יצירת תרביות ממשק אוויר-נוזל של תאי אפיתל דרכי הנשימה מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

Summary

ההתקדמות האחרונה בפרוטוקולי התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם מאפשרת נגזרת מדורגת של סוגי תאים ספציפיים לאיברים. כאן, אנו מספקים שלבים מפורטים לתחזוקה והרחבה של תאי בסיס של דרכי הנשימה שמקורם ב-iPSC והתמיינותם לאפיתל רירית בתרביות ממשק אוויר-נוזל.

Abstract

מחלות של דרכי הנשימה המוליכות כגון אסתמה, סיסטיק פיברוזיס (CF), דיסקינזיה סילארית ראשונית (PCD) וזיהומים נגיפיים בדרכי הנשימה הן הגורמים העיקריים לתחלואה ולתמותה ברחבי העולם. פלטפורמות במבחנה המשתמשות בתאי אפיתל הסימפונות האנושיים (HBECs) סייעו להבנתנו את אפיתל דרכי הנשימה בבריאות ובמחלות. גישה ל-HBECs מאנשים עם מחלות גנטיות נדירות או מוטציות נדירות היא צוואר בקבוק בחקר הריאות.

תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) נוצרים בקלות על ידי "תכנות מחדש" של תאים סומטיים ושומרים על הרקע הגנטי הייחודי של התורם הבודד. ההתקדמות האחרונה מאפשרת התמיינות מכוונת של תאי iPSCs לתאי אב אפיתל ריאה, לתאי נאדיות מסוג 2, כמו גם לתאים של אפיתל דרכי הנשימה המוליכות באמצעות תאי בסיס, תאי הגזע העיקריים של דרכי הנשימה.

כאן אנו מתווים פרוטוקול לתחזוקה והרחבה של תאי בסיס של דרכי הנשימה שמקורם ב-iPSC (להלן iBC) וכן את התמיינות הטריליינאז'ים שלהם בתרביות ממשק אוויר-נוזל (ALI). iBC מתוחזקים ומורחבים ככדורי אפיתל התלויים בטיפות של מטריצה חוץ-תאית בתרבית בתווך תאי בסיס ראשוני בתוספת מעכבים של מסלולי איתות TGF-ß ו-BMP. iBC בתוך כדורי אפיתל אלה מבטאים סמנים בסיסיים מרכזיים TP63 ו- NGFR, ניתן לטהר אותם על ידי מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה מופעלת (FACS), וכאשר הם מצופים על ממברנות נקבוביות בתנאי תרבית ALI סטנדרטיים, מתמיינים לאפיתל דרכי הנשימה הפונקציונלי. תרביות ALI שמקורן בתורמים בריאים מורכבות מתאים בסיסיים, מפרישים ורב-תאיים ומדגימות שלמות מחסום אפיתל, ריסונים תנועתיים והפרשת ריר. תרביות שמקורן באנשים עם CF או PCD משחזרות את הובלת הכלוריד הלא מתפקדת בתיווך CFTR או ריסונים immotile, מומי האפיתל הגורמים למחלה בהתאמה.

כאן אנו מציגים פרוטוקול ליצירת תאים אנושיים שניתן ליישם עבור מידול והבנה של מחלות בדרכי הנשימה.

Introduction

מחלות ריאה כרוניות אחראיות לנטל גדול של תחלואה ותמותה ברחבי העולם¹. מצבים המשפיעים על דרכי הנשימה המוליכות, כגון אסתמה, סיסטיק פיברוזיס (CF), דיסקינזיה סילארית ראשונית (PCD) וזיהומים ויראליים מייצגים הן מחלות נפוצות והן נדירות יותר, נרכשות וגנטיות, התורמות לנטל עולמי זה. הפונקציות העיקריות של דרכי הנשימה המוליכות הן: 1) לשמש צינור לזרימה הלמינרית של האוויר, ו-2) לספק פינוי ריריות של פתוגנים ופסולת. תאי הפרשה, רב-מגזריים ותאי בסיס מייצגים את סוגי תאי האפיתל העיקריים של דרכי הנשימה המוליכות. סוגי תאי אפיתל נדירים יותר כוללים יונוציטים, תאי תנים ותאים נוירואנדוקריניים, ונסקרו במקום אחר².

באופן כללי, חסם מרכזי להבנת מנגנוני מחלה וקידום גישות טיפוליות היה מחסור עקבי ברקמות ראשוניות אנושיות לשימוש במודלים פרה-קליניים. HBECs נחשבים בדרך כלל למודל החוץ גופי הסטנדרטי של תקן הזהב של ביולוגיה אפיתל של דרכי הנשימה האנושיות ומילאו תפקידי מפתח במחקר CF בפרט³. עם זאת, הם מבודדים בדרך כלל מביופסיות ברונכוסקופיות, מרקמת ריאה לאחר הניתוח, או מריאות שנדחו למטרות השתלה. הגישה ל-HBECs מאנשים עם מחלות גנטיות, כולל סדרי העדיפויות המחקריים של CF ו-PCD, היא נדירה ובלתי צפויה. יש צורך בהתגברות על צוואר בקבוק זה לתאי אפיתל של דרכי הנשימה שמקורם בחולה. iPSCs נוצרים בקלות מכל אדם, הם שומרים על הרקע הגנטי הייחודי של התורם, ויש להם יכולת יוצאת דופן להתרבות ולשרוד לטווח ארוך בתנאי תרבית תאים ^4,5,6. על ידי סיכום שלבים אמבריולוגיים מרכזיים, iPSCs עוברים "התמיינות מכוונת" לסוגי תאים ספציפיים לאיברים. אנו ואחרים פיתחנו פרוטוקולים ליצירת אבות ריאה שמקורם ב-iPSC, תאים מסוג alveolar Type 2 ^{7,8 ותאי} נתיב האוויר המוליכים כולל תאי בסיס של דרכי הנשימה ^9,10,11,12.

תא הבסיס של דרכי הנשימה הוא תא הגזע של דרכי הנשימה המוליכות¹³. בעבודה שפורסמה בעבר, הקבוצה שלנו יצרה תאי אפיתל של דרכי הנשימה שמקורם ב-iPSC, כולל תת-קבוצה (iBCCs) המבטאת סמנים קנוניים של תאי בסיס, כולל TP63, KRT5 ו-NGFR. בעקבות רמזים מביולוגיה של תאי בסיס בוגרים, עיכוב של מסלולי SMAD כפולים (TGF-β ו-BMP) מוביל לוויסות מחדש של NGFR+ iBCs^11,14. NGFR+ iBC עוברים החייאה כתאים בודדים בטיפות של מטריצה חוץ-תאית ומרובתים בתווך של תאי בסיס. הם מחדשים את עצמם כדי לשמור על אוכלוסיית iBC וליצור כדורי אפיתל; עם זאת, חלק ניכר גם מתמיינת לתאים מפרישים בפורמט זה (המכונה תרבית תלת-ממדית). בפרוטוקול הבא, אנו מפרטים את השלבים לתחזוקה והרחבה של iBC אלה בתרבות תלת-ממדית, כמו גם את השלבים הנדרשים ליצירת תרבות ALI דו-ממדית דו-ממדית פונקציונלית.

השלבים הראשונים של פרוטוקול הבחנה זה פורסמו בעבר ולא ייבדקו כאן^11,12. כתב יד זה יתמקד בהרחבה ובטיהור של iBC והתמיינותם לאחר מכן לתאים מפרישים פונקציונליים ורב-תאיים בתרבית ALI.

Protocol

כל אחד מהשלבים הבאים צריך להתבצע בטכניקה סטרילית במכסה זרימה למינרי ברמה של בטיחות ביולוגית 2. יש לחמם את כל המדיה לטמפרטורת החדר (22 מעלות צלזיוס) לפני הוספתה לתאים, למעט כאשר צוין במפורש אחרת. כל שלב צנטריפוגה צריך להתבצע בטמפרטורת החדר (בערך 22 מעלות צלזיוס). איור 1 מתאר את השרטוטים של הפרוטוקול.

1. הכנת המדיה הנדרשת

הערה: ראה קובץ משלים 1 לקבלת פרטים.

1. מדיום תא בסיס
   1. הכן את מדיום הבסיס על פי הוראות היצרן.
   2. לכל 50 מ"ל של מדיום הבסיס, הוסיפו 5 μL של A83-01 (10 mM), 5 μL של DMH1 (10 mM), 50 μL של Y-27632 (10mM) ו-100 μL של פרימוצין (50 מ"ג/מ"ל). להלן, מדיה זו מכונה מדיום תא בסיס.
   3. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש אחד.
2. מדיום הבחנה עלי
   1. הכן את המדיום על פי הוראות היצרן.
   2. לכל 50 מ"ל של מדיום התמיינות ALI, יש להוסיף 100 μL של פרימוצין (50 מ"ג/מ"ל).
   3. אחסן מוגן מפני אור בטמפרטורה של 4 °C (4 °F) למשך עד חודש אחד.
3. מאגר מיון
   1. עבור כל 50 מ"ל של מאגר מיון, שלבו 47.5 מ"ל של תמיסת המלח המאוזנת של הנקס, 1 מ"ל של FBS, 200 μL של EDTA (500 mM), 1.25 מ"ל של חיץ HEPES (1 M), 50 μL של Y-27632 (10 mM) ו-100 μL של פרימוצין (50 מ"ג/מ"ל).
   2. מסנן לעקר באמצעות גודל נקבובית של 0.4 מיקרומטר.
   3. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש אחד.
4. מדיום שימור בהקפאה
   1. עבור כל 50 מ"ל של מדיום שימור בהקפאה, שלבו 45 מ"ל של מדיום תאי בסיס ו-5 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (DMSO).
   2. מסנן לעקר באמצעות גודל נקבובית של 0.4 מיקרומטר.
   3. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש אחד.

2. הפשרה של iBC בהקפאה

1. הפשרה (על קרח) נפח מספיק של גורם גדילה תלת-ממדי הפחית את המטריצה החוץ-תאית (להלן מטריצה תלת-ממדית). יש לשמור על קרח עד שהם מוכנים לשימוש.
   הערה: בעת הפשרה של בקבוקון אחד (המכיל 250,000 תאים), הפשרה של 100-200 μL של מטריצה תלת-ממדית.
2. להפשיר בקבוקון של תרחיפים חד-תאיים של תאי iBC שהושרו בעבר בהקפאה על ידי דגירה באמבט מים או חרוזים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס רק עד שאין מדיה קפואה נראית לעין (1-2 דקות).
3. באמצעות פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל, מוסיפים את תרחיף התא לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
4. הוסיפו 6-10 מ"ל של DMEM/F12 באופן טיפתי לתרחיף התא, ערבבו בעדינות וצנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות כדי להעיף את התאים.
5. לשאוף את הסופרנטאנט ולהחיות את גלולת התא ב-1 מ"ל של מדיום תאי הבסיס עם מיקרופיפט P1000. יש להסיר 10 μL aliquot ולבצע ספירת תאים.
6. צנטריפוגה של התאים ב 300 x g במשך 5 דקות. שאפו את הסופרנטנט ובצעו החייאה בתאים בצפיפות של 4,000 תאים/μL במטריצה תלת-ממדית שהופשרה בעבר עם מיקרופיפט P1000.
   הערה: חשוב להימנע מהוספת בועות למטריצה תלת-ממדית. פיפטה את המטריצה לאט ובזהירות.
7. עם מיקרופיפט P200, הוסיפו טיפה אחת (25 או 50 μL) לבסיס של כל באר של צלחת שטופלה בתרבית רקמה של 12 בארות. אם מתחילים עם 250,000 תאים קפואים, המספר הצפוי של טיפות בשלב זה הוא בין 3-4 (25 μL טיפות), בהתאם לכדאיות התא.
8. דגירו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך כ-15 דקות, ולאחר מכן הוסיפו מספיק מדיום תא בסיסי לכל באר כדי להטביע את הטיפה במלואה (1.5 מ"ל עבור 50 μL; 1 מ"ל עבור 25 μL), באמצעות פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל. מחזירים את הצלחת לחממה לחה.
9. הזנת תאים כל יומיים באמצעות מדיום תאי בסיס טריים. מוסיפים מדיום טרי לצד הבאר עם פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל, תוך הקפדה שלא להפריע לטיפות התאים.
   הערה: צפיפות התאים המצופים בשלב זה גבוהה פי 10 מההעברה השגרתית של תאי iBC בחלק 3.

3. דיסוציאציה של ספרואידים והרחבת iBC בתרבית תלת-ממדית

1. להפשיר (על הקרח) נפח מספיק של מטריצה תלת-ממדית. יש לשמור על קרח עד שהם מוכנים לשימוש.
   הערה: נפח המטריצה התלת-ממדית הנדרשת ישתנה בהתאם למספר התאים שהמשתמש יזדקק להם.
2. כ-5-7 ימים לאחר מכן, שאפו את המדיום מכל באר ועם מיקרופיפט P1000, הוסיפו 1 מ"ל של Dispase II (1 U/mL) ישירות על הספרואידים כדי להתנתק מהטיפה של המטריצה.
   1. הניחו את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות.
3. באמצעות מיקרופיפט P1000, פיפט את הדיספאז למעלה ולמטה 1-2 פעמים, תוך שבירת גושים גדולים של מטריצה תלת-ממדית. מחזירים את הצלחת ל-37 מעלות צלזיוס למשך 30-40 דקות נוספות, ומאפשרים למטריצה להתמוסס לחלוטין.
   1. כאשר טיפת המטריצה התלת-ממדית אינה נראית עוד מתחת למיקרוסקופ האור, הוסיפו את הספרואידים הצפים בחופשיות לחרוט של 15 מ"ל באמצעות קצה פיפטה סרולוגי של 5 מ"ל. הוסף DMEM/F12 לנפח סופי של 10 מ"ל לכל חרוטי וצנטריפוגה ב-200 x גרם למשך 3 דקות כדי להדוף את הספרואידים.
4. שאפו את הסופרנאטנט והוסיפו 1 מ"ל של 0.05% טריפסין (37 מעלות צלזיוס) עבור כל טיפה ראשונית המנותקת (למשל, אם מתחילים עם ארבע טיפות, הוסיפו 4 מ"ל טריפסין לבקבוקון החרוטי).
   1. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, תוך טריטורציה תכופה (כל 2-3 דקות).
   2. העריכו באמצעות מיקרוסקופ האור כל כמה דקות. לאחר שהרוב (>90%) של הספרואידים נותקו לתאים בודדים, הוסיפו 10% סרום בקר עוברי (ב-DMEM/F12) ביחס נפח של 1:1 לטריפסין.
5. סנן את התאים דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר וצנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות.
6. בצע ספירת תאים ובצע החייאה שווה של התאים בצפיפות של 400 תאים/μL של מטריצה תלת-ממדית מופשרת. הימנעו מהכנסת בועות אוויר. יש לבצע שימוש חוזר במספר הטיפות הדרושות ליישום במורד הזרם. חזור על שלב 2.6-2.9 עבור כל באר.

4. הערכה וטיהור של NGFR+ iBC

1. לאחר 10-14 ימים של המעבר האחרון, נתקו את הספרואידים לתרחיף של תא בודד כמו בשלבים 3.2-3.5 ובצעו ספירת תאים.
   הערה: קווי iPSC שונים מתנהגים אחרת; לכן, הטווח של 10-14 ימים עשוי להשתנות עבור iBC שונים. אנא עיין באיור 2 לקבלת הופעות אופייניות של תאי IBC תלת-ממדיים לאחר 1, 4, 8 ו-14 ימים, כאשר הם מתאימים למיון תאים מסוג NGFR+. מיון מוקדם מהמומלץ (לדוגמה, יום 8 כמו באיור 2C), גורם למספר תאים נמוך יותר באופן כללי עם ביטוי NGFR תכוף פחות. מיון מאוחר יותר מהמומלץ (למשל, יותר מ-14 יום לאחר המעבר האחרון) מוביל להישרדות לקויה של התאים לאחר המיון.
2. בצעו החייאה של התאים בצפיפות של 1 x 10⁶ תאים/100 μL ב-Sort Buffer (האוכלוסייה העיקרית). מעבירים אליקוט קטן (25-50 μL) לצינור נפרד (אוכלוסייה מינורית).
   1. הוסף נוגדן מצומד נגד NGFR (דילול 1:100) לאוכלוסיית התאים העיקרית.
   2. הוסף נוגדנים לבקרת איזוטיפ (דילול 1:200) לאוכלוסיית התאים הקטנים.
   3. הגנו על התאים מפני אור ושמרו על קרח במשך 30 דקות, לסירוגין (כל 5-10 דקות) תוך טריטורציה של התאים כדי למנוע תקיעת כדורים.
3. לאחר 30 דקות, הוסף את מאגר המיון ביחס של 1:1 לכל צינור של תאים. תאי צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות.
4. שאפו את הסופרנטנט, נצלו מחדש את התאים המכוסים במאגר המיון בצפיפות של 10 x 10⁶ תאים/מ"ל, והוסיפו כתם של תאים חיים או מתים.
5. באמצעות אסטרטגיית NGFR+ gating מתאימה (המבוססת על בקרת איזוטיפ, ראו איור 3), מיין מספיק תאי NGFR+ חיים עבור יישומים נחוצים במורד הזרם.
   הערה: אם משתמשים ב-iBC עם כתבים פלואורסצנטיים (כלומר, NKX2-1^GFP TP63^tdTomato), מומלץ למיין עבור תאים "חיוביים משולשים" (כלומר, NKX2-1^GFP+, TP63^tdTomato+, NGFR+), עם בחירת שערים מתאימה ופיצוי (איור 3). במהלך התפשטות זו של iBC, חלק מהתאים מתמיינים לתאים מפרישים וניתן לזהות גם חלק קטן מאוד של תאים רב-תאיים. שתי האוכלוסיות הללו הן NGFR-.

5. דור של תרבויות ALI ריריות

1. הכן תוספות ממברנה נקבובית של 6.5 מ"מ על ידי הוספת מטריצה של 200 μL לתא האפי (מטריצה מוסמכת לתאי גזע עובריים אנושיים או למינין אנושי רקומביננטי-521) לפי הוראת היצרן.
   1. יש להניח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות לפחות לפני הצורך.
2. שאפו את מטריצת הציפוי מהתא האפיקלי של התוספת. הוסף 500 μL של מדיום התא הבסיסי לתא הבזולטרלי.
3. יש לבצע החייאה של לפחות 30,000 תאי NGFR+ ממוינים (משלב 4.5) ב-100-200 μL Basal Cell Medium ולהעביר לתא האפיקלי באמצעות מיקרופיפט P200. חזור על הפעולה עבור בארות רבות ככל הרצוי (ותאים זמינים). מניחים את הצלחת באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס.
4. תוך 2-3 ימים, שאפו לתאים אפיקליים ובזולטראליים והזינו עם מדיום תאי בסיס טריים (500 μL עד apical, 100 μL עד basolateral).
5. נטר את תא האפיקל מדי יום באמצעות מיקרוסקופיית אור. כאשר התאים נפגשים >80% (בדרך כלל 3-7 ימים), החליפו את מדיום תאי הבסיס בתווך התמיינות ALI (לא מחומם מראש) הן בתאים אפיקליים והן בתאים בזולטרליים. בעת עבודה עם ALI Differentiation Medium, הגן מפני אור על-ידי שמירה על מיכלי מדיה עטופים בנייר כסף ועל-ידי כיבוי אורות תקורה בעת הצורך.
6. למחרת, שאפו את המדיום מהתא האפיקלי, ובכך חשפו את פני השטח האפיים לאוויר.
7. החלף את מדיית ההבחנה הבינונית של ALI בתא הבזולטרלי כל 2-3 ימים.
   1. עקוב אחר הופעת התרבות כל 1-2 ימים. יש לשאוף בזהירות לכל נוזל שהצטבר מהתא האפיקלי, מבלי להפריע לשכבת התא.
   2. הערך את ההתנגדות החשמלית הטרנס-פיתלית (TEER) לשלמות אפיתל.
      הערה: ניתן להעריך את TEER בימים שלאחר החשיפה לאוויר כדי לתת קריאה של שלמות שכבת האפיתל. הזמן האידיאלי למדידת TEER לא נקבע, אם כי ערכים התואמים את ההבחנה הרירית באיכות גבוהה הם בדרך כלל >500 x cm².
   3. אם יש צורך להסיר פסולת או ריר, להוסיף בעדינות 100 μL PBS (ללא Ca²⁺ או Mg²⁺) לתא apical. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן שאפו בזהירות ל-PBS.
   4. לאחר 7-10 ימים של חשיפה לאוויר, בדרך כלל מופיעים ריסונים תנועתיים וניתן לראותם באמצעות מיקרוסקופיית אור. בהתאם לניסוי המתוכנן ולקריאה, ניתן לנתח תאים לאחר 14-28 ימים של חשיפה לאוויר.
      הערה: אם נעשה שימוש בתאי כתב פלואורסצנטי, ואם קיים מיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאים חיים, ניתן לעקוב אחר התאים באמצעות מיקרוסקופ אור וכן באמצעות פלואורסצנציה מדווחת.

6. שימור בהקפאה אופציונלית (אך מומלצת) של iBC

1. לאחר 10-14 ימים של מעבר התרבית התלת-ממדית האחרון, נתקו את הספרואידים לתרחיף חד-תאי כמו בשלבים 3.2-3.5. בצע ספירת תאים.
2. החייאה במדיום שימור בהקפאה בצפיפות של 250,000 תאים/500 μL בקריוביאל.
3. מקם את cryovial(s) במיכל כדי להבטיח ירידה מתמדת בטמפרטורה (1 °C ( 1 ° C לדקה) ולהעביר ל - 80 ° C למשך 24 -48 שעות, ולאחר מכן העברה ל - 150 ° C לאחסון לטווח ארוך.
   הערה: בוצעו שימורים חוזרים בהקפאה, כמו גם שימור בהקפאה של תאים ממוינים מסוג NGFR+ בעבר, אך אלה לא הוערכו כראוי עבור כדאיות התאים והיכולת ליצור תרביות ALI פונקציונליות. במיוחד עם מעבר תאים מורחב, מומלץ להעריך עבור קריוטיפ כפי שצוין כי זה השתנה ב- iPSCs ותאים שמקורם ב- iPSC.

תוצאות

בעקבות פרוטוקול זה, 200,000 iBCs בהקפאה (שאושרו בעבר כבעלי קריוטיפ 46XY רגיל)¹¹ הופשרו והורחבו בתרבות תלת-ממדית. חמישה ימים לאחר מכן, הספרואידים שנוצרו כתוצאה מכך נותקו, נספרו ועברו שוב להרחבה נוספת. כ-480,000 תאים התקבלו והושהו מחדש במטריצה תלת-ממדית (12 x 50 μL טיפות, צפיפות של 400 תאים/μL). מדיום תאי בסיס טריים הוחל כל 2-3 ימים. עשרה ימים לאחר מכן, התאים שוב נותקו ונספרו. בסך הכל 19.7 x 10⁶ תאים נקטפו והוכנו עבור FACS. 10⁶ תאים הוכתמו בבקרת האיזוטיפ IgG₁κ המצומדת ב-APC, ו-18.7 x 10⁶ התאים הנותרים הוכתמו בנוגדן האנטי-NGFR המצומד ל-APC למשך 30 דקות מוגנות מפני אור (איור 3).

NGFR+ gating בוצע לאחר השוואה לתאי הבקרה של האיזוטיפים והוצב בכוונה כדי לאסוף את תאי ה-NGFR+ בעלי הביטוי הגבוה ביותר (איור 3). בעזרת טכניקת גידור זו, 28% מהתאים החיים והבודדים היו NGFR+. בעוד שתאים נוספים היו זמינים, נאספו 750,000 תאים לתרבית במורד הזרם. תאים ממוינים נזרעו מחדש במדיום תאי בסיס בריכוז של 50,000 תאים/100 μL. 50,000 תאים נזרעו לאחר מכן על כל תוסף ממברנה נקבובית בקוטר 6.5 מ"מ, אשר היה מצופה בלמינין-521 רקומביננטי אנושי (2 מיקרוגרם/200 מיקרול') בהתאם להנחיות היצרן. 500 μL תווך תא בסיסי נוסף לתא basolateral של כל תוספת ואת הלוח הניח באינקובטור 37 °C לח. שלושה ימים לאחר מכן, המדיה בתא האפיקל שאפה והתאים היו כ-90% מפגש על ידי מיקרוסקופיית אור (איור 4B). התקשורת מהלשכה הבסולטרלית שאפה; מדיום ההבחנה של ALI נוסף לתאים האפיקליים (100 μL) והבזולטרליים (500 μL). למחרת, התקשורת מהלשכה האפית שאפה.

במהלך 21 הימים הבאים, התאים הוערכו על ידי מיקרוסקופיית אור מעת לעת והוזנו במדיום התמיינות ALI טרי (תא basolateral בלבד) כל 2-3 ימים. תאים בודדים היו ניתנים לזיהוי בקלות בתחילה (איור 4A), היו בעלי מראה מוארך בצורת ציר, ויצרו חד-שכבתית ארוזה באופן רופף (איור 4B). במהלך הימים עד השבועות שלאחר מכן, התאים יצרו שכבת אפיתל תאית צפופה, תאית מאוד, ולאחר 7-10 ימים הייתה הופעתה הברורה של ייצור ריסונים ולריריים. TEER של הדגימות חושבו ודומות לבקרות תאים ראשוניות (טווח בין 700-1600 Ω x cm²)¹¹. קיבוע מאוחר יותר (יום 21-28) עם פרפורמלדהיד ואימונו-לתיוג עבור סמני תאי אפיתל קנוניים של דרכי הנשימה בוצע עבור MUC5AC ואצטילאטד-α-טובולין, בין היתר (איור 4C). באופן כללי, עם התצפית שלנו על ריסונים תנועתיים, ייצור ריר, כמו גם חיסון מאשר של תאים רב-גוניים ומפרישים, הדומה לזה של HBECs ראשוניים, הסקנו כי יצרנו בהצלחה תאי אפיתל של דרכי הנשימה מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים.

איור 1: שרטוט כללי של הפרוטוקול. iBCs המופשרים בהקפאה, מורחבים ומטוהרים על ידי FACS לפני הציפוי על תוספות ממברנה נקבובית, שם הם מתמיינים לאפיתל רירית פונקציונלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: תמונות ניגודיות פאזה מייצגת. תמונות ניגודיות פאזה מייצגות המדגימות את המראה הרגיל של iBC בתרבית תלת-ממדית לאחר (A) יום אחד, (B) 4 ימים, (C) 8 ימים ו-(D) 14 ימים (רק לפני מיון NGFR). סרגלי קנה מידה מייצגים 500 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: חלקות FACS מייצגות. תוכניות FACS מייצגות עבור iBC שאינם מדווחים ועיתונאים פלואורסצנטיים. דוגמאות לבקרות איזוטיפ מוצגות ומשמשות לבחירה עבור תאי NGFR+ בעלי ההבעה הגבוהה ביותר. קווי iPSC המכילים כתב פלואורסצנטי "ממוינים משולשת" עבור תאי NKX2-1^GFP+ TP63^tdTomato+ NGFR+. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4: תמונות מייצגות של תרביות iBC על ממברנות נקבוביות. תמונות ניגודיות פאזה מוצגות (A) יום אחד ו -(B) 3 ימים לאחר הציפוי. סימון חיסוני מייצג של תרבויות ריריות המוצגות ב-(C); אצטילאטד-אלפא טובולין (ירוק) ו- MUC5AC (אדום). סרגלי קנה מידה מייצגים 25 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

קובץ משלים 1: טבלת רכיבי מדיה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

HBECs הם סוג התאים הסטנדרטיים לזהב לחקר מחלות של אפיתל דרכי הנשימה. בשל מגבלותיהם (כולל נגישות וקושי לתמרן גנטית), יצרנו פרוטוקול להפקת iBCs ותרביות ALI. תאים אלה יכולים להיות מופקים מכל תורם ולשמור על הרקע הגנטי הייחודי שלהם, ובכך לאפשר מחקרים התפתחותיים בסיסיים, מודלים של מחלות ופיתוח טיפולי חדשני.

בעוד שכל שלב בודד של הפרוטוקול המתואר הוא הכרחי, ישנם כמה שראויים לאזכור נוסף. ראשית, בכל שלב הדורש דיסוציאציה של ספרואידים לתאים בודדים, חיוני להימנע מצנרת מוגזמת; עיכול אנזימטי (עם דיספוז או טריפסין) מקדם הישרדות טובה יותר של התאים, בעוד שצנרת מוגזמת מובילה למוות משמעותי של התאים. שנית, בעת טיהור NGFR+ iBC, ניצול בקרת האיזוטיפ הוא חיוני ואנו ממליצים לבחור עבור תאי NGFR+ בעלי הבעה הגבוהה ביותר עם FACS (איור 3). גישה זו מביאה לתרבויות ALI אופטימליות עם הבחנה רירית מתאימה. לבסוף, ההכנה והזריעה של ממברנות נקבוביות בדיוק כפי שתועדו בפרוטוקול היא בסיסית להישרדות תרבית ALI. בעוד שבדרך כלל אנו זורעים 30,000-60,000 תאים בכל תוסף, הייתה לנו הצלחה עם פחות מ-20,000 תאים. בעוד שניתן ליצור תרביות מוצלחות באמצעות ציפוי המטריצה של תאי גזע עובריים אנושיים, לאחרונה השתמשנו לאחרונה בלמינין-521 רקומביננטי אנושי עם עמידות גבוהה משמעותית של תרביות ALI.

לעתים רחוקות מאוד, הבחנות iPSC עשויות להיכשל בוויסות של אחוז הולם של iBC NGFR+. במקרה זה, מעבר סדרתי של iBC (בתרבית תלת-ממדית) יכול לגרום לתדר NGFR מוגבר לאורך זמן. המגבלות של פרוטוקול זה כוללות את הזמן, העלות והמומחיות הדרושים ליצירת תאים אלה. בנוסף, אנו מכירים בכך שחוקרים רבים מתעניינים בסוגי התאים הפחות נפוצים של אפיתל דרכי הנשימה (למשל, יונוציטים, תאים נוירואנדוקריניים). בעוד שזיהינו כמה מסוגי התאים הנדירים האלה, כמו בתרביות HBEC ראשוניות, הם אינם מזוהים באופן משוחזר, ככל הנראה בשל ידע חלקי לגבי הרמזים ההתפתחותיים הנדרשים ליצירת תאים אלה.

כפי שהוא כתוב, הפרוטוקול לעיל מתחיל עם הפשרה של iBC שכבר הוקפאו. הפרטים שקדמו להקפאה זו מתוארים קודם לכן ומעבר להיקפו של כתב יד זה^11,12.

שיטת תרבית האפיתל ALI של דרכי הנשימה שלנו מאפשרת יצירת תאי אפיתל תפקודיים של דרכי הנשימה מכמעט כל תורם. זה מגדיל מאוד את הנגישות לתאי אפיתל יקרי ערך מבוקרים גנטית של דרכי הנשימה שעשויים לשמש למידול מחלות, בדיקת תרופות, טיפולים עתידיים מבוססי תאים, כמו גם לשיפור ההבנה של הדפוס ההתפתחותי בתוך אפיתל דרכי הנשימה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well tissue culture treated plate	Corning	3515	flat bottom
3-D growth factor reduced Matrigel	Corning	356230
A83-01	ThermoFisher Scientific	293910
Cell culture inserts (Transwell)	Corning	3470	6.5mm diameter; 0.4μm pore size
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418
Dispase II, Powder	ThermoFisher Scientific	17105-041
DMH1	ThermoFisher Scientific	412610
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture (DMEM):F-12	ThermoFisher Scientific	11330-032
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X)	Gibco	14190-144
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt solution (EDTA)	Sigma	E7889
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher	SH3007003E
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	ThermoFisher Scientific	14175-079
HEPES	Sigma	H3375
hESC-qualified Matrigel	Corning	354277
Mouse IgG1kappa isotype control, APC-conjugated	Biolegend	400122
Mouse monoclonal anti-human CD271/NGFR, APC-conjugated	Biolegend	345108
PneumaCult-ALI Medium (ALI Differentiation Medium)	StemCell Technologies	05001
PneumaCult-Ex Plus Medium (Basal Cell Base Medium)	StemCell Technologies	05040
Primocin	InvivoGen	ant-pm-2
rhLaminin-521	ThermoFisher Scientific	A29248	Final Concentration: 10ug/mL
Trypsin-EDTA Solution, 0.05%	Invitrogen	T3924
Y-27632	Tocris	1254