Ensayo estándar de alimentación por membrana para la detección de la infección por Plasmodium falciparum en mosquitos vectores Anopheles

Resumen

El ensayo estándar de alimentación por membrana (SMFA) se considera el estándar de oro para la evaluación e identificación de posibles compuestos antipalúdicos. Este sistema de alimentación artificial se utiliza para infectar mosquitos para evaluar más a fondo los efectos de tales compuestos sobre la intensidad y prevalencia del parásito Plasmodium falciparum .

Resumen

La malaria sigue siendo una de las enfermedades más devastadoras en todo el mundo y, hasta la fecha, la región africana sigue siendo responsable del 94% de todos los casos en todo el mundo. Esta enfermedad parasitaria requiere un parásito protozoario, un mosquito vector Anopheles y un huésped vertebrado. El género Anopheles comprende más de 500 especies, de las cuales 60 son conocidas como vectores del parásito. El género del parásito Plasmodium consta de 250 especies, y 48 de ellas están involucradas en la transmisión de enfermedades. Además, el parásito Plasmodium falciparum ha contribuido a un estimado del 99,7% de los casos de malaria en el África subsahariana en los últimos años.

Los gametocitos forman parte de la etapa sexual del parásito y son ingeridos por el mosquito hembra al alimentarse de un huésped humano infectado. El desarrollo adicional del parásito dentro del mosquito se ve reforzado por las condiciones ambientales favorables en el intestino medio del mosquito. Aquí, tiene lugar la fusión de los gametos femeninos y masculinos, y se originan los ookinetes móviles. Los ookinetes entran en el epitelio del intestino medio del mosquito, y los ookinetes maduros forman ooquistes, que, a su vez, producen esporozoítos móviles. Estos esporozoítos migran a las glándulas salivales del mosquito y se inyectan cuando un mosquito toma una comida de sangre.

Para fines de descubrimiento de fármacos, los mosquitos se infectaron artificialmente con sangre infectada con gametocitos en el ensayo estándar de alimentación por membrana (SMFA). Para detectar la infección dentro del mosquito y/o para evaluar la eficacia de los compuestos antipalúdicos, los intestinos medios de los mosquitos hembra se eliminaron después de la infección y se tiñeron con mercurocromo. Este método se utilizó para mejorar la detección visual de ooquistes bajo el microscopio para la determinación precisa de la prevalencia e intensidad del ooquiste.

Introducción

La malaria, conocida como una de las enfermedades más destructivas del mundo, todavía representa una gran amenaza para varios países, especialmente aquellos dentro de la región africana, y contribuye a aproximadamente el 95% de los casos en todo el mundo¹. Esta enfermedad es causada por un parásito protozoario y, junto con su mosquito vector Anopheles, estos culpables pueden causar un gran daño al huésped humano². Más específicamente, la especie falciparum del género parásito Plasmodium es responsable de aproximadamente el 99% de los casos de malaria en el África subsahariana¹. Además de esto, varios vectores principales del mosquito Anopheles (incluidos An. gambiae Giles, An. arabiensis Patton, An. coluzzii Coetzee & Wilkerson sp.n. y An. funestus Giles) podrían ser culpados por más del 95% de la transmisión de parásitos a nivel mundial 3,4,5,6,7,8 . Para que se establezca la compañía ideal parásito-vector, el mosquito vector debe ser susceptible al parásito y ser capaz de transmitirlo⁹. Además, tanto el vector como el parásito deben superar las barreras físicas para formar la combinación infectiva perfecta: el mosquito vector debe ser capaz de mantener el desarrollo del parásito y el parásito debe tener la capacidad de superar los mecanismos de defensa del huésped^10,11.

Los gametocitos, la etapa sexual del parásito P. falciparum, juegan un papel crucial en la conexión del vector y los socios parásitos¹². El desarrollo sexual tiene lugar in vivo, y la gametocitogénesis describe el proceso de diferenciación de gametocitos maduros en microgametos masculinos móviles y macrogametos femeninos¹³. Otro proceso que tiene lugar dentro del mosquito es la exflagelación, el proceso durante el cual el gametocito masculino se transforma en gametos y emerge de los glóbulos rojos absorbidos durante una comida de sangre¹¹. Se sugiere además que el proceso de exflagelación se vea reforzado por un cambio favorable en el entorno del intestino medio del mosquito¹⁴. Después de la exflagelación, un cigoto se forma por la fusión de los gametos masculino y femenino¹³. Del cigoto, surge un ookinete móvil que se mueve de la harina de sangre al epitelio del intestino medio del mosquito¹³. Aquí, el ookinete madura y se forma un ooquiste, que, a su vez, produce esporozoítos móviles^13,15. Los esporozoítos luego migran a las glándulas salivales del mosquito y, a medida que el mosquito toma una comida de sangre de su huésped, estos esporozoítos se inyectan en el torrente sanguíneo del huésped¹⁵.

Las intervenciones de control de la malaria, que combinan estrategias de control de vectores y el uso de medicamentos antipalúdicos eficaces, se han vuelto cruciales para combatir esta enfermedad¹⁵. Con un aumento de la resistencia a los parásitos y mosquitos, la urgencia de la identificación de nuevos compuestos antipalúdicos está aumentando¹⁶. Por lo tanto, la evaluación in vivo de los compuestos bloqueadores de la transmisión^{es importante 16}. Después del desarrollo de tales fármacos eficaces bloqueadores de la transmisión, el SMFA se ha utilizado para evaluar si estos compuestos inhiben el desarrollo sexual de P. falciparum en el mosquito Anopheles ^17,18,19. Este ensayo ha ganado reconocimiento desde los años 1970-1980 como el estándar de oro para evaluar el bloqueo de la transmisión^20,21. Este ensayo proporciona una alternativa más barata que otros ensayos como RT-qPCR, que requiere equipo especializado. Además, no se necesitan pacientes para ejecutar los experimentos. Este ensayo también implica la provisión de sangre inducida por gametocitos a mosquitos hembra, que luego se diseccionan para evaluar si el desarrollo de ooquistes está presente²¹. Esto permite la cuantificación de gametocitos y la detección de ooquistes deformados debido a los compuestos²². Para que un compuesto sea clasificado como efectivo, la prevalencia (la proporción de mosquitos que albergan al menos un ooquiste en el intestino medio) y el número de ooquistes (intensidad) en el intestino medio del mosquito deben ser evaluados para evaluar la inhibición de la infección 17,21,22.

Protocolo

Consulte la figura 1 para obtener una ilustración del protocolo. Se obtuvo la autorización ética del Comité de Ética de Ciencias de la Salud de la Universidad de Pretoria (506/2018) para la extracción y el uso de sangre humana.

1. Cultura de gametocitos

NOTA: Antes de establecer el SMFA, se preparó un cultivo de gametocitos en la Universidad de Pretoria (ver Reader et ^al.22 para el protocolo completo).

1. Preparar un cultivo de gametocitos que consista en gametocitos en estadio V de la cepa del parásito NF54.
2. Asegurar que la gametocitemia del cultivo esté entre el 1,5% y el 2,5%, con un hematocrito del 50% en suero masculino A+, al que se añaden glóbulos rojos frescos.
3. Separar el cultivo en diferentes matraces y añadir 2 μM de cada compuesto para cada tratamiento respectivo 48 h antes de realizar el AMGN. Deje el grupo de control sin tratar.
4. Evaluar el cultivo de gametocitos poco antes de realizar el AMAF para asegurar la exflagelación de gametos masculinos, con presencia de una relación hembra:macho de 3:1.

2. Infección artificial de mosquitos a través del SMFA

NOTA: Bioseguridad: los mosquitos infectados deben alojarse en una instalación de nivel de bioseguridad 2 (BSL2) con acceso restringido.

1. Usando un aspirador bucal, coloque 25 mosquitos hembra An. gambiae no alimentados en una taza de alimentación de 350 ml. Haga lo mismo para cada taza de tratamiento y etiquete las tazas claramente de acuerdo con si se van a usar como grupos de control o de tratamiento. Elija el número de tazas por tratamiento de acuerdo con el número de réplicas técnicas incluidas.
   NOTA: Los mosquitos colonia entre 5 y 7 días de edad se utilizan en una evaluación típica del compuesto de bloqueo de la transmisión. Matar de hambre a los mosquitos durante 3-4 h o más antes de la alimentación con sangre facilitará la absorción de sangre durante SMFA.
2. Conecte el sistema de alimentación de vidrio al baño de agua y mantenga la temperatura a 37 °C.
   NOTA: El alimentador de vidrio consta de dos brazos, que están conectados al tubo de silicona al que está conectado el baño de agua (Figura 2). La estructura hueca del alimentador permite que el agua circule y mantenga la temperatura de la sangre.
3. Prepare el intestino de vaca (o membrana sintética) enjuagándolo con agua del grifo y córtelo en trozos que se ajusten a cada alimentador. Cubra cada alimentador y sujete la membrana con una banda elástica.
   NOTA: No se necesitó autorización ética para el intestino, ya que se compró en una carnicería local, donde se vende al público para la preparación de alimentos.
4. Coloque las copas de infección debajo de los comederos, con la membrana colocada encima de la red de la taza.
5. Agregue 1 ml de sangre infectada con gametocitos a los alimentadores de las copas de control y sangre infectada con gametocitos con compuesto agregado a cada comedero y taza compuestos correspondientes.
6. Deje que los mosquitos se alimenten durante aproximadamente 40 minutos con los comederos descubiertos.
   NOTA: La alimentación se realiza en condiciones insectarias (25 °C, 80% de humedad relativa) en la oscuridad. El diámetro de un alimentador es de aproximadamente 13 mm.
7. Después de la alimentación, retire los comederos de las tazas, enjuague los comederos y trate el exceso de sangre con hipoclorito.
8. Retire los mosquitos no alimentados de la taza derribando todos los mosquitos en hielo (durante 1-2 minutos) y separando los mosquitos no alimentados de los que han tomado una comida de sangre. Busque abdómenes hinchados y rojos (que indican sangre) para distinguir los mosquitos alimentados y completamente hinchados de los no alimentados (Figura 3).
9. Coloque las tazas de infección en la cámara de bioseguridad (Figura Suplementaria S1) y proporcione a cada taza una almohadilla de agua azucarada al 10%, reemplazando el agua azucarada en días alternos durante 8-10 días.

3. Preparación de mosquitos infectados

NOTA: Esta parte del protocolo tiene lugar dentro de la sala de infección BSL2. Solo el personal autorizado y capacitado puede ingresar a la sala de infección donde se alojan los mosquitos infectados. Los mosquitos se mantienen en vasos modificados que contienen solo un punto de entrada, que se sella automáticamente cuando se retira el aspirador bucal. Estas tazas se colocan dentro de un recipiente transparente y termoplástico para evitar el escape. El contenedor se encuentra en la sala de infección detrás de un sistema de doble puerta. Todos los protocolos necesarios deben estar en su lugar para la exposición accidental a mosquitos infectados (Archivo Suplementario S1). Los protocolos son específicos de cada país y dependen de los requisitos de la institución.

1. En los días 8-10 después de la alimentación de la infección, derribe a los mosquitos infectados colocándolos en hielo y transfiriéndolos a tubos etiquetados con etanol al 70% (manteniendo separados los mosquitos de cada grupo de control y tratamiento).
2. Asegúrese de que todos los mosquitos estén muertos antes de salir de la sala de infección.

4. Disecciones de mosquitos infectados

NOTA: Esta parte del protocolo se lleva a cabo en el laboratorio.

1. Transfiera los mosquitos a placas de Petri etiquetadas forradas con papel de filtro, manteniendo separados los grupos de control y de prueba.
2. Coloque una gota de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en un portaobjetos de microscopio (marcado de acuerdo con el grupo de control/prueba) y transfiera un mosquito individual del papel de filtro al PBS.
3. Extraer el intestino medio de la muestra infectada inmovilizada sujetando el tórax del mosquito con la aguja de disección mientras se tira del^7º segmento abdominal con los fórceps.
4. Con el intestino expuesto y visible, busque los túbulos de Malpighian (Figura 4A, B) para distinguir el intestino de los ovarios. Retírelo del PBS, transfiéralo a una gota de mercurocromo al 0,1% en un nuevo portaobjetos de microscopio y deje que el intestino se tiñe durante 8-10 minutos.
5. Después de la tinción, coloque un cubreobjetos en el intestino teñido y vea el intestino bajo iluminación de campo claro con un aumento de 20x-40x (Figura 4C, D).
6. Registre la presencia y el número de ooquistes por intestino medio para cada grupo de control y tratamiento (Archivo Suplementario S2).
7. Calcula la actividad de bloqueo de transmisión usando la Ecuación (1):
   %TBA (1)
   donde TBA = actividad de bloqueo de la transmisión (reducción de la prevalencia de ooquistes); p = prevalencia de ooquistes; C = control; y T = tratamiento.
8. Calcula la actividad reductora de la transmisión usando la ecuación (2):
   %TRA = (2)
   donde TRA = actividad reductora de la transmisión (reducción de la intensidad del ooquiste); I = intensidad del ooquiste; C = control; y T = tratamiento.
   NOTA: Es posible que la TBA no se reduzca significativamente, pero se puede observar una diferencia significativa en la TRA y viceversa. Esto depende del material químico que se evalúa.
9. Realizar análisis estadísticos utilizando la prueba t no paramétrica (Mann-Whitney).

Resultados

El número total de especímenes control disecados fue de 47, con una prevalencia promedio de 89% y una intensidad de 9,5 ooquistes por intestino medio (Tabla 1, como se publicó anteriormente²²). Para el compuesto MMV1581558, el tamaño de la muestra alcanzó un total de 42 especímenes, con una prevalencia de ooquistes del 36% y una intensidad promedio de 1,5 ooquistes. Esto muestra una reducción en la prevalencia de ooquistes del 58% y un TRA del 82% en las tres réplicas biol...

Discusión

Para que este protocolo se ejecute con éxito, se debe prestar atención a cada paso, aunque pueda ser un proceso tedioso y laborioso. Uno de los pasos más importantes es asegurar que el cultivo de gametocitos sea de buena calidad y que esté formado por gametocitos maduros, con la proporción correcta macho:hembra, antes de iniciar el SMFA^23,24. Durante el SMFA, también es crucial mantener el cultivo de gametocitos a la temperatura correcta para evitar que los...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine intestine/	Butchery
Compound MMV1581558	MMV		Pandemic response box
Dissecting needles	WRIM		Custom made
falcon tube	Lasec
Glass feeders	Glastechniek Peter Coelen B.V.
Graphpad Prism (8.3.0)	Graphpad
Mercurochrome	Merck (Sigma-Aldrich)	129-16-8
Microscope slides	Merch (Sigma-Aldrich)	S8902
Parafilm	Cleansafe
PBS tablets	ThermoFisher Scientific	BP2944
Perspex biosafety cabinet	Wits University		Made by the contractors at Wits
Plastic cups (350 mL)	Plastic Land