Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie zur extrazellulären Vesikelanalyse

Zusammenfassung

Wir stellen ein Protokoll zur Isolierung und Gefrierfraktur von extrazellulären Vesikeln (EVs) vor, die aus krebsartigen Urothelzellen stammen. Die Gefrierbruchtechnik enthüllte den Durchmesser und die Form der EVs und - als einzigartiges Merkmal - die innere Organisation der EV-Membranen. Diese sind von immenser Bedeutung, um zu verstehen, wie Elektrofahrzeuge mit den Empfängermembranen interagieren.

Zusammenfassung

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind membranbegrenzte Strukturen, die von den Zellen in den extrazellulären Raum freigesetzt werden und an der interzellulären Kommunikation beteiligt sind. EVs bestehen aus drei Populationen von Vesikeln, nämlich Mikrovesikeln (MVs), Exosomen und apoptotischen Körpern. Die begrenzende Membran von EVs ist entscheidend an den Interaktionen mit den Empfängerzellen beteiligt, was zur Übertragung von biologisch aktiven Molekülen auf die Empfängerzellen führen und folglich deren Verhalten beeinflussen könnte. Die Gefrier-Bruch-Elektronenmikroskopie-Technik wird verwendet, um die innere Organisation biologischer Membranen zu untersuchen. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die MV-Isolierung aus kultivierten Krebs-Urothelzellen und die Gefrierfraktur von MVs in den Schritten des schnellen Einfrierens, Frakturierens, Herstellens und Reinigens der Repliken und deren Analyse mit Transmissionselektronenmikroskopie. Die Ergebnisse zeigen, dass das Protokoll zur Isolierung eine homogene Population von EVs ergibt, die der Form und Größe von MVs entsprechen. Intramembranpartikel befinden sich hauptsächlich in der protoplasmatischen Fläche der begrenzenden Membran. Daher ist die Gefrierfraktur die Technik der Wahl, um den Durchmesser, die Form und die Verteilung der Membranproteine der MVs zu charakterisieren. Das vorgestellte Protokoll gilt für andere Populationen von Elektrofahrzeugen.

Einleitung

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind membranbegrenzte Vesikel, die von Zellen in den extrazellulären Raum freigesetzt werden. Die drei Hauptpopulationen von EVs sind Exosomen, Mikrovesikel (MVs) und apoptotische Körper, die sich in ihrem Ursprung, ihrer Größe und ihrer molekularen Zusammensetzung unterscheiden ^1,2,3. Die Zusammensetzung der EVs spiegelt das molekulare Profil der Spenderzelle und ihren physiologischen Status (d. h. gesund oder krank) ^wider4,5. Dies gibt EVs ein immenses Potenzial in der Diagnose, Prognose und Therapie menschlicher Krankheiten, und sie haben vielversprechende medizinische Anwendungen für den Einsatz in der personalisierten Medizin ^6,7,8.

EVs sind Mediatoren der interzellulären Kommunikation. Sie enthalten biologisch aktive Proteine, Lipide und RNAs, die in biologische Prozesse in der Empfängerzelle eingreifen und ihr Verhalten verändern^{können 9,10}. Die Zusammensetzung der EV-begrenzenden Membran ist jedoch entscheidend für die Interaktion mit der Empfängerzellmembran.

Die Quellen von Elektrofahrzeugen sind Körperflüssigkeiten und konditionierte Kulturmedien. Um eine EV-Population zu isolieren, muss eine geeignete Isolationstechnik verwendet werden. Zum Beispiel ergibt die Zentrifugation bei 10.000 × g einen in MVs angereicherten Bruchteil, während Zentrifugalkräfte von ≥100.000 × g einen in Exosomen^11,12 angereicherten Bruchteil ergeben. Der isolierte Anteil von Elektrofahrzeugen muss in Bezug auf Reinheit, Größe und Form validiert werden. Zu diesem Zweck empfahl die International Society for Extracellular Vesicles²⁰¹⁸ drei Klassen hochauflösender bildgebender Verfahren: Elektronenmikroskopie, Rasterkraftmikroskopie und lichtmikroskopische hochauflösende Mikroskopie 13. Keine dieser Techniken kann Informationen über das Innere der EV-Membran liefern.

Die Gefrierbruchelektronenmikroskopie ist eine Technik, bei der gefrorene Proben gebrochen werden, um ihre inneren Strukturen aufzudecken, insbesondere einen Blick auf das Innere der Membran zu werfen. Die Schritte der Probenvorbereitung sind (1) schnelles Einfrieren, (2) Frakturieren, (3) Herstellung der Replik und (4) Reinigen der Replik¹⁴. In Schritt 1 wird die Probe (optional) chemisch fixiert, mit Glycerin kryogeschützt und in flüssigem Freon eingefroren. In Schritt 2 wird die gefrorene Probe in einer Gefrierbrucheinheit gebrochen, die das Innere der Membrandoppelschicht freilegt. In Schritt 3 werden die freiliegenden gebrochenen Flächen mit Platin (Pt) und Kohlenstoff (C) beschattet, um Repliken herzustellen. In Schritt 4 wird das organische Material entfernt. Der Nachbau wird im Transmissionselektronenmikroskop (TEM) analysiert. Für eine genaue Interpretation der Mikroaufnahmen muss man die Richtlinien für ihre richtige Orientierung befolgen^14,15. Kurz gesagt, die Richtung der Schatten in der Mikroaufnahme ist eine Referenz, um die Mikroaufnahme zu orientieren (d.h. die Richtung der Pt-Schattierung zu bestimmen) und folglich konvexe und konkave Formen zu bestimmen (Abbildung 1). Zwei Innenansichten, die als gebrochene Flächen der Membrandoppelschicht bezeichnet werden, können als Ergebnis der Spaltung der Membran durch Gefrierbruch gesehen werden: die protoplasmatische Fläche (P-Fläche) und die exoplasmatische Fläche (E-Fläche). Die P-Fläche stellt das Membranblättchen neben dem Zellprotoplasma dar, während die E-Fläche das Membranblättchen neben dem extrazellulären Raum darstellt. Integrale Membranproteine und ihre Assoziationen werden als hervorstehende Intramembranpartikel^{gesehen 14,15}.

Hier besteht das Ziel darin, die Gefrierbruchtechnik anzuwenden, um MVs in Bezug auf Größe, Form und die Struktur ihrer begrenzenden Membran zu charakterisieren. Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung und Gefrierfrakturierung von MVs vor, die aus humanen invasiven Blasenkrebs-Urothelzellen stammen.

Protokoll

1. Kultivierung von Krebs-Urothelzellen und Isolierung von EVs

HINWEIS: Ein Protokoll zur Gewinnung von EVs aus einer humanen invasiven Blasenkrebs-Urothelzelllinie (T24) wird vorgestellt. Die Kultivierungsbedingungen müssen jedoch optimiert werden, um andere Zelltypen zu verwenden.

1. Platte T24-Zellen mit einer Dichte von 3 × 10⁴ Zellen/cm 2 in drei Kolben (Wachstumsfläche von 75 cm 2) und beginnen mit der Kultivierung der Zellen in einem CO 2 Inkubator für 3 Tage bei 37 °C und einem CO ² -% (Abbildung 2A).
   1. Verwenden Sie ein Kulturmedium für T24-Zellen in einer 1:1 (v/v) Mischung aus A-DMEM und F12, ergänzt mit 5% fetalem Rinderserum (FBS), 4 mM Glutamax, 100 mg/ml Streptomycin und 100 U/ml Penicillin.
      HINWEIS: Die folgende Isolierung ergibt Elektrofahrzeuge, die mit MVs angereichert sind. Bevor Sie mit der Isolierung beginnen, untersuchen Sie die Zellen mit einem Lichtmikroskop, um die Lebensfähigkeit und den Zusammenfluss zu bestätigen (Abbildung 2B). Beginnen Sie mit dem Sammeln der EVs aus den konditionierten Kulturmedien, wenn die T24-Zellen zu 70% zusammenfließen.
2. Das Kulturmedium wird mit MVs mit einer Pipette aus Kolben (T75) in konischen Zentrifugenröhrchen gesammelt (Abbildung 2C). Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei 4 °C (Abbildung 2D).
3. Sammeln Sie den Überstand vorsichtig in einem neuen Zentrifugenröhrchen mit der Pipette (Abbildung 2E).
4. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 2.000 × g für 20 min bei 4 °C.
5. Sammeln Sie den Überstand vorsichtig mit der Pipette in ein neues Zentrifugenröhrchen.
6. Zentrifuge bei 10.000 × g für 40 min bei 4 °C. Achten Sie auf das Vorhandensein eines weißlichen Pellets am Boden der Röhre.
   HINWEIS: Wechseln Sie bei Bedarf den Zentrifugenrotor, um die erforderliche g-Kraft zu erreichen. Das EV-Pellet ist als weißes Pellet am Boden des Zentrifugenrohrs zu sehen (Abbildung 2F); Markieren Sie seine Position, um zu vermeiden, dass das Pellet während des Pipettierens verloren geht (Abbildung 2G).
7. Verwerfen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette. Fügen Sie dem Pellet 1,5 ml PBS hinzu und resuspendieren Sie das Pellet, das MVs enthält. Setzen Sie die Suspension in ein neues Zentrifugenröhrchen.
8. Zentrifugieren Sie bei 10.000 × g für 40 min bei 4 °C und achten Sie auf das Vorhandensein eines weißen Pellets am Boden des Röhrchens.
   HINWEIS: Das EV-Pellet ist als weißer Fleck am Boden des Zentrifugenröhrchens zu sehen; Markieren Sie seine Position, um zu vermeiden, dass das Pellet während des Pipettierens verloren geht.
9. Verwerfen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette. Fügen Sie vorsichtig das fixierende, 2,5% ige Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer (pH 7,2) hinzu. 20 Minuten bei 4 °C einwirken lassen (Abbildung 2H).
   ACHTUNG: Glutaraldehyd und Natriumcacodylat sind giftig. Arbeiten Sie in einer Dunstabzugshaube, tragen Sie Schutzhandschuhe und werfen Sie sie entsprechend ab.
10. Entfernen Sie das Fixiermittel vorsichtig mit einer Pipette. Waschpuffer (0,1 M Natriumcacodylatpuffer) in das Pellet geben. 10 min bei 4 °C einwirken lassen, ohne das Pellet wieder auszusetzen.

2. Einfrieren von Elektrofahrzeugen

HINWEIS: Vor dem Einfrieren die Proben zuerst mit Glycerin kryoschützen.

1. 0,1 M Natriumcacodylatpuffer vorbereiten. Entfernen Sie den Waschpuffer und fügen Sie 50 μL 30% Glycerin in 0,1 M Cacodylatpuffer hinzu. Suspendieren Sie die EVs vorsichtig, um die Lösung homogen zu machen. 30 min bei 4 °C inkubieren.
2. Reinigen Sie die Kupferträger mit einer zentralen Grube im Ultraschallbad mit Chloroform für 5 min (Abbildung 3A). Trocknen Sie sie an der Luft und markieren Sie sie mit Farben, wenn Sie mehrere Proben verwenden (Abbildung 3B). Bewahren Sie die Träger bis zum Gebrauch an einem trockenen, sauberen Ort auf (z. B. auf Linsenpapier in einer Petrischale). Berühren Sie die Träger nicht mit bloßen Händen.
   1. Bereiten Sie Pipetten, Lösungen, Filterpapier, Pinzetten, ein Stereomikroskop, einen Dewar-Kolben mit Freon und flüssigem Stickstoff (LN₂), einen Metallstab und Kryoviten vor. Kühlen Sie es mit LN₂ ab.
      ACHTUNG: Tragen Sie Schutzausrüstung und arbeiten Sie entsprechend beim Umgang mit LN₂ und gekühltem Freon.
3. Setzen Sie die Elektrofahrzeuge vor dem Einfrieren erneut aus. Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen.
   HINWEIS: Führen Sie die Schritte 2.4-2.7 schnell aus.
4. Arbeiten unter einem Stereomikroskop (Abbildung 3C). Übertragen Sie 1,5-1,7 μl der Probe in die zentrale Grube des Kupferträgers, um einen konvexen Abfall zu erzeugen, der höher als die Kupferträgerkante reicht, ohne die Probe über die Kante zu verschütten (Abbildung 3D). Verwenden Sie im Falle eines Überlaufens Filterpapier, um den äußeren Ring des Trägers zu trocknen.
5. Erstarrtes Freon mit einem Metallstab mischen, um es wieder zu verflüssigen (Abbildung 3E).
6. Greifen Sie den äußeren Ring des Kupferträgers mit einer Pinzette und tauchen Sie ihn in abgekühltes Freon mit einem sanften Schütteln der Pinzette für 8 s (Abbildung 3F). Nach 8 s schnell den Träger in einen anderen Dewar-Kolben umfüllen, der mit LN₂ gefüllt ist.
7. Fahren Sie sofort mit dem Brechen oder Lagern der Proben in LN₂ fort. Im letzteren Fall markieren Sie ein Kryo und kühlen Sie die Fläschchen- und Pinzettenspitzen ab, indem Sie sie in LN₂ eintauchen (Abbildung 3G). Sammeln Sie unter LN 2 gefrorene Kupferträger in die Durchstechflasche, schließen Sie sie und lagern Sie sie im LN_2-Behälter (Abbildung 3H), bis sie eingefroren sind.

3. Fracturing von EVs und Herstellung der Repliken

HINWEIS: Bereiten Sie die Freeze-Fracturing-Einheit gemäß der Bedienungsanleitung des Herstellers vor. (Abbildung 4A). Reinigen Sie die Kammer der Einheit. Positionieren Sie Platin- (Pt/C) und Carbon-Pistolen (C) in Winkeln von 45° bzw. 90° (Abbildung 4B).

1. Starten Sie das Vakuumsystem der Einheit. Wenn ein Druck von 6,6 × 10−² Pa (5 × 10−4 Torr) erreicht ist, kühlen Sie die Gerätekammer auf ⁻ 150 °C ab.
2. Die Kupferträger mit gefrorenen Proben werden mit einer trockenen Pinzette in eine gefrierbrechende Einheit überführt (Abbildung 4C). Verwenden Sie Kryotransfer oder arbeiten Sie schnell, um das Auftauen der Probe und die Ablagerung der Eiskristalle zu vermeiden. Befestigen Sie die Träger auf dem Probentisch.
3. Warten Sie, bis das Vakuum wieder 6,6 × 10−2 Pa (5 × 10−⁴ Torr) erreicht, und stellen Sie dann die Messertemperatur auf ⁻100 °C ein (Abbildung 4D).
4. Warten Sie, bis das Vakuum 1,0 × 10−3 Pa (8 ^× 10⁻⁶ Torr) erreicht.
5. Beobachten Sie die Probe mit einem Fernglas und nähern Sie sich vorsichtig dem Messer (Abbildung 4E).
6. Beginnen Sie mit dem Schneiden der Probe, indem Sie die motorisierte Bewegung des Messers (Abbildung 4F) und des Schnitts einschalten, bis die Oberfläche der Probe glatt ist (Abbildung 4G).
7. Schalten Sie beim Fracturing die motorisierte Bewegung des Messers aus und fahren Sie mit der langsamen manuellen Steuerung des Messers fort, wodurch die Probe gebrochen wird (Abbildung 4H). Um die zerbrochene Oberfläche vor der Bildung von Eiskristallen und Ablagerungen bis zur Beschattung zu schützen, bewegen Sie das Messer über die gebrochene Probe.
8. Fahren Sie mit der Pt-Abschattung bei 45° fort (Abbildung 4I, J).
   1. Bereiten Sie eine Stoppuhr vor und/oder schalten Sie den Quarzkristallmonitor an der Gefrierbrucheinheit ein, der die Überwachung der Dicke des Pt auf der Probe ermöglicht. Die empfohlene Dicke der Pt-Schicht, gemessen auf dem Quarzkristallmonitor, beträgt 2,5 nm, was 4 s Abschattung bei gegebener hoher Spannung und hohem Strom entspricht (d. h. die Geschwindigkeit der Pt-Abschattung beträgt 0,63 nm/s).
   2. Bevor Sie mit der Beschattung beginnen, bewegen Sie das Messer von der Probe weg. Wenden Sie eine hohe Spannung auf die Pt/C-Pistole (1.600 V) an und erhöhen Sie den Strom auf 60 mA. Funken von Pt sollten erscheinen und beginnen, die Probe zu überschatten. Starten Sie an dieser Stelle den 4 s Countdown und/oder beobachten und lokalisieren Sie die Position von Pt auf dem Quarzkristallmonitor.
      HINWEIS: Die empfohlene Dicke der C-Schicht beträgt 2,5 nm, was 10 s Abschattung bei gegebener hoher Spannung und Strömung entspricht.
   3. Schalten Sie den Strom und die hohe Spannung aus, wenn die gewünschte Dicke von Pt erreicht ist.
9. Fahren Sie mit der C-Abschattung bei 90° fort (d. h. die Geschwindigkeit der C-Abschattung beträgt 0,25 nm/s).
   1. Wenden Sie eine hohe Spannung auf die C-Pistole (1.900 V) an, erhöhen Sie den Strom auf 90 mA, und Funken von C sollten erscheinen und beginnen, die Probe zu beschatten; Starten Sie in diesem Moment den 10 S Countdown. Schalten Sie den Strom und die hohe Spannung aus, wenn die gewünschte Dicke von C erreicht ist.

4. Reinigen der Replikate und Replikatanalyse

1. Verwenden Sie die Kupferträger aus dem Probentisch und übertragen Sie sie mit einer Pinzette in destilliertes Wasser bei Raumtemperatur in einer Porzellanplatte mit 12 Vertiefungen (Abbildung 4K). Die Repliken schwimmen auf der Wasseroberfläche, während die Träger sinken (Abbildung 4L).
2. Übertragen Sie die Repliken mit einer Drahtschleife aus destilliertem Wasser in einen Brunnen mit Natriumhypochlorit. Abdecken und über Nacht bei Raumtemperatur in einem Abzug stehen lassen.
   ACHTUNG: Natriumhypochlorit ist giftig. Arbeiten Sie in einer Dunstabzugshaube, tragen Sie Schutzhandschuhe und werfen Sie sie entsprechend ab.
3. Übertragen Sie die Repliken auf ddH₂O und waschen Sie sie für 30 min. Wiederholen Sie dies 3 Mal.
4. Übertragen Sie die Repliken mit einer Drahtschlaufe auf ein Kupfer-TEM-Gitter (z. B. quadratisches oder wabenförmiges 100+ Mesh). Trocknen Sie die Gitter 2 h an der Luft und lagern Sie sie dann bis zur Mikroskopie in einer Gitteraufbewahrungsbox.
   HINWEIS: Im Allgemeinen können Gitter monatelang unter dunklen, trockenen Raumtemperaturbedingungen gelagert werden.
5. Verwenden Sie ein TEM-Mikroskop, um die Repliken abzubilden und Mikroaufnahmen zu erhalten.
   1. Setzen Sie dazu ein TEM-Raster mit einem Nachbau ein und starten Sie die TEM-Bildgebung gemäß den Bedienungsanleitungen des Herstellers. Arbeiten bei 80 kV oder 100 kV.
6. Untersuchen Sie die Probe und erfassen Sie Mikroaufnahmen bei immer niedrigeren Vergrößerungen mit einer Kamera auf TEM.
7. Analysieren Sie die Mikroaufnahmen der MVs. Für Messungen der MV-Durchmesser verwenden Sie die Fiji/ImageJ-Software¹⁶. Der Durchmesser von MVs beträgt das 4/π-fache der Messung auf den Mikroaufnahmen nach Hallett et ^al.17.

Ergebnisse

MVs wurden nach differentiellen Zentrifugationen aus dem konditionierten Medium der Krebsurothel-T24-Zellen isoliert. Nach dem Protokoll wurde die EV-Fraktion erstmals nach der Zentrifugation bei 10.000 × g nachgewiesen, wenn sie als weißes Pellet gesehen wurde (Abbildung 2G).

Als nächstes wurden die EVs nach dem obigen Protokoll verarbeitet und unter TEM untersucht. Pt/C-Shadowing erzeugte (Abbildung 4L) relativ große Repliken, die während des Reinigungsschritts häufig in kleinere Fragmente zerfielen. Große Repliken und ihre kleineren Fragmente wurden auf dem TEM-Gitter aufgenommen und unter dem Mikroskop verglichen. Die Ergebnisse zeigten keine Unterschiede in der Qualität der Replikatoberflächen, unabhängig von ihrer Größe, und sie können daher alle verwendet werden. Untersuchungen mit geringer Vergrößerung zeigten Regionen der Replik mit i) einer homogenen Oberfläche (Hintergrund), ii) konkaven und konvexen sphärischen Profilen (Vesikel) und iii) Regionen beschädigter Oberfläche (Artefakte; Abbildung 5A). Typische Artefakte wurden als Brüche, Falten und unregelmäßige dunklere Schatten angesehen (dh Nachbildungen von Eiskristallablagerungen auf dem Exemplar). Es ist auch wichtig zu beachten, dass keine Zelltrümmer oder Zellorganellen gesehen wurden, was die Reinheit der Probe bestätigt (Abbildung 5B).

Die isolierten Vesikel wurden üblicherweise entweder in Dreier- oder Mehrergruppen gesammelt oder einzeln verteilt (Abbildung 5B). Die Vesikel waren kugelförmig, was auf eine gute Erhaltung der Ultrastruktur während der Isolierung, Fixierung und des Einfrierens hinweist (Abbildung 5C). "Flachkugelförmige" und längliche Vesikel (Abbildung 5C), die gelegentlich gesehen wurden, waren vermutlich Artefakte der Vorbereitung und wurden bei den nachfolgenden Messungen des Vesikeldurchmessers nicht berücksichtigt. Der Durchmesser der sichtbaren Profile betrug 238,5 nm (±8,0 nm, n = ¹⁹⁰), was unter Berücksichtigung des von Hallett et al.17 vorgeschlagenen Korrekturfaktors dem mittleren Vesikeldurchmesser von 304 nm (±10 nm; Abbildung 5D). Die Größe korreliert mit einem Durchmesserbereich von MVs zwischen 100 nm und 1000 nm und belegt die Wirksamkeit des verwendeten Isolationsprotokolls. Die Bilder der Vesikel zusammen mit der Durchmesserbestimmung bestätigten eindeutig, dass die EVs im Isolat mit MVs angereichert waren.

Die Analyse der Repliken ergab die Organisation von P-Face und E-Face der MV-Grenzmembranen. MVs wurden als konkave und konvexe runde Formen beobachtet (Abbildung 5C, E, F), die die Bruchebene widerspiegeln. Die konvexen Formen stellen E-Flächen dar (d. h. gebrochenes exoplasmatisches Blatt der Membranen; Abbildung 5E). Die exoplasmatischen Gesichter der EVs hatten ein glattes, einheitliches Aussehen. Die konkaven Formen entsprechen P-Flächen (Abbildung 5F). In den P-Flächen wurden einige hervorstehende Intramembranpartikel innerhalb glatter Membranen gesehen (Abbildung 5C,F). Dies bedeutet, dass MVs, die aus Krebs-Urothel-T24-Zellen isoliert wurden, nur eine geringe Menge an Membranproteinen enthalten.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Membranbestimmung nach dem Gefrierbrechen . (A) Mikrovesikel knospen von der Plasmamembran in den extrazellulären Raum. (B) Mikrovesikel wird mit P- und E-Membran-Blättchen bis zur Gefrierfraktionierung begrenzt, wodurch die Blättchen gespalten werden und die Innenansichten von Blättchen, die als gebrochene Flächen bezeichnet werden, freigelegt werden. (C) Nach der Pt/C-Beschattung sind zwei gebrochene Flächen erkennbar: die protoplasmatische Fläche (P-Fläche) mit einer konvexen Form, die dem Zytoplasma zugewandt ist (Protoplasma) und eine exoplasmatische Fläche (E-Fläche) mit einer konkaven Form, die dem extrazellulären Raum zugewandt ist. Abbildung 1 wurde mit Biorender.com erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Isolierung von EVs. (A) T24-Zellen, die in einem CO 2-Inkubator gezüchtet wurden, werden mit (B) einem Lichtmikroskop untersucht, um ihre Lebensfähigkeit und ihren Zusammenfluss vor der MV-Isolierung zu bestätigen. (C) Das Zellkulturmedium wird gesammelt und (D) bei jeder Sammlung des Überstands bei 300 × g und bei 2.000 × g (E) nacheinander zentrifugiert. (F,G) Nach der Zentrifugation bei 10.000 × g ist ein weißer Fleck, der auf ein Pellet hinweist, sichtbar und markiert. Der Überstand wird entfernt und (H) Fixiermittel wird vorsichtig in das Pellet gegeben, ohne es wieder zu suspendieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Einfrieren von Elektrofahrzeugen. (A) Luftgetrocknete, saubere Kupferträger mit einer zentralen Grube werden vor der Verarbeitung (B) markiert. Mikrovesikel werden in Glycerin resuspendiert, um eine homogene Probe zu erhalten, und (C) zu einer zentralen Grube eines Küferträgers unter einem Stereomikroskop gegeben. (D) Man muß ein Volumen der Probe hinzufügen, so daß es in der zentralen Grube einen konvexen Tropfen bildet. (E) Unmittelbar vor dem Einfrieren LN_2-gekühltes Freon mit einem Metallstab mischen, um das Freon zu verflüssigen. (F) Die Probe wird eingefroren, indem sie in Freon eingetaucht wird, und dann (G) in LN₂ übertragen. (H) Träger mit der gefrorenen Probe können in Kryovials gesammelt und in einem LN₂ Dewar-Behälter gelagert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Gefrierfrakturieren und Erstellen einer Replik . (A) Gefrier-Fracturing-Einheit. In der Einheitskammer (B) befindet sich eine Platin- (Pt) und Kohlenstoff- (C) Elektronenkanone, ein Messer und der Probentisch. (C) Um mit dem Frakturieren zu beginnen, werden die Träger mit der Probe auf den Probentisch übertragen, (D) die Gefrierfrakturierungseinheit wird gekühlt und ein Vakuum hergestellt. (E) Das Schneiden erfolgt durch motorisierte (F) Bewegung des Messers, aber das Brechen erfolgt vorzugsweise manuell. (G) Probe vor dem Schneiden und (H) nach dem Frakturieren. (I) Unmittelbar nach dem Brechen wird die Replik hergestellt. (J) Während dieses Vorgangs wird Pt auf der Probe schattiert. Platinschattierung wird als helles Licht (Funken) in der Kammer gesehen. (K) Die Probenträger werden in einem mit Wasser gefüllten Porzellanbrunnen gesammelt. (L) Nachbildung (Pfeil), die während des Reinigungsschritts in der Natriumhypochloritlösung schwimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Elektronenmikroskopische Aufnahmen von gefriergebrochenen und Pt/C-beschatteten MVs. (A) Eine Übersicht über das gefriergebrochene und schattierte EV-Pellet (i) bei geringerer Vergrößerung. Die homogene Oberfläche ist Hintergrund (ii), helle Bereiche sind Brüche in den Repliken (iii), dunklere Bereiche sind Falten von Repliken (Sternchen) und unregelmäßige dunklere Schatten sind auf Eiskristalle zurückzuführen (zwei Sternchen). (B) Cluster von runden EVs mit konkaven und konvexen Oberflächen. (C) Hohe Vergrößerung von Elektrofahrzeugen. In konvexen Brüchen, die P-Fläche der EV-Membranen aufweisen, sind Intramembranpartikel (Pfeile) und Flecken einer glatten Oberfläche (Pfeilspitzen) zu sehen. Extrazelluläre Vesikel mit länglichen (Stern) und flachen Kugelformen (zwei Sterne) werden gefunden. (D) Der mittlere Durchmesser isolierter urothelialer MVs beträgt 304 nm ± 10 nm gemäß den von Hallett et ^al.17 vorgeschlagenen Größenmessungen. Die Daten werden als Mittelwert ± REM dargestellt. (E,F) E-Fläche und P-Fläche von MVs. Legende: Pfeile = Intramembranpartikel in P-Fläche, eingekreiste Pfeile = die Richtung der Pt/C-Abschattung. Skalenbalken: A = 10 μm, B-F = 400 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Diskussion

Die Charakterisierung von MVs oder einer anderen Population isolierter EVs ist von größter Bedeutung, bevor nachgelagerte Analysen wie "Omics" -Studien oder Funktionsstudien^{beginnen 11,18}. Hierin wurden EVs aus humanen invasiven Blasenkrebs-Urothel-T24-Zellen durch Zentrifugation isoliert, und gemäß dem bereitgestellten Protokoll für die Analyse durch Gefrierbruchelektronenmikroskopie zeigten wir, dass die isolierte Fraktion in MVs^11,13 angereichert war. Das Isolat von MVs war frei von Zelltrümmern oder Organellen, was ein erfolgreiches Isolations- und Reinigungsprotokoll bestätigt.

Die Kombination aus chemischer Fixierung und Einfrieren, die kritische Schritte des Protokolls sind, behielt die kugelförmige Form der EVs¹² bei. Bei der Beurteilung des EV-Durchmessers durch Gefrierbruch¹⁷ sind jedoch Vorsichtsmaßnahmen erforderlich. Da die Fraktur die Probe zufällig durchläuft, werden MV-Membranen in ihre äquatoriale und nicht-äquatoriale Ebene aufgeteilt. Um eine rigorose Methode zur Analyse der Bilder von gefriergebrochenen und beschatteten Proben bereitzustellen, zeigten Hallett et al., dass der mittlere Vesikeldurchmesser das 4/π-fache der tatsächlichen Größe des vesikulären Durchmessers auf dem Bild¹⁷ beträgt. Unter Berücksichtigung dessen wurden EVs aus T24-Zellen mit einem Durchmesser von 304 nm berechnet, was in den theoretischen Größenverteilungsbereich des MV von 100-1000 nm¹⁹ passt.

Freeze-Fracturing kann die negative Färbung ergänzen, die am häufigsten verwendete TEM-Technik zur Visualisierung von Elektrofahrzeugen. Durch negative Färbung wird die Probe üblicherweise chemisch fixiert, getrocknet und an ein TEM-Gitter gebunden und mit Uranyllösung kontrastiert. Ohne unterstützende Medien neigen Elektrofahrzeuge dazu, zusammenzubrechen, was ihnen ein becherförmiges Aussehen verleiht. Durch Gefrierbruch zeigen wir, dass MVs Kugeln sind, die ihre Form in extrazellulären Räumen und Körperflüssigkeiten^{widerspiegeln 12}. Damit stimmen unsere Ergebnisse auch mit Beobachtungen von EVs in kryoultradünnen Abschnitten^{überein 20}.

Ein entscheidender Vorteil der Gefrierbruchtechnik ist ihre Fähigkeit, die innere Organisation der begrenzenden Membran aufzulösen, was ein Schlüsselfaktor für das Verständnis ist, wie EVs auf Empfängermembranen abzielen und mit ihnen interagieren. Hier analysierten wir die Membranen von MVs, aber Freeze-Fracturing könnte die Membranorganisation jeder anderen Population von EVs aufdecken. MVs werden durch Plasmamembranknospen gebildet; Daher wird erwartet, dass Plasmamembranproteine und Proteincluster in der MV-Membran gefunden werden. Unsere Ergebnisse bestätigten, dass die MVs aus T24-Zellen Intramembranpartikel enthielten, die integrale Membranproteine präsentierten. Basierend auf der Partikelverteilung zwischen der E-Fläche und der P-Fläche ist es vernünftig zu erwarten, dass die in MVs beobachteten Partikel Transmembranprotein-Uroplakine sind, die urothelzellspezifisch^{sind 21,24}. Die beobachteten Partikel waren spärlich, was im Einklang mit früheren Studien steht, die eine Reduktion der Uroplakins während der Urothelkarzinogenese berichteten^21,22,23. Um die Proteinzusammensetzung von MV-Membranen weiter zu untersuchen, wird jedoch die Verwendung der FRIL-Technik (Freeze-Fracture Replica Immune-Labeling) empfohlen. FRIL ist eine Weiterentwicklung der vorgestellten Gefrier-Fraktur-Technik und widmet sich der Aufdeckung der Identität von Proteinen in Replikaten durch Antikörpererkennung^24,25. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Gefrierbruchtechnik eine elektronenmikroskopische Technik ist, die für die Charakterisierung der EV-begrenzenden Membran sowie der Form, Größe und Reinheit der isolierten EV-Fraktionen geeignet ist. Das vorgestellte Protokoll kann auch für die Bewertung anderer Populationen isolierter Elektrofahrzeuge verwendet werden; Daher verdient die Gefrier-Frakturing-Technik die Aufnahme in die Richtlinien der International Society for Extracellular Vesicles für Studien, die die Organisation von EV-begrenzenden Membranen untersuchen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
A-DMEM	ThermoFisher Scientific, USA	12491015
Balzers freeze-fracture device	Balzers AG, Liechtenstein	Balzers BAF 200
Centrifuge	Eppendorf, Germany	model 5810R
CO2 incubator HeraCell	Heraues, Germany
Copper carriers	Balzers	BB 113 142-2	100+ mesh
Copper grids	SPI, United States	2010C
Culture flask T75	TPP, Switzerland		growing surface 75 cm2
F12 (HAM)	Sigma-Aldrich, Germany	21765029
FBS	Gibco, Life Technologies, USA	10500064
Glazed Porcelain Plate 6 Well	Fischer Sientific, United States	50-949-072
Glycerol	Kemika, Croatia	711901	final concentration 30 % (v/v)
Glutaradehyde	Serva, Germany	23114.01	final concentration 2.5 % (v/v)
GlutaMAX	Gibco, Life Technologies	35050-079	final concentration 4 mM
Penicillin	Gibco, Life Technologies	15140163	final concentration 100 U/ml
Phase-contast inverted microscope	Nikon, Japan	model Eclipse
Rotor	Eppendorf, Germany	A 4-44
Rotor	Eppendorf, Germany	F-34-6-38
Serological pipetts	TPP, Switzerland		50mL volume
Sodium hypochloride solution in water	Carlo Erba, Italy	481181
Stereomicroscope	Leica, Germany
Streptomycin	Gibco, Life Technologies	35050038	final concentration 100 mg/mL
Transmission electron microscope	Philips, The Netherlands	model CM100	working at 80 kV
Tweezers	SPI, United States