Anopheles 모기 벡터에서 플라스모듐 팔시파룸 감염 검출을 위한 표준 막 공급 분석

요약

표준 막 공급 분석(SMFA)은 잠재적인 항말라리아 화합물의 평가 및 식별을 위한 황금 표준으로 간주됩니다. 이 인공 먹이 시스템은 Plasmodium falciparum 기생충의 강도와 유병률에 대한 이러한 화합물의 영향을 추가로 평가하기 위해 모기를 감염시키는 데 사용됩니다.

초록

말라리아는 전 세계적으로 가장 파괴적인 질병 중 하나로 남아 있으며 현재까지 아프리카 지역은 여전히 전 세계 모든 사례의 94%를 차지하고 있습니다. 이 기생충 질병에는 원생 동물 기생충, Anopheles 모기 벡터 및 척추 동물 숙주가 필요합니다. Anopheles 속은 500 종 이상으로 구성되며 그 중 60 종은 기생충의 벡터로 알려져 있습니다. Plasmodium 기생충 속은 250 종으로 구성되며이 중 48 종은 질병 전파에 관여합니다. 또한, Plasmodium falciparum 기생충은 최근 몇 년 동안 사하라 사막 이남의 아프리카에서 말라리아 사례의 약 99.7 %에 기여했습니다.

배우자 세포는 기생충의 성기의 일부를 형성하며 감염된 인간 숙주를 먹일 때 암컷 모기에 의해 섭취됩니다. 모기 내 기생충의 추가 발달은 모기의 중추에있는 유리한 환경 조건에 의해 향상됩니다. 여기에서 암컷과 수컷 배우자의 융합이 일어나고 운동성 ookinetes가 시작됩니다. ookinetes는 모기의 중추 상피에 들어가고, 성숙한 ookinetes는 oocysts를 형성하고, 차례로 운동성 포자 소체를 생성합니다. 이 포자소체는 모기의 침샘으로 이동하여 모기가 혈액 식사를 할 때 주입됩니다.

약물 발견 목적을 위해, 모기는 표준 막 공급 분석 (SMFA)에서 배우자 세포에 감염된 혈액에 인위적으로 감염되었다. 모기 내 감염을 감지하고 / 또는 항 말라리아 화합물의 효능을 평가하기 위해 암컷 모기의 중추를 감염 후 제거하고 수주로 염색했습니다. 이 방법은 난포 유병률과 강도를 정확하게 결정하기 위해 현미경으로 난포낭의 시각적 검출을 향상시키는 데 사용되었습니다.

서문

전 세계적으로 가장 파괴적인 질병 중 하나로 알려진 말라리아는 여전히 여러 국가, 특히 아프리카 지역 내 국가에 큰 위협이 되고^{있으며 전 세계} 사례의 약 95%에 기여합니다1. 이 질병은 원생 동물 기생충에 의해 발생하며 Anopheles 모기 벡터와 함께 이러한 범인은 인간 숙주²에 큰 해를 끼칠 수 있습니다. 보다 구체적으로, Plasmodium 기생충 속의 falciparum 종은 사하라 사막 이남의 아프리카¹에서 말라리아 사례의 약 99 %를 차지합니다. 이 외에도 몇 가지 주요 Anopheles 모기 벡터 (An. gambiae Giles, An. arabiensis Patton, An. coluzzii Coetzee & Wilkerson sp.n. 및 An. funestus Giles 포함)는 전 세계적으로 기생충 전파의 95 % 이상을 차지할 수 있습니다 3,4,5,6,7,8

프로토콜

프로토콜에 대한 설명은 그림 1 을 참조하십시오. 프리토리아 대학 보건 과학 윤리위원회 (506/2018)로부터 인간 혈액의 회수 및 사용에 대한 윤리적 허가를 받았습니다.

1. 배우자 세포 배양

참고: SMFA를 설정하기 전에 프리토리아 대학에서 배우자 세포 배양을 준비했습니다(전체 프로토콜은 Reader et ^al.22 참조).

1. NF54 기생충 균주로부터의 V 기 배우자 세포로 구성된 배우자 세포 배양을 준비하십시오.
2. 배양의 배우자 세포 혈증이 1.5 %에서 2.5 % 사이인지 확인하고 신선한 적혈구가 첨가 된 A + 남성 혈청에 50 % 헤마토크릿이 있는지 확인하십시오.
3. 배양물을 상이한 플라스크로 분리하고, SMFA를 실시하기 48시간 전에 각각의 처리에 대해 2μM의 각각의 화합물을 첨가한다. 대조군을 치료하지 않고 그대로 두십시오.
4. SMFA를 수행하기 직전에 배우자 세포 배양을 평가하여 3 : 1 여성 : 남성 비율의 존재로 남성 배우자의 편모를 보장합니다.

결과

해부된 대조군 표본의 총 수는 47개였으며, 평균 유병률은 89%였으며 중추당 난포의 강도는 9.5개였습니다(표 1, 이전에 발표된²²개). 화합물 MMV1581558의 경우 샘플 크기는 총 42 개의 표본에 도달했으며 난포 유병률은 36 %이고 평균 강도는 1.5 oocysts입니다. 이것은 세 가지 생물학적 복제 모두에서 58%의 난포 유병률과 82%의 TRA 감소를 보여줍니다(표 1).

토론

이 프로토콜이 성공적으로 실행되려면 지루하고 힘든 프로세스일지라도 각 단계에 주의를 기울여야 합니다. 가장 중요한 단계 중 하나는 SMFA^23,24를 시작하기 전에 배우자 세포 배양의 품질이 양호하고 올바른 남성 : 여성 비율을 가진 성숙한 배우자 세포로 구성되어 있는지 확인하는 것입니다. SMFA 기간 동안 수컷 배우자가 모기에 들어가기 전에 각색이.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine intestine/	Butchery
Compound MMV1581558	MMV		Pandemic response box
Dissecting needles	WRIM		Custom made
falcon tube	Lasec
Glass feeders	Glastechniek Peter Coelen B.V.
Graphpad Prism (8.3.0)	Graphpad
Mercurochrome	Merck (Sigma-Aldrich)	129-16-8
Microscope slides	Merch (Sigma-Aldrich)	S8902
Parafilm	Cleansafe
PBS tablets	ThermoFisher Scientific	BP2944
Perspex biosafety cabinet	Wits University		Made by the contractors at Wits
Plastic cups (350 mL)	Plastic Land