קביעת זיקה מחייבת (KD) של נוגדנים בעלי תווית רדיו לאנטיגנים משותקים

Summary

כאן מתוארת שיטה לקביעת הזיקה המחייבת (K_D) של נוגדנים בעלי תווית רדיו לאנטיגנים משותקים. K_D הוא קבוע דיסוציאציית שיווי המשקל שניתן לקבוע מניסוי קשירת רוויה על ידי מדידת הקשירה הכוללת, הספציפית והלא ספציפית של נוגדן בעל תווית רדיו בריכוזים שונים לאנטיגן שלו.

Abstract

קביעת זיקה מקשרת (K_D) היא היבט חשוב של אפיון נוגדנים בעלי תווית רדיו-תווית (rAb). בדרך כלל, זיקה מקשרת מיוצגת על ידי קבוע הדיסוציאציה של שיווי המשקל, K_D, וניתן לחשב אותה כריכוז הנוגדן שבו מחצית מאתרי הקישור של הנוגדנים תפוסים בשיווי משקל. ניתן להכליל שיטה זו לכל נוגדן בעל תווית רדיו או פיגומים אחרים של חלבונים ופפטידים. בניגוד לשיטות מבוססות תאים, הבחירה באנטיגנים משותקים שימושית במיוחד לאימות זיקות קושרות לאחר אחסון ארוך טווח של נוגדנים, הבחנה בין זיקות קשירת קשר של זרועות אזור קושר אנטיגן מקטעי (Fab) במבני נוגדנים דו-ספציפיים, וקביעה אם יש שונות בביטוי אנטיגן בין קווי תאים שונים. שיטה זו כוללת שיתוק כמות קבועה של אנטיגן לבארות שצוינו על לוחית 96 בארות הניתנת לשבירה. לאחר מכן, קשירה לא ספציפית נחסמה בכל הבארות עם אלבומין בסרום בקר (BSA). לאחר מכן, rAb נוסף בשיפוע ריכוז לכל הבארות. מגוון של ריכוזים נבחר כדי לאפשר ל-rAb להגיע לרוויה, כלומר ריכוז של נוגדנים שבו כל האנטיגנים קשורים באופן רציף על ידי ה-rAb. בבארות ייעודיות ללא אנטיגן משותק, ניתן לקבוע קשירה לא ספציפית של ה- rAb. על ידי חיסור קשירה לא ספציפית מהקשירה הכוללת בבארות עם אנטיגן משותק, ניתן לקבוע קשירה ספציפית של rAb לאנטיגן. K_D של rAb חושב מתוך עקומת קשירה רוויה שנוצרה כתוצאה מכך. לדוגמה, זיקה מקשרת נקבעה באמצעות amivantamab עם תווית רדיו-תאית, נוגדן דו-ספציפי לקולטן גורם גדילה אפידרמלי (EGFR) וחלבוני מעבר מזנכימלי-אפיתליאלי ציטופלסמי (cMET).

Introduction

לנוגדנים בעלי תווית רדיו (rAb) יש מגוון שימושים ברפואה. בעוד שרובם משמשים באונקולוגיה כחומרי הדמיה וטיפול, ישנם יישומי הדמיה לדלקת הקשורה לראומטולוגיה, קרדיולוגיה ונוירולוגיה¹. הדמיה rAbs יש רגישות גבוהה לאיתור נגעים ויש לו פוטנציאל לסייע בבחירת המטופלים לטיפול ^2,3,4,5. הם משמשים גם לטיפול בגלל הספציפיות שלהם עבור האנטיגנים שלהם בהתאמה. באסטרטגיה המכונה תרנוסטיקה, אותו rAb משמש הן להדמיה והן לטיפול⁶.

באופן אידיאלי, הנוגדן שנבחר לתיוג רדיו הוא כזה שכבר הוכח כבעל זיקה וספציפיות מחייבת גבוהה בשיטות שאינן מתויגות. ניתן להשיג סימון רדיו של נוגדנים באמצעות שינוי כימי ישיר של נוגדנים עם רדיונוקליד היוצר קשרים קוולנטיים יציבים (למשל רדיו-יוד), או בעקיפין באמצעות הצמדה עם כלאטורים שמתואמים לאחר מכן לרדיומטלים ^7,8. תיוג רדיו ישיר כגון עם רדיויוד משנה באופן ספציפי את שאריות הטירוזין וההיסטידין על הנוגדן. אם שאריות אלה חשובות לקשירת אנטיגן, אזי זיקת רדיו זו תשנה את זיקת הכריכה. לעומת זאת, ישנם פרוטוקולים מבוססים מרובים להצמדה ותווי רדיו-תיוג עקיף של נוגדנים. לדוגמה, כלטור נפוץ המשמש לקשירת זירקוניום-89 (⁸⁹Zr) להדמיית PET של נוגדנים הוא p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine (DFO), אשר מצומד באופן אקראי לשאריות ליזין של הנוגדן ^9,10. אם יש שאריות ליזין באזור קשירת האנטיגן, הצמדה באתרים אלה עלולה לעכב באופן סטריקי את קשירת האנטיגן ובכך לפגוע בקשירת הנוגדן-אנטיגן. לפיכך, שיטות הרדיו-קונז'וגציה השונות המשמשות לתיוג רדיו-תיוג עקיף או ישיר של נוגדנים עלולות להשפיע על פעילות חיסונית, המוגדרת כיכולתו של הנוגדן רדיו-קונג'וגאט להיקשר לאנטיגן ^7,11 שלו. שיטות הצמדה ספציפיות לאתר יכולות לעקוף מגבלה זו, אך טכניקות אלה דורשות הנדסת נוגדנים כדי לשלב שאריות ציסטאין נוספות או מומחיות בתגובות אנזימטיות על שאריות פחמימות 12,13,14,15,16. ברגע שנוגדן מתויג, חשוב לבדוק אם פעילות חיסונית נשמרת כחלק מהאפיון של ה-rAb. אחת הדרכים למדוד את האימונו-פעילות החיסונית היא לקבוע את הזיקה המחייבת של rAb.

מטרת פרוטוקול זה היא לתאר תהליך לקביעת זיקת האיגוד עבור rAbs באמצעות מבחן רוויה רדיוליגנד מבוסס כדי לכמת את קשירת rAb-antigen. מגמת הכריכה מתוארת באיור 1. כמות האנטיגן הקשורה תגדל ככל שיתווסף יותר rAb לכמות קבועה של אנטיגן משותק. ברגע שכל האתרים הקושרים אנטיגן יהיו רוויים, תגיע מישור, והוספת rAbs נוספים לא תשפיע על כמות האנטיגן הכבול. במודל זה, קבוע הדיסוציאציה של שיווי המשקל (K_D) הוא ריכוז הנוגדן התופס מחצית מקולטני האנטיגן¹⁷. ה-K_D מייצג עד כמה נוגדן נקשר למטרה שלו עם K_D נמוך יותר המתאים לזיקה מחייבת גבוהה יותר. בעבר דווח כי rAb אידיאלי צריך להיות K_D של 1 ננומולאר או פחות¹⁸. עם זאת, rAbs עדכניים יותר פותחו עם K_D בתחום הננומולרי הנמוך, ונחשבים מתאימים ליישומי הדמיה לא פולשניים ^19,20,21,22. פרמטר נוסף שניתן לקבוע בבדיקת הרוויה הרדיוליגנדית של rAbs הוא B_max, אשר מתאים לכמות המרבית של קשירת אנטיגן. ניתן להשתמש ב-B_max כדי לחשב את מספר מולקולות האנטיגן במידת הצורך.

איור 1: עקומת קשירה מייצגת של רוויה. אחוז האנטיגן הקשור מתווה כנגד ריכוזים הולכים וגדלים של נוגדנים שנוספו לכמות קבועה של אנטיגן. חלונות קופצים מדגימים קשירה בנקודות שונות. הריכוז והקשירה המתאימים ל- K_D ו- B_max, בהתאמה, מוצגים. דמות זו נוצרה עם BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

בדיקה זו חשובה במיוחד עבור מבני נוגדנים דו-ספציפיים בעלי תווית רדיו כדי לקבוע את ה-K_D עבור כל אזור קושר אנטיגן מקטעי (Fab) של זרוע הנוגדן הדו-ספציפי בעל התוויות הרדיו-תוויות עם האנטיגנים המתאימים שלהם. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לקבוע את K_D של כל זרוע Fab בנפרד על אנטיגנים משותקים כדי לאפיין באופן עצמאי אם הזיקה המחייבת של כל זרוע Fab עבור האנטיגן המתאים שלה הושפעה לאחר רדיו-קונסיגנציה. פרוטוקול זה מודגם על ידי שימוש ב- amivantamab עם תווית רדיו- radiolabeled, נוגדן דו-ספציפי לקולטן גורם גדילה אפידרמלי (EGFR) וחלבוני מעבר מזנכימלי-אפיתל ציטופלסמי (cMET)¹⁹. נוגדנים חד-זרועיים בעלי תווית רדיו, כאשר זרוע Fab אחת נקשרת ל-EGFR (α-EGFR) או ל-cMET (α-cMET) וזרוע ה-Fab השנייה היא בקרת איזוטיפ, שימשו גם הם כדוגמאות¹⁹. פרוטוקול זה מתאים גם לכל נוגדן עם תווית רדיו עם אנטיגן ידוע שיכול להיות משותק. בפרוטוקול זה, סדרת דילול של ה-rAb מתווספת לכמות קבועה של אנטיגן משותק בבארות ייעודיות ספציפיות לכל זרוע Fab של ה-rAb. ה-rAb מתווסף גם לבארות שנחסמו רק עם אלבומין בסרום בקר (BSA), ללא אנטיגן, כדי לקבוע קשירה לא ספציפית. כדי לקבוע קשירה ספציפית, קשירה לא ספציפית לאנטיגן משותק מופחתת מהכריכה הכוללת של rAb. עקומת קשירת הרוויה המתקבלת משמשת לאחר מכן לקביעת K_D, כמתואר לעיל.

אחד היתרונות של שיטה זו הוא יכולת שכפול גבוהה יותר בעת שימוש באנטיגנים מטוהרים בהשוואה לשימוש בקווי תאים כמקור לאנטיגנים, בהתחשב בכך שרמות ביטוי אנטיגן עלולות להיות מושפעות במהלך תרבית תאים וכי לקווי תאים שונים יש רמות משתנות של ביטוי אנטיגן. במקרה של נוגדנים דו-ספציפיים בעלי תווית רדיולית, קווי תאים המבטאים רק אחד מהאנטיגנים ללא השני עשויים שלא להיות זמינים, מה שיהפוך את אפיון הזיקה המחייבת של זרועות ה-Fab הבודדות למאתגר מאוד. יש לציין כי היתרון העיקרי של שיטת בדיקת הרדיוליגנד והרוויה על פני שיטות שאינן מתויגות ברדיו הוא האפיון הספציפי של הזיקה המחייבת של ה-rAb ללא התרומה של השבר הלא-מתויג של ה-rAb. למיטב ידיעתם של המחברים, אין כיום טכניקות טיהור להפרדת ה-rAb מהנוגדן הלא-משועבד שלו. בהתחשב בגודל הקטן יחסית של הצ'לטור והרדיונוקליד, תרומתם למשקל המולקולרי הכולל של ה-rAb אינה משמעותית בכרומטוגרפיה של הרחקת גודל. לפיכך, המוצר שנוצר מכל טכניקת radiolabeling הוא כמעט תמיד תערובת של rAb ואת ההורה שלה נוגדן unjujugated. אפיון זיקה מחייבת באמצעות בדיקת הרוויה עם תווית הרדיו מבטיח שהמוצר הנבדק הוא אך ורק rAb.

Protocol

הערה: עיין באיור 2 לקבלת ייצוג גרפי של הפרוטוקול.

איור 2: שרטוט של הפרוטוקול. תוויות שורות ועמודות מסומנות כמדריך להגדרת הלוח הניתן לשבירה של 96 בארות. הכריכה הצפויה מוצגת בדוגמה היטב עבור האנטיגן וה- BSA. החץ המעוקל מציין את ה-rAb שצפוי להישטף מבארות עם BSA בלבד. דמות זו נוצרה עם BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

1. הכנת מאגר

1. הכן 50 מ"ל של חיץ אימוביליזציה (תמיסה מימית של 50 mM Na₂CO₃; pH = 9.0).
   1. שוקלים 191 מ"ג של NaHCO₃ ו-23.9 מ"ג של Na₂CO₃ על נייר שקילה ומעבירים לצינור חרוטי של 50 מ"ל. מוסיפים 40 מ"ל של 18 MΩ מים ומערבולת כדי להתמוסס. התאם את ה- pH ל- 9.0 במידת הצורך לפני שתביא את הנפח הכולל ל- 50 מ"ל עם 18 MΩ מים.
2. הכינו כ-200 מ"ל של מאגר כביסה (מי מלח עם חציית פוספט (PBS) המכילים 0.05% Tween-20) על ידי הוספת 200 מ"ל של PBS ולאחר מכן 100 μL של Tween-20 לבקבוק של 250 מ"ל.
3. הכינו 50 מ"ל של מאגר קשירה (PBS המכיל 0.05% Tween-20, ו-0.1% אלבומין בסרום בקר (BSA)).
   1. שוקלים 50 מ"ג BSA על נייר שקילה ומעבירים לצינור חרוטי של 50 מ"ל. הוסף 50 מ"ל של PBS ולאחר מכן 25 μL של Tween-20 לצינור. מערבולת בעדינות כדי לערבב.
4. הכן 50 מ"ל של מאגר חסימה (3% BSA ב- PBS).
   1. שוקלים 1.5 גרם BSA על נייר שקילה ומעבירים לצינור חרוטי של 50 מ"ל. מוסיפים 50 מ"ל של PBS, ומערבולת בעדינות כדי לערבב.
      הערה: מומלץ לאחסן את כל המאגרים למשך שבוע עד שבוע אחד בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לקבלת התוצאות הטובות ביותר.

2. אימוביליזציה של אנטיגן

1. דיללו את האנטיגן במאגר האימוביליזציה כדי להגיע לריכוז של 5 מיקרוגרם/מ"ל.
2. הוסף 100 μL לכל באר של אנטיגן לתחתית של 24 בארות של לוח 96 בארות, שטוח-תחתון, הניתן לשבירה במערך של 8 x 3 (עמודות 1-3 עבור שורות A-H). מכסים את הצלחת בנייר דבק.
   הערה: ודא כי פני השטח של צלחת הבאר טופלו כדי למקסם את הספיחה של תחומים הידרופוביים והידרופיליים מעורבים. צלחות אלה שטופלו מראש זמינות באופן מסחרי.
3. אינקובציה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ללילה.
4. למחרת, לשטוף את הצלחת 3x עם חיץ כביסה.
   1. הופכים את הצלחת במהירות בכיור כדי להשליך את הנוזל ומקישים על הצלחת על ערימת מגבות נייר כדי להסיר את הנוזל העודף.
   2. באמצעות פיפטה רב-ערוצית, יש להוסיף 300 μL לכל באר של מאגר כביסה לבארות המכילות את האנטיגן. הסר את הנוזל כמתואר ב- 2.4.1. חזור על שלב הכביסה בסך הכל שלוש פעמים.

3. חסימת אתרים לא ספציפיים עם BSA

1. באמצעות פיפטה רב-ערוצית, הוסיפו 300 μL לכל באר של מאגר חוסם ל-24 הבארות מצופות האנטיגן ו-24 בארות ריקות של לוחית 96 הבארות (עמודות 1-6 לשורות A-H).
2. דגירה של הצלחת למשך שעה אחת בטמפרטורת הסביבה.
3. שטפו את הצלחת עם 300 μL לכל באר של מאגר כביסה בסך הכל שלוש פעמים. עיין בשלב 2.4 לתיאור מפורט של שטיפת הצלחת.
    

4. דילולים סדרתיים והוספת תמיסת rAb

אזהרה: השלבים הבאים כוללים רדיואקטיביות. הצעדים צריכים להתבצע רק על ידי אלה עם הדרכת בטיחות קרינה. החוקרים צריכים להכפיל את הכפפה ולבצע צעדים עם סיכוך הולם.

1. לסנתז את rAb תחת חקירה באמצעות שיטת הבחירה. ה-rAbs ששימשו כדוגמה סונתזו כפי שתואר קודם לכן¹⁹.
   הערה: פרוטוקול זה מתמקד באפיון של rAb לאחר תיוג רדיו.
2. בצע דילולים טוריים של 8 x 3x (המיועדים לשורות A-H בלוח) של rAb במאגר הכריכה.
   הערה: הריכוזים של הדילולים הסדרתיים ישתנו עבור כל rAb. הפרטים נדונים בסעיף הדיון. אם גורם הדילול משתנה, יש לחשב מחדש את הנפח הדרוש לכל דילול כדי להבטיח נפח מספיק עבור 1) קשירה של rAb בכל באר, 2) זריעת הדילול הבא, ו-3) ציטוט פתרון סטנדרטי rAb לספירת גמא כדי למדוד את הרדיואקטיביות של סך ה-rAb שנוסף לכל באר.
   1. חשב את נפח ה-rAb הדרוש כדי ליצור תמיסה של 1.2 מ"ל של הריכוז הראשון (תווית כ-A).
   2. הוסף 800 μL של מאגר קשירה לצינורות microcentrifuge המסומנים B, C, D, ... ל-ח'. הוסף 1.2 מ"ל פחות הנפח המחושב בשלב 4.2.1 של מאגר קשירה לצינור microcentrifuge שכותרתו A.
   3. הוסף את נפח ה- rAb המלאי המחושב ב- 4.2.1 לצינור A. מערבולת בעדינות כדי לערבב ולאחר מכן להסתובב למטה באמצעות microcentrifuge מיני כדי לאסוף את כל הנוזלים בתחתית הצינור.
   4. הוסף 400 μL מצינור A לצינור B. מערבולת כדי לערבב ולאחר מכן להסתובב למטה באמצעות מיני microcentrifuge. חזור על הוספה מ - B ל - C, C ל - D, ..., G ל- H.
3. הוסף 100 μL לכל באר של כל דילול לשלוש בארות משותקות עם אנטיגן ושלוש בארות חסומות עם BSA בלבד. לדוגמה, הוסף דילול A לבארות A1-A3 (אנטיגן) ו- A4-A6 (BSA).
4. הוסף 100 μL של כל דילול לצינורות microcentrifuge המסומנים A std - H std. שמור צינורות אלה כתקני rAb שיש לבדוק במונה הגמא.
5. דגירה של הצלחת למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם נדנדה עדינה.

5. לשטוף צלחות ולבחון רדיואקטיביות

1. סימון צינורות microcentrifuge עבור כל באר (A1 עד A6, B1 עד B6 ... דרך H1-H6). השתמש בשני סמנים צבעוניים שונים כדי לקודד דגימות צבע אם תרצה - אחד עבור בארות מצופות אנטיגן ואחד עבור בארות עם BSA בלבד.
2. שאפו את ה-rAb מכל באר באמצעות שאיפת ואקום.
3. באמצעות פיפטה רב-ערוצית, הוסיפו 300 μL של מאגר כביסה לכל באר. שאפו את מאגר הכביסה. חזור על הכביסה בסך הכל חמש פעמים.
4. מפרקים את הבארות לצינורות המיקרו-צנטריפוג' המתאימים.
5. ספרו את הרדיואקטיביות בצינורות באמצעות מונה גמא. ספרו תחילה את הצינורות עם האנטיגן (H1, H2, H3 עד A1, A2, A3), ולאחר מכן את אלה עם BSA בלבד (H4, H5, H6 עד A4, A5, A6). כדי למזער את ההפרעות, ספרו בנפרד את התקנים עבור כל דילול (H std עד A std) בזמן אחר.

6. ניתוח נתונים

הערה: הקבצים המשלימים מכילים תבניות מתאימות של גיליון אלקטרוני וניתוח סטטיסטי לניתוח והתוויה של הנתונים.

1. בגיליון אלקטרוני, חשב את האיגוד הכולל, הספציפי והלא ספציפי עבור כל דגימה (ראה את תבנית הגיליון האלקטרוני המצורפת כקובץ משלים).
   1. חשב "פעילות מאוגדת" כספירת לדקה (CPM) של המדגם (המתקבלת ממונה הגמא) חלקי CPM של התקן המתאים. חשב את "% מאוגד" כפעילות מאוגדת פעמים 100.
   2. חישוב "סה"כ מאוגד, מול/L" על ידי הכפלת "% מאוגד" בריכוז (mol/L) של rAb שנוסף. חשב "סה"כ מאוגד, מול" על ידי הכפלת "סה"כ מאוגד, מול/ל'" עם נפח rAb שנוסף בליטרים (0.0001 ליטר).
   3. חשב "איגוד ספציפי, מול" על ידי חיסור "סה"כ מאוגד, מול" של דילול BSA מתוך דילול האנטיגן כך ש- A1 מזדווג עם A4, A2 עם A5, A3 עם A6, B1 עם B4 וכו '.
   4. חשב "איגוד לא ספציפי, מול" על ידי חיסור "קשירה ספציפית, מול" מתוך "סך כל הכריכה, מול" עבור כל באר.
2. בתוכנת האנליזה הסטטיסטית, שרטט את הריכוז של rAb שנוסף (nmol/L) על ציר x לעומת קשירה (מול) על ציר ה-y. צור קבוצות נפרדות כדי להתוות במשולש את הכריכה הכוללת, את הכריכה הספציפית ואת הכריכה הלא ספציפית. בצע ניתוח התאמה לא ליניארי על-ידי בחירת הפרמטרים הבאים בתוכנה שבה נעשה שימוש (טבלת חומרים; ראה את תבנית הניתוח הסטטיסטי המצורף כקובץ משלים).
   1. בחר ניתוח חדש. תחת ניתוחי XY, בחר רגרסיה לא ליניארית (התאמה עקומה). ודא שכל הנתונים נבחרים תחת נתח אילו ערכות נתונים? ולאחר מכן בחר אישור.
   2. בכרטיסיה מודל , תחת איגוד - רוויה, בחר אתר אחד - איגוד ספציפי. בכרטיסיה ביטחון עצמי , בחר זהה התאמות 'מעורפלות'. השאר את כל הפרמטרים האחרים כברירת מחדל ובחר אישור.
      הערה: פעולה זו תחשב את K_D ו- Bmax עבור הכריכה הכוללת, הספציפית והלא ספציפית. ה-K_D של הכריכה הספציפית הוא K_D ב-nmol/L של ה-rAb הקשור לאנטיגן.

תוצאות

שיטה זו מחשבת זיקה מחייבת (K_D) עבור rAb בהתבסס על מבחן איגוד הרוויה שבו נוספו ריכוזים שונים של rAb לכמות קבועה של אנטיגן משותק. עקומת הקשירה צריכה לעקוב אחר הצמיחה הלוגריתמית שבה היא תלולה בתחילה ואז רמה כאשר האנטיגן רווי. כדי להבטיח שה-K_D שנקבע מדויק, הריכוזים של rAb חייבים להיות גבוה?...

Discussion

כחלק מהפיתוח של rAbs, חשוב לוודא ש-rAb נקשר באופן ספציפי למטרה שלו עם זיקה מחייבת גבוהה. קביעת זיקה מחייבת יכולה ליידע אם האימונו-פעילות החיסונית של ה-rAb מושפעת משילוב רדיו באמצעות בדיקת הרדיוליגנד והרוויה באמצעות אנטיגן משותק. קביעת איגוד rAb ל- BSA יכולה לשמש לכימות קשירה לא ספציפית כדי למדוד קש...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9647
Gamma Counter	Hidex	Hidex Automatic Gamma Counter
GraphPad Prism Software	GraphPad		version 9.2; used for statistical analyses in this study
Immuno Breakable MaxiSorp 96-well plates	Thermo Scientific	473768
Microplate Sealing Tape	Corning	4612
Microsoft Excel	Microsoft
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190144
Sodium Bicarbonate	JT Baker	3506-01
Sodium Carbonate	Sigma-Aldrich	S7795
Tween-20	Sigma-Aldrich	P7949