Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מציגים פרוטוקול לבידוד ולשבירת הקפאה של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) שמקורן בתאי אורותל סרטניים. טכניקת ההקפאה-שבר חשפה את הקוטר והצורה של כלי הרכב החשמליים וכמאפיין ייחודי - את הארגון הפנימי של ממברנות ה-EV. אלה הם בעלי חשיבות עצומה בהבנת האופן שבו כלי רכב חשמליים מתקשרים עם הממברנות המקבלות.

Abstract

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן מבנים מוגבלי ממברנה המשתחררים מהתאים לחלל החוץ-תאי ומעורבים בתקשורת בין-תאית. כלי רכב חשמליים מורכבים משלוש אוכלוסיות של שלפוחיות, כלומר מיקרו-ווסיקלים (MVs), אקסוזומים וגופים אפופטוטיים. הממברנה המגבילה של כלי רכב חשמליים מעורבת באופן מכריע באינטראקציות עם התאים המקבלים, מה שעלול להוביל להעברת מולקולות פעילות ביולוגית לתאים המקבלים, וכתוצאה מכך להשפיע על התנהגותם. טכניקת מיקרוסקופיית האלקטרונים של שבר ההקפאה משמשת לחקר הארגון הפנימי של ממברנות ביולוגיות. כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד MV מתאי אורותל סרטניים בתרבית ושבר בהקפאה של MVs בשלבים של הקפאה מהירה, שבירת, ייצור וניקוי ההעתקים, וניתוחם באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה. התוצאות מראות כי פרוטוקול הבידוד מניב אוכלוסייה הומוגנית של כלי רכב חשמליים, התואמת את הצורה והגודל של MVs. חלקיקים תוך-ממברניים נמצאים בעיקר בפנים הפרוטופלסמיות של הממברנה המגבילה. לפיכך, הקפאה-שבר היא הטכניקה המועדפת לאפיון הקוטר, הצורה וההתפלגות של חלבוני הממברנה של MVs. הפרוטוקול המוצג חל על אוכלוסיות אחרות של כלי רכב חשמליים.

Introduction

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן שלפוחיות מוגבלות ממברנה המשתחררות מהתאים אל החלל החוץ-תאי. שלוש האוכלוסיות העיקריות של כלי רכב חשמליים הן אקסוזומים, מיקרו-ווסיקלים (MVs) וגופים אפופטוטיים, הנבדלים זה מזה במקורם, בגודלם ובהרכבם המולקולרי 1,2,3. הרכב כלי הרכב החשמליים משקף את הפרופיל המולקולרי של התא התורם ואת מצבו הפיזיולוגי (כלומר בריא או חולה)4,5. זה נותן לרכבים חשמליים פוטנציאל עצום באבחון, פרוגנוזה וטיפול במחלות אנושיות, ויש להם יישומים רפואיים מבטיחים לשימוש ברפואה מותאמת אישית 6,7,8.

כלי רכב חשמליים הם מתווכים של תקשורת בין-תאית. הם מכילים חלבונים פעילים ביולוגית, שומנים ורנ"א, המפריעים לתהליכים ביולוגיים בתא המקבל ויכולים לשנות את התנהגותו 9,10. עם זאת, ההרכב של הממברנה המגבילה EV הוא חיוני לאינטראקציה עם קרום התא המקבל.

המקורות של כלי רכב חשמליים הם נוזלי גוף ומדיה תרבותית מותנית. כדי לבודד אוכלוסיית ר"ח, יש להשתמש בטכניקת בידוד מתאימה. לדוגמה, צנטריפוגה ב-10,000 × גרם מניבה שבר מועשר ב-MVs, בעוד שכוחות צנטריפוגליים של ≥100,000 × גרם מניבים שבר מועשר באקסוזומים11,12. החלק המבודד של כלי הרכב החשמליים חייב להיות מאומת במונחים של טוהר, גודל וצורה. לשם כך המליצה האגודה הבינלאומית לבועיות חוץ-תאיות 2018 על שלושה סוגים של טכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה: מיקרוסקופיית אלקטרונים, מיקרוסקופיית כוח אטומי ומיקרוסקופיה מבוססת מיקרוסקופיית אור ברזולוציה גבוהה13. אף אחת מהטכניקות הללו לא יכולה לספק מידע על פנים ממברנת EV.

מיקרוסקופיית אלקטרונים של שבר הקפאה היא טכניקה של שבירת דגימות קפואות כדי לחשוף את המבנים הפנימיים שלהן, במיוחד מתן מבט על פנים הממברנה. שלבי הכנת הדגימה הם (1) הקפאה מהירה, (2) שבירה, (3) יצירת ההעתק, ו-(4) ניקוי ההעתק14. בשלב 1, הדגימה קבועה (אופציונלית) כימית, מוגנת בהקפאה עם גליצרול, ומקפואה בפראון נוזלי. בשלב 2, הדגימה הקפואה נשברת ביחידת הקפאה-שבר, החושפת את פנים דו-שכבת הממברנה. בשלב 3, הפרצופים השבורים החשופים מוצללים עם פלטינה (Pt) ופחמן (C) כדי לייצר העתקים. בשלב 4, החומר האורגני מוסר. ההעתק מנותח במיקרוסקופ האלקטרונים ההולכה (TEM). לצורך פרשנות מדויקת של המיקרוגרפים, יש לעקוב אחר ההנחיות להתמצאותם הנכונה14,15. בקצרה, כיוון הצללים במיקרוגרף הוא הפניה להתמצאות במיקרוגרף (כלומר, כדי לקבוע את כיוון ההצללה של Pt) וכתוצאה מכך, לקבוע צורות קמורות וקעורות (איור 1). ניתן לראות שתי תצוגות פנים המכונות פרצופים שבורים של דו-שכבת הממברנה כתוצאה מפיצול הממברנה על ידי שבירת הקפאה: הפנים הפרוטופלסמיות (P-face) והפנים האקסופלסמיות (E-face). פני ה-P מייצגים את עלון הממברנה הסמוך לפרוטופלסמה של התא, ואילו פני ה-E מייצגים את עלון הממברנה הסמוך לחלל החוץ-תאי. חלבוני ממברנה אינטגרליים והאסוציאציות שלהם נראים כחלקיקים תוך-ממברניים בולטים14,15.

כאן, המטרה היא ליישם את טכניקת ההקפאה-שבר כדי לאפיין MVs במונחים של גודל, צורה ומבנה הממברנה המגבילה שלהם. כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד ולשבירת הקפאה של MVs שמקורם בתאי שתן סרטניים פולשניים אנושיים.

Protocol

1. גידול תאי אורותל סרטניים ובידוד של כלי רכב חשמליים

הערה: מוצג פרוטוקול לקבלת כלי רכב חשמליים מקו תאים פולשני של סרטן שלפוחית השתן האנושית (T24). עם זאת, יש לייעל את תנאי התרבות כדי להשתמש בסוגי תאים אחרים.

  1. תאי צלחת T24 עם צפיפות של 3 × 104 תאים/ס"מ2 בשלושה צלוחיות (משטח גידול של 75 ס"מ2) ומתחילים בגידול התאים באינקובטור CO2 למשך 3 ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 (איור 2A).
    1. השתמשו במדיום תרבית עבור תאי T24 בתערובת של 1:1 (v/v) של A-DMEM ו-F12 בתוספת 5% סרום בקר עוברי (FBS), גלוטמקס של 4 mM, סטרפטומיצין של 100 מ"ג/מ"ל ו-100 פניצילין U/mL.
      הערה: הבידוד הבא מניב רכבים חשמליים מועשרים ברכבי MV. לפני תחילת הבידוד, בדקו את התאים באמצעות מיקרוסקופ אור כדי לוודא את הכדאיות והמפגש (איור 2B). התחילו לאסוף את כלי הרכב החשמליים ממדיית התרבית המותנית כאשר תאי T24 נמצאים במפגש של 70%.
  2. אסוף את מדיום התרבות עם MVs עם פיפטה מצלוחיות (T75) לתוך צינורות צנטריפוגה חרוטיים (איור 2C). צנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס (איור 2D).
  3. אספו בזהירות את חומר העל לתוך צינור צנטריפוגה חדש עם הפיפטה (איור 2E).
  4. צנטריפוגה הסופרנטנט ב 2,000 × גרם במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  5. אספו בזהירות את הסופרנטנט עם הפיפטה לתוך צינור צנטריפוגה חדש.
  6. צנטריפוגה ב 10,000 × גרם במשך 40 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. חפשו נוכחות של כדור לבנבן בתחתית הצינור.
    הערה: במידת הצורך, שנה את רוטור הצנטריפוגה כדי להגיע לכוח ה- g הנדרש. כדור ה-EV נראה ככדור לבן בתחתית שפופרת הצנטריפוגה (איור 2F); סמן את מיקומו כדי למנוע אובדן של הכדור במהלך הצינורות (איור 2G).
  7. יש להשליך בזהירות את הסופרנטנט עם פיפטה. לכדור, הוסיפו 1.5 מ"ל של PBS והחזירו את הכדור המכיל MVs. הכניסו את המתלים לצינור צנטריפוגה חדש.
  8. צנטריפוגה ב 10,000 × גרם במשך 40 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולחפש את נוכחותו של כדור לבן בתחתית הצינור.
    הערה: גלולת EV נראית ככתם לבן בתחתית צינור הצנטריפוגה; סמן את מיקומו כדי למנוע אובדן של הכדור במהלך הצינור.
  9. יש להשליך בזהירות את הסופרנטנט עם פיפטה. מוסיפים בעדינות את ה-fixative, 2.5% glutaraldehyde ב-0.1 M חיץ סודיום קקודילאט (pH 7.2). השאירו למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס (איור 2H).
    אזהרה: גלוטארלדהיד ונתרן קקודילאט רעילים. לעבוד במכסה אדים, ללבוש כפפות מגן ולהשליך אותן כראוי.
  10. בזהירות להסיר את הקיבוע עם פיפטה. הוסיפו לכדורית חיץ כביסה (0.1 מ' חיץ נתרן קקודילאט). השאירו למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס מבלי לבצע שימוש חוזר בכדור.

2. הקפאת כלי רכב חשמליים

הערה: לפני הקפאה, תחילה ההגנה על הדגימות עם גליצרול.

  1. מכינים 0.1 M חיץ נתרן קקודילאט. הסירו את מאגר הכביסה והוסיפו 50 μL של 30% גליצרול ב-0.1 M cacodylate buffer. בצעו שימוש חוזר עדין ברכבים החשמליים כדי להפוך את הפתרון להומוגני. אינקובציה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  2. נקו את נושאי הנחושת עם בור מרכזי באמבטיה העל-קולית עם כלורופורם למשך 5 דקות (איור 3A). ייבשו אותם באוויר וסמנו אותם בצבעים אם אתם משתמשים בדגימות מרובות (איור 3B). עד לשימוש, יש לשמור את המנשאים במקום יבש ונקי (למשל, על נייר עדשה בצלחת פטרי). אין לגעת במנשאים בידיים חשופות.
    1. הכינו פיפטות, תמיסות, נייר סינון, פינצטה, סטריאומיקרוסקופ, בקבוקון דיואר עם פריון וחנקן נוזלי (LN2), מוט מתכת וקריוביצ'ים. קררו אותו עם LN2.
      אזהרה: ללבוש ציוד מגן ולעבוד בהתאם בעת טיפול LN2 ו freon מקורר.
  3. בצעו שוב שימוש חוזר ברכבים החשמליים לפני הקפאה. הימנעו מהיווצרות בועות אוויר.
    הערה: בצע שלבים 2.4-2.7 במהירות.
  4. עבודה תחת סטריאומיקרוסקופ (איור 3C). העבר 1.5-1.7 μL של הדגימה לתוך הבור המרכזי של נושא הנחושת כדי ליצור טיפה קמורה המגיעה גבוה יותר מקצה נושא הנחושת תוך אי-שפיכת הדגימה על הקצה (איור 3D). במקרה של overspill, השתמש בנייר מסנן כדי לייבש את הטבעת החיצונית של המנשא.
  5. ערבבו פריון מוצק עם מוט מתכת כדי לנזול אותו שוב (איור 3E).
  6. אחזו בטבעת החיצונית של מנשא הנחושת בפינצטה והטבלו אותה לתוך פריון מקורר עם רעד עדין של פינצטה במשך 8 שניות (איור 3F). לאחר 8 שניות, העבירו במהירות את המוביל לבקבוקון אחר של דיואר מלא ב-LN2.
  7. המשך מיד עם שבירת או אחסון הדגימות ב- LN2. במקרה האחרון, סמנו קריוביאל וקררו את קצות הבקבוקון והפינצטה על ידי טבילתם לתוך LN2 (איור 3G). תחת LN2, אספו מנשאי נחושת קפואים לתוך הבקבוקון, סגרו אותו ואחסנו אותם במיכל LN2 (איור 3H) עד להקפאת ההקפאה.

3. שבירת כלי רכב חשמליים ויצירת העתקים

הערה: הכן את יחידת ההקפאה-שבירת ההקפאה בהתאם להוראות ההפעלה של היצרן. (איור 4א). נקו את תא היחידה. מיקום תותחי פלטינה (Pt/C) ופחמן (C) בזוויות של 45° ו-90°, בהתאמה (איור 4B).

  1. הפעל את מערכת ואקום היחידה. כאשר מגיעים ללחץ של 6.6 × 10−2 Pa (5 × 10−4 Torr), יש לקרר את תא היחידה ל-−-150°C.
  2. העבירו את נושאי הנחושת עם דגימות קפואות ליחידת שבירת הקפאה באמצעות פינצטה יבשה (איור 4C). השתמש cryotransfer או לעבוד מהר כדי למנוע הפשרה של הדגימה ואת התצהיר של גבישי הקרח. אבטח את הספקים על טבלת הדגימות.
  3. המתן עד שהוואקום יגיע שוב ל-6.6 × 10−2 Pa (5 × 10−4 Torr), ולאחר מכן הגדר את טמפרטורת הסכין ל-100−100°C (איור 4D).
  4. המתן עד שהוואקום יגיע ל-1.0 × 10−3 Pa (8 × 10−6 Torr).
  5. שימו לב לדגימה באמצעות משקפת והתקרבו בזהירות לסכין (איור 4E).
  6. התחילו לנתח את הדגימה על ידי הפעלת התנועה הממונעת של הסכין (איור 4F) ומקטעה עד שפני השטח של הדגימה יהיו חלקים (איור 4G).
  7. לצורך שבירת, כבו את התנועה הממונעת של הסכין והמשיכו בשליטה ידנית איטית על הסכין, ובכך שברו את הדגימה (איור 4H). על מנת להגן על המשטח השבור מפני יצירת גבישי קרח ופסולת עד להצללה, הזיזו את הסכין מעל הדגימה השבורה.
  8. המשך עם הצללת ה-Pt ב-45° (איור 4I, J).
    1. הכינו שעון עצר ו/או הפעילו את צג גביש הקוורץ ביחידת ההקפאה-שבירת ההקפאה, שתאפשר פיקוח על עובי ה-Pt על הדגימה. העובי המומלץ של שכבת ה-Pt כפי שנמדד בצג גביש הקוורץ הוא 2.5 ננומטר, אשר מתאים ל-4 שניות של הצללה במתח ובזרם גבוהים נתונים (כלומר, מהירות ההצללה של Pt היא 0.63 ננומטר לשנייה).
    2. לפני שתתחיל את ההצללה, הרחיקו את הסכין מהדגימה. הפעילו מתח גבוה על אקדח ה-Pt/C (1,600 וולט), והגדילו את הזרם ל-60 mA. ניצוצות של Pt צריכים להופיע וצריכים להתחיל לצלול על המדגם. בשלב זה, התחל את הספירה לאחור של 4 s ו/ או התבונן ואתר את המיקום של Pt על צג גביש הקוורץ.
      הערה: העובי המומלץ של שכבת C הוא 2.5 ננומטר, אשר מתאים ל-10 שניות של הצללה במתח ובזרם גבוהים מסוימים.
    3. כבה את הזרם ואת המתח הגבוה כאשר מתקבל העובי הרצוי של Pt.
  9. המשך עם הצללת C ב- 90° (כלומר, מהירות הצללת C היא 0.25 ננומטר לשנייה).
    1. החל מתח גבוה על אקדח C (1,900 V), הגדל את הזרם ל -90 mA, וניצוצות של C צריכים להופיע ולהתחיל לצלול על הדגימה; באותו רגע, התחל את הספירה לאחור של 10 שניות. כבה את הזרם ואת המתח הגבוה כאשר מתקבל העובי הרצוי של C.

4. ניקוי ההעתקים וניתוח העתקים

  1. השתמשו במנשאי הנחושת מטבלת הדגימות והעבירו אותם עם פינצטה למים מזוקקים בטמפרטורת החדר בצלחת חרסינה בת 12 בארות (איור 4K). ההעתקים יצופו על פני המים, בזמן שהנשאים ישקעו (איור 4L).
  2. מעבירים את ההעתקים עם לולאת חוט ממים מזוקקים לבאר עם נתרן היפוכלוריט. מכסים ועוזבים את הלילה בטמפרטורת החדר במכסה אדים.
    אזהרה: נתרן היפוכלוריט הוא רעיל. לעבוד במכסה אדים, ללבוש כפפות מגן ולהשליך אותן כראוי.
  3. מעבירים את ההעתקים ל-ddH2O ושוטפים למשך 30 דקות. חזור על הפעולה 3 פעמים.
  4. העבר את העותקים המשוכפלים באמצעות לולאת תיל לרשת TEM מנחושת רשת (למשל, רשת מרובעת או חלת דבש 100+). אוויר לייבש את הרשתות במשך 2 שעות, ולאחר מכן לאחסן אותם בתיבת אחסון רשת עד מיקרוסקופיה.
    הערה: באופן כללי, ניתן לאחסן רשתות במשך חודשים בתנאי טמפרטורת חדר חשוכים ויבשים.
  5. השתמש במיקרוסקופ TEM כדי לצלם את העותקים המשוכפלים ולקבל מיקרוגרפים.
    1. לשם כך, הכנס רשת TEM עם עותק משוכפל והתחל את הדמיית ה- TEM בהתאם למדריכי ההפעלה של היצרן. עבודה ב 80 kV או 100 kV.
  6. בדוק את הדגימה ורכוש מיקרוגרפים בהגדלה נמוכה וגבוהה יותר עם מצלמה ב- TEM.
  7. לנתח את המיקרוגרפים של MVs. למדידות של קוטרי ה-MV, השתמשו בתוכנת Fiji/ImageJ16. קוטרם של MVs הוא פי 4/π מהמדידה במיקרוגרפים על פי Halett et al.17.

תוצאות

MVs בודדו מהמדיום המותנה של תאי T24 סרטניים לאחר צנטריפוגות דיפרנציאליות. בעקבות הפרוטוקול, שבר EV זוהה לראשונה לאחר צנטריפוגה ב-10,000 × גרם כאשר הוא נראה ככדור לבן (איור 2G).

לאחר מכן, כלי הרכב החשמליים עובדו על פי הפרוטוקול הנ"ל ונבחנו תחת TEM. הצללת Pt/C יצרה (איור 4L) העתקים גדולים יחסית שלעתים קרובות מתפרקים לרסיסים קטנים יותר במהלך שלב הניקוי. העתקים גדולים ושבריהם הקטנים יותר נקטפו ברשת ה-TEM והושוו תחת המיקרוסקופ. התוצאות לא הראו הבדלים באיכות המשטחים המשוכפלים ללא קשר לגודלם, ולכן ניתן להשתמש בכולם. בדיקות הגדלה נמוכה הראו אזורים של ההעתק עם i) משטח הומוגני (רקע), ii) פרופילים כדוריים קעורים וקמורים (שלפוחיות), ו-iii) אזורים של משטח פגום (ממצאים; איור 5א). ממצאים אופייניים נתפסו כקרעים, קפלים וצללים עמומים לא סדירים (כלומר, העתקים של מרבצי גבישי קרח על הדגימה). חשוב גם לציין שלא נצפו פסולת תאים או אברונים תאיים, מה שמאשר את טוהר הדגימה (איור 5B).

הבועיות המבודדות נאספו בדרך כלל באשכולות של שלושה או יותר או שהופצו בנפרד (איור 5B). הבועיות היו כדוריות, מה שמצביע על שימור טוב של מבנה האולטרה-מבנה במהלך בידוד, קיבוע והקפאה (איור 5C). "כדור שטוח" ובועיות מוארכות (איור 5C), שנראו מדי פעם, היו ככל הנראה תוצרי הכנה ולא נכללו במדידות הבאות של קוטר השלפוחית. קוטר הפרופילים הנראים לעין היה 238.5 ננומטר (±8.0 ננומטר, n = 190), אשר, בהתחשב בגורם התיקון שהוצע על ידי האלט ואחרים, מתאים לקוטר השלפוחית הממוצע של 304 ננומטר (±10 ננומטר; איור 5D). הגודל מתואם לטווח קוטר של MVs בין 100 ננומטר ל-1000 ננומטר ומוכיח את יעילות פרוטוקול הבידוד המשומש. התמונות של הבועיות יחד עם קביעת קוטר אישרו באופן חד משמעי כי כלי הרכב החשמליים בבידוד הועשרו ב- MVs.

ניתוח ההעתקים חשף את הארגון של פני P ו- E-face של הממברנות המגבילות MV. MVs נצפו כצורות עגולות קעורות וקמורות (איור 5C,E,F), המשקפות את מישור השבר. הצורות הקמורות מייצגות פרצופים E (כלומר, עלון אקסופלזמי שבור של הממברנות; איור 5E). הפנים האקסופלסמיות של כלי הרכב החשמליים היו בעלות מראה חלק ואחיד. הצורות הקעורות מתאימות לפנים P (איור 5F). בפרצופים של P, כמה חלקיקים תוך-ממברניים בולטים נראו בתוך ממברנות חלקות (איור 5C,F). משמעות הדבר היא כי MVs מבודדים מתאי T24 סרטניים המכילים רק כמות נמוכה של חלבוני ממברנה.

figure-results-2708
איור 1: הצגה סכמטית של קביעת הממברנה לאחר שבירת הקפאה. (A) מיקרו-ווסיקלים ניצנים מממברנת הפלזמה אל החלל החוץ-תאי. (B) Microvesicle מוגבל בעלון ממברנה P ו-E עד לפיצול הקפאה, אשר מפצל את העלונים וחושף את הנופים הפנימיים של עלונים, המכונים פרצופים שבורים. (C) לאחר הצללת Pt/C, ניתן להבחין בשני פרצופים שבורים: הפנים הפרוטופלסמיות (P-face) עם צורה קמורה הפונה לציטופלסמה (פרוטופלסמה) ופנים אקסופלסמיות (E-face) עם צורה קעורה הפונה לחלל החוץ-תאי. איור 1 נוצר באמצעות Biorender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-3613
איור 2: בידוד של כלי רכב חשמליים. (A) תאי T24 הגדלים באינקובטור CO2 נבדקים באמצעות (B) מיקרוסקופ אור כדי לאשר את הכדאיות והמפגש שלהם לפני בידוד MV. (C) מדיום תרביות התאים נאסף ו-(D) עובר צנטריפוגה רצופה ב-300 × גרם וב-2,000 × גרם (E) בכל פעם שהסופרנט נאסף. (ו,ז) לאחר הצנטריפוגה ב-10,000 × גרם, כתם לבן המציין כדור נראה ומסומן. ה-supernatant מוסר ו-(H) מקבע נוסף בזהירות לכדור מבלי לבצע בו שימוש חוזר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-4536
איור 3: הקפאת כלי רכב חשמליים. (A) מנשאי נחושת נקיים מיובשים באוויר עם בור מרכזי מסומנים (B) לפני העיבוד. מיקרו-וסיקלים עוברים שימוש חוזר בגליצרול כדי לקבל דגימה הומוגנית ו-(C) מתווספים לבור מרכזי של נשא קופר תחת סטריאומיקרוסקופ. (D) יש להוסיף נפח של הדגימה כך שהיא תיצור טיפה קמורה בבור המרכזי. (E) מיד לפני ההקפאה, ערבבו את הפריון מקוררLN 2 עם מוט מתכת כדי לנזול את הפריון. (F) להקפיא את הדגימה על ידי טבילתה בפראון, ולאחר מכן (G) להעביר אותה ל-LN2. (H) נשאים עם הדגימה הקפואה ניתנים לאיסוף לתוך קריוביאלים ומאוחסנים במיכל LN2 Dewar. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-5588
איור 4: הקפאה-שבירת יצירת העתק. בתוך תא היחידה (B) נמצא אקדח אלקטרונים פלטינה (Pt) ופחמן (C), סכין וטבלת הדגימות. (C) כדי להתחיל בשבירה, נשאים עם הדגימה מועברים לטבלת הדגימות, (D) יחידת ההקפאה-שבירת מקוררת, ונוצר ואקום. (ה) חתך נעשה על ידי תנועה ממונעת (ו) של הסכין, אך עדיף לבצע שבירת סכין באופן ידני. (ז) דגימה לפני חתך ו-(ח) לאחר השבירה. (I) מיד לאחר השבירה, ההעתק נעשה. (J) במהלך תהליך זה, Pt מוצלל על המדגם. הצללת פלטינה נראית כאור בהיר (ניצוצות) בחדר. (K) נשאים לדוגמה נאספים לתוך באר חרסינה מלאה במים. (L) העתק (חץ) צף בתמיסת הנתרן היפוכלוריט במהלך שלב הניקוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-6707
איור 5: מיקרוגרפים של אלקטרונים של MVs עם שברים בהקפאה ו-Pt/C. (A) סקירה כללית של גלולת EV המוקפאת ומוצללת (i) בהגדלה נמוכה יותר. המשטח ההומוגני הוא רקע (ii), אזורים בהירים הם קרעים בהעתקים (iii), אזורים כהים יותר הם קפלים של העתקים (כוכבית), וצללים עמומים לא סדירים נובעים מגבישי קרח (שתי כוכביות). (B) אשכול של כלי רכב חשמליים בעלי צורה עגולה עם משטחים קעורים וקמורים. (C) הגדלה גבוהה של כלי רכב חשמליים. בשברים קמורים, המציגים פני P של ממברנות EV, נראים חלקיקים תוך-ממברניים (חצים) וכתמים של משטח חלק (ראשי חץ). נמצאו שלפוחיות חוץ-תאיות עם צורות מוארכות (כוכב) וכדורים שטוחים (שני כוכבים). (D) הקוטר הממוצע של MVs אורותליאליים מבודדים הוא 304 ננומטר ± 10 ננומטר על פי מדידות הגודל כפי שהוצעו על ידי Hallett et al.17. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. (E,F) E-face ו-P-face של MVs. מקרא: חצים = חלקיקים תוך-ממברניים ב-P-face, חצים מוקפים = כיוון הצללת Pt/C. סרגלי קנה מידה: A = 10 מיקרומטר, B-F = 400 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Discussion

לאפיון של MVs, או לכל אוכלוסייה אחרת של כלי רכב חשמליים מבודדים, יש חשיבות עליונה מלכתחילה לפני שמתחילים בניתוחים במורד הזרם כמו מחקרי "אומיקה" או מחקרים פונקציונליים11,18. כאן, כלי רכב חשמליים מתאי T24 של סרטן שלפוחית השתן הפולשנית האנושית בודדו על ידי צנטריפוגה, ובעקבות הפרוטוקול שסופק לניתוח על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים של שברים קפואים, הראינו כי החלק המבודד הועשר ברכבי MVs11,13. הבידוד של MVs היה נטול פסולת תאים או אברונים, ואישר פרוטוקול בידוד וטיהור מוצלח.

השילוב של קיבוע כימי והקפאה, שהם שלבים קריטיים בפרוטוקול, שמר על הצורה הכדורית של כלי הרכבהחשמליים 12. עם זאת, יש צורך באמצעי זהירות בעת הערכת קוטר EV על ידי הקפאה-שבירת17. מכיוון שהשבר עובר דרך הדגימה באופן אקראי, ממברנות MV מפוצלות למישורים המשווניים והלא משווניים שלהן. כדי לספק שיטה קפדנית לניתוח התמונות של דגימות שבורות ומוצלות בהקפאה, האלט ואחרים הראו כי קוטר השלפוחית הממוצע הוא פי 4/π מהגודל האמיתי של קוטר השלפוחית בתמונה17. בהתחשב בכך, כלי רכב חשמליים מתאי T24 חושבו כבעלי קוטר של 304 ננומטר, מה שמתאים לטווח התפלגות הגודל התיאורטי של MV של 100-1000 ננומטר19.

שבירת הקפאה יכולה להשלים צביעה שלילית, טכניקת ה-TEM הנפוצה ביותר להמחשת כלי רכב חשמליים. על ידי צביעה שלילית, הדגימה בדרך כלל קבועה כימית, מיובשת ומחוברת לרשת TEM, ומנוגדת לתמיסת אורניל. ללא מדיה תומכת, כלי רכב חשמליים נוטים להתמוטט, מה שמעניק להם מראה בצורת. על ידי שבירת הקפאה, אנו מראים כי MVs הם כדורים, המשקפים את צורתם בחללים חוץ-תאיים ובנוזלי גוף12. בכך, התוצאות שלנו תואמות גם תצפיות של כלי רכב חשמליים בקטעים קריו-אולטרה-ת'ין20.

יתרון מכריע של טכניקת ההקפאה-שבר הוא כוחה לפתור את הארגון הפנימי של הממברנה המגבילה, המהווה גורם מפתח בהבנת האופן שבו כלי רכב חשמליים ממוקדים ומתקשרים עם ממברנות המקבלים. כאן ניתחנו את הממברנות של רכבי שטח, אך שבירת הקפאה עלולה לחשוף את ארגון הממברנות של כל אוכלוסייה אחרת של כלי רכב חשמליים. MVs נוצרים על ידי ניצני ממברנת פלזמה; לכן, חלבוני ממברנת פלזמה ואשכולות חלבונים צפויים להימצא בקרום MV. התוצאות שלנו תמכו בכך שה-MVs מתאי T24 הכילו חלקיקים תוך-ממברניים, והציגו חלבוני ממברנה אינטגרליים. בהתבסס על התפלגות החלקיקים בין פני ה-E לפנים ה-P, סביר לצפות שהחלקיקים שנצפו ב-MVs הם חלבוני טרנס-ממברנה אורופלקינס, שהם ספציפיים לתאי אורותל 21,24. החלקיקים שנצפו היו דלילים, וזה בהתאם למחקרים קודמים שדיווחו על ירידה באורופלקס במהלך קרצינוגנזה של אורותל 21,22,23. עם זאת, כדי לחקור עוד יותר את הרכב החלבון של ממברנות MV, מומלץ להשתמש בטכניקת ההקפאה-שברים של תיוג חיסוני (FRIL). FRIL הוא שדרוג של טכניקת ההקפאה-שבר המוצגת והוא מוקדש לחשיפת זהותם של חלבונים בהעתקים על ידי זיהוי נוגדנים24,25. לסיכום, טכניקת ההקפאה-שבר היא טכניקת מיקרוסקופיית אלקטרונים המתאימה לאפיון הממברנה המגבילה EV, כמו גם לצורה, לגודל ולטוהר של שברי EV המבודדים. הפרוטוקול המוצג יכול לשמש גם להערכת אוכלוסיות אחרות של כלי רכב חשמליים מבודדים; לפיכך, טכניקת ההקפאה-שבירת ההקפאה ראויה להיכלל בהנחיות האגודה הבינלאומית לשלפוחית חוץ-תאית למחקרים הבוחנים את הארגון של ממברנות מגבילות EV.

Disclosures

המחברים מצהירים על היעדר ניגודי עניינים.

Acknowledgements

מחקר זה מומן על ידי סוכנות המחקר הסלובנית (מימון ליבת המחקר לא). P3-0108 ופרויקט J7-2594) ותוכנית התשתית MRIC UL IP-0510. עבודה זו תורמת לרשת הבינלאומית של COST Action CA17116 לתרגום מחקר על נגזרות פרינטליות לגישות טיפוליות (SPRINT), הנתמכת על ידי COST (שיתוף פעולה אירופי במדע וטכנולוגיה). המחברים רוצים להודות ללינדה שטרוס, לסניה צ'בראג'ה, לנאדה פאבליקה דובאריץ' ולסבינה ז'לזניק על העזרה הטכנית בגיבוש התאים ובהכנת הדגימות ולמארקו ווגריניץ', אוטה שירקה רוש ונייץ' דאבק על העזרה הטכנית בהכנת הסרטון.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
A-DMEMThermoFisher Scientific, USA12491015
Balzers freeze-fracture deviceBalzers AG, LiechtensteinBalzers BAF 200
CentrifugeEppendorf, Germanymodel 5810R
CO2 incubator HeraCell Heraues, Germany
Copper carriersBalzersBB 113 142-2100+ mesh
Copper gridsSPI, United States2010C
Culture flask T75TPP, Switzerlandgrowing surface 75 cm2
F12 (HAM)Sigma-Aldrich, Germany21765029
FBSGibco, Life Technologies, USA10500064
Glazed Porcelain Plate 6 WellFischer Sientific, United States50-949-072
GlycerolKemika, Croatia711901final concentration 30 % (v/v)
Glutaradehyde Serva, Germany23114.01final concentration 2.5 % (v/v)
GlutaMAXGibco, Life Technologies35050-079final concentration 4 mM
PenicillinGibco, Life Technologies15140163final concentration 100 U/ml
Phase-contast inverted microscopeNikon, Japanmodel Eclipse
RotorEppendorf, GermanyA 4-44
Rotor Eppendorf, GermanyF-34-6-38
Serological pipettsTPP, Switzerland50mL volume
Sodium hypochloride solution in waterCarlo Erba, Italy481181
StereomicroscopeLeica, Germany
StreptomycinGibco, Life Technologies35050038final concentration 100 mg/mL
Transmission electron microscopePhilips, The Netherlandsmodel CM100working at 80 kV
TweezersSPI, United States

References

  1. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  2. Willms, E., Cabanas, C., Mager, I., Wood, M. J. A., Vader, P. Extracellular vesicle heterogeneity: Subpopulations, isolation techniques, and diverse functions in cancer progression. Frontiers in Immunology. 9, 738 (2018).
  3. van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, 213-228 (2018).
  4. Cocucci, E., Racchetti, G., Meldolesi, J. Shedding microvesicles: Artefacts no more. Trends in Cell Biology. 19 (2), 43-51 (2009).
  5. Urabe, F., et al. Extracellular vesicles as biomarkers and therapeutic targets for cancer. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 318 (1), 29-39 (2020).
  6. Tricarico, C., Clancy, J., D'Souza-Schorey, C. Biology and biogenesis of shed microvesicles. Small GTPases. 8 (4), 220-232 (2017).
  7. Georgantzoglou, N., Pergaris, A., Masaoutis, C., Theocharis, S. Extracellular vesicles as biomarkers carriers in bladder cancer: Diagnosis, surveillance, and treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2744 (2021).
  8. Słomka, A., Urban, S. K., Lukacs-Kornek, V., Żekanowska, E., Kornek, M. Large extracellular vesicles: Have we found the holy grail of inflammation. Frontiers in Immunology. 9, 2723 (2018).
  9. Han, L., Lam, E. W. F., Sun, Y. Extracellular vesicles in the tumor microenvironment: Old stories, but new tales. Molecular Cancer. 18 (1), 59 (2019).
  10. Muralidharan-Chari, V., Clancy, J. W., Sedgwick, A., D'Souza-Schorey, C. Microvesicles: Mediators of extracellular communication during cancer progression. Journal of Cell Science. 123, 1603-1611 (2010).
  11. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).
  12. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , (2006).
  13. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  14. Severs, N. J. Freeze-fracture electron microscopy. Nature Protocols. 2 (3), 547-576 (2007).
  15. Severs, N. J., Robenek, H. Freeze-fracture cytochemistry in cell biology. Methods in Cell Biology. 88, 181-186 (2008).
  16. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
  17. Hallett, F. R., Nickel, B., Samuels, C., Krygsman, P. H. Determination of vesicle size distributions by freeze-fracture electron microscopy. Journal of Electron Microscopy Technique. 17 (4), 459-466 (1991).
  18. Nigro, A., et al. Selective loss of microvesicles is a major issue of the differential centrifugation isolation protocols. Scientific Reports. 11, 3589 (2021).
  19. Szatanek, R., et al. The methods of choice for extracellular vesicles (EVs) characterization. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1153 (2017).
  20. Iliev, D., et al. Stimulation of exosome release by extracellular DNA is conserved across multiple cell types. The FEBS Journal. 285 (16), 3114-3133 (2018).
  21. Zupančič, D., Zakrajšek, M., Zhou, G., Romih, R. Expression and localization of four uroplakins in urothelial preneoplastic lesions. Histochemistry and Cell Biology. 136 (4), 491-500 (2011).
  22. Wu, X. R., Manabe, M., Yu, J., Sun, T. T. Large scale purification and immunolocalization of bovine uroplakins I, II, and III. Molecular markers of urothelial differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 265 (31), 19170-19179 (1990).
  23. Kreft, M. E., Hudoklin, S., Jezernik, K., Romih, R. Formation and maintenance of blood-urine barrier in urothelium. Protoplasma. 246 (1-4), 3-14 (2010).
  24. Kreft, M. E., Robenek, H. Freeze-fracture replica immunolabelling reveals urothelial plaques in cultured urothelial cells. PLoS One. 7 (6), 38509 (2012).
  25. Robenek, H., et al. Topography of lipid droplet-associated proteins: Insights from freeze-fracture replica immunogold labeling. Journal of Lipids. 2011, 409371 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

187

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved