Определение сродства связывания (KD) радиомеченных антител к обездвиженным антигенам

Резюме

Здесь описан способ определения сродства связывания (K_D) радиомеченных антител к обездвиженным антигенам. K_D - константа равновесной диссоциации, которая может быть определена из эксперимента по связыванию насыщения путем измерения общего, специфического и неспецифического связывания радиомеченого антитела в различных концентрациях с его антигеном.

Аннотация

Определение сродства связывания (K_D) является важным аспектом характеристики радиомеченных антител (rAb). Как правило, сродство связывания представлено константой диссоциации равновесия, K_D, и может быть рассчитано как концентрация антитела, при которой половина сайтов связывания антител занята в равновесии. Этот метод может быть обобщен на любое радиомаркированное антитело или другие белковые и пептидные каркасы. В отличие от клеточных методов, выбор иммобилизованных антигенов особенно полезен для подтверждения сродства связывания после длительного хранения антител, различения связывающего сродства фрагмента антигенсвязывающей области (Fab) в биспецифических конструкциях антител и определения того, есть ли изменчивость экспрессии антигена между различными клеточными линиями. Этот метод включает иммобилизацию фиксированного количества антигена в определенные скважины на бьющейся 96-луночной пластине. Затем неспецифическое связывание было заблокировано во всех скважинах бычьим сывороточным альбумином (BSA). Впоследствии rAb добавляли в градиент концентрации ко всем скважинам. Был выбран диапазон концентраций, позволяющих rAb достичь насыщения, т.е. концентрации антитела, при которой все антигены непрерывно связаны rAb. В назначенных лунках без иммобилизованного антигена может быть определено неспецифическое связывание rAb. Путем вычитания неспецифического связывания из общего связывания в лунках с иммобилизованным антигеном можно определить специфическое связывание rAb с антигеном. K_D rAb был рассчитан на основе полученной кривой связывания насыщения. В качестве примера, сродство связывания определяли с использованием радиомаркированного амивантамаба, биспецифического антитела к рецептору эпидермального фактора роста (EGFR) и белкам цитоплазматического мезенхимально-эпителиального перехода (cMET).

Введение

Радиомеченные антитела (rAb) имеют множество применений в медицине. В то время как большинство из них используются в онкологии в качестве визуальных и терапевтических агентов, существуют приложения визуализации для воспаления, связанного с ревматологией, кардиологии и неврологии¹. Визуализация rAbs обладает высокой чувствительностью к обнаружению поражений и может помочь в выборе пациента для лечения 2,3,4,5. Они также используются для терапии из-за их специфичности для соответствующих антигенов. В стратегии, известно....

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Графическое представление протокола приведено на рисунке 2 .

Рисунок 2: Схема протокола. Метки рядов и столбцов указаны в качестве руководства для установки бьющейся плиты из 96 скважин. Ожидаемое связывание показано в примере хорошо для антигена и BSA. Изогнутая стрелка обозначает rAb, который, как ожидается, будет вымыт из скважин только с BSA. Эта фигура была создана с помощью BioRender....

Результаты

Этот метод рассчитывает сродство связывания (K_D) для rAb на основе анализа связывания насыщения, где различные концентрации rAb были добавлены к фиксированному количеству иммобилизованного антигена. Кривая связывания должна следовать за логарифмическим ростом, где он изначально кр.......

Обсуждение

В рамках разработки rAbs важно обеспечить, чтобы rAb связывался конкретно со своей целью с высоким сродством связывания. Определение сродства связывания может информировать о том, влияет ли иммунореактивность rAb на радиоконъюгацию через анализ насыщения радиолигандами с использованием ?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9647
Gamma Counter	Hidex	Hidex Automatic Gamma Counter
GraphPad Prism Software	GraphPad		version 9.2; used for statistical analyses in this study
Immuno Breakable MaxiSorp 96-well plates	Thermo Scientific	473768
Microplate Sealing Tape	Corning	4612
Microsoft Excel	Microsoft
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190144
Sodium Bicarbonate	JT Baker	3506-01
Sodium Carbonate	Sigma-Aldrich	S7795
Tween-20	Sigma-Aldrich	P7949