48 delas estão envolvidas na transmissão da doença. Além disso, o parasita Plasmodium falciparum contribuiu para cerca de 99,7% dos casos de malária na África Subsaariana nos últimos anos.

Os gametócitos fazem parte do estágio sexual do parasita e são ingeridos pelo mosquito fêmea ao se alimentarem de um hospedeiro humano infectado. O desenvolvimento do parasita dentro do mosquito é potencializado por condições ambientais favoráveis no meio do mosquito. Aqui, a fusão dos gametas femininos e masculinos ocorre, e os ookinetes motile se originam. Os ookinetes entram no epitélio médio do mosquito, e ookinetas maduros formam oócitos, que, por sua vez, produzem esporozoites motile. Esses esporozoitas migram para as glândulas salivares do mosquito e são injetados enquanto um mosquito toma uma refeição de sangue.

Para fins de descoberta de drogas, os mosquitos foram artificialmente infectados com sangue infectado por gametocito no ensaio padrão de alimentação de membrana (SMFA). Para detectar infecção dentro do mosquito e/ou avaliar a eficácia dos compostos antimaláricos, os meios-médios dos mosquitos fêmeas foram removidos após a infecção e foram manchados com mercurocromo. Este método foi utilizado para melhorar a detecção visual de oocistos sob o microscópio para a determinação precisa da prevalência e intensidade do oócito.

Introdução

A malária, conhecida como uma das doenças mais destrutivas do mundo, ainda representa uma grande ameaça para vários países - especialmente aqueles dentro da região africana - e contribui para aproximadamente 95% dos casos em todo o mundo¹. Esta doença é causada por um parasita protozoário e, juntamente com seu vetor de mosquito Anopheles, esses culpados podem causar grandes danos ao hospedeiro humano². Mais especificamente, a espécie falciparum do gênero parasita Plasmodium é responsável por cerca de 99% dos casos de malária na África Subsaariana¹. Além disso, vários dos....

Protocolo

Consulte a Figura 1 para obter uma ilustração do protocolo. A liberação ética foi obtida do Comitê de Ética em Ciências da Saúde da Universidade de Pretória (506/2018) para a retirada e uso de sangue humano.

1. Cultura gametócica

NOTA: Antes da criação da SMFA, foi preparada uma cultura gametocito na Universidade de Pretória (ver Leitor et ^al.22 para o protocolo completo).

1. Prepare uma cultura de gametocito que consiste em gametocitos estágio V da cepa de parasitas NF54.
2. Certifique-se de que a gametocytemia da cultura está e....

Resultados

O número total de amostras de controle dissecadas foi de 47, com prevalência média de 89% e intensidade de 9,5 oocistos por midgut (Tabela 1, conforme publicado anteriormente²²). Para o composto MMV1581558, o tamanho da amostra atingiu um total de 42 espécimes, com prevalência de oocisto de 36% e intensidade média de 1,5 oocistos. Isso mostra uma redução na prevalência de oócito de 58% e uma TRA de 82% nas três réplicas biológicas (Tabela 1).

Discussão

Para que este protocolo seja executado com sucesso, deve-se dar atenção a cada passo, embora possa ser um processo tedioso e trabalhoso. Um dos passos mais importantes é garantir que a cultura gametócito seja de boa qualidade e que ela consista em gametocitos maduros, com a razão masculina/feminina correta, antes de iniciar a SMFA^23,24. Durante a SMFA, também é crucial manter a cultura gametocito na temperatura correta para evitar que os gametas machos exf.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine intestine/	Butchery
Compound MMV1581558	MMV		Pandemic response box
Dissecting needles	WRIM		Custom made
falcon tube	Lasec
Glass feeders	Glastechniek Peter Coelen B.V.
Graphpad Prism (8.3.0)	Graphpad
Mercurochrome	Merck (Sigma-Aldrich)	129-16-8
Microscope slides	Merch (Sigma-Aldrich)	S8902
Parafilm	Cleansafe
PBS tablets	ThermoFisher Scientific	BP2944
Perspex biosafety cabinet	Wits University		Made by the contractors at Wits
Plastic cups (350 mL)	Plastic Land