Determinando afinidade de ligação (KD) de anticorpos radiolabelados para antígenos imobilizados

Resumo

Aqui, um método é descrito para determinar a afinidade vinculante (K_D) de anticorpos radiolabelados a antígenos imobilizados. K_D é a constante de dissociação de equilíbrio que pode ser determinada a partir de um experimento de ligação de saturação medindo a ligação total, específica e inespecífica de um anticorpo radiolabeled em várias concentrações ao seu antígeno.

Resumo

Determinar a afinidade vinculante (K_D) é um aspecto importante da caracterização de anticorpos radiolabeled (rAb). Normalmente, a afinidade vinculante é representada pela constante de dissociação de equilíbrio, K_D, e pode ser calculada como a concentração de anticorpos em que metade dos locais de ligação de anticorpos são ocupados em equilíbrio. Este método pode ser generalizado para qualquer anticorpo radiolabeled ou outros andaimes de proteína e peptídeos. Em contraste com os métodos baseados em células, a escolha de antígenos imobilizados é particularmente útil para validar afinidades de ligação após o armazenamento de anticorpos a longo prazo, distinguindo afinidades vinculantes de braços da região de ligação de antígenos fragmentados (Fab) em construções de anticorpos bisespecíficos, e determinando se há variabilidade na expressão de antígeno entre diferentes linhas celulares. Este método envolve a imobilização de uma quantidade fixa de antígeno para poços especificados em uma placa de 96 poços quebráveis. Em seguida, a ligação inespecífica foi bloqueada em todos os poços com albumina de soro bovino (BSA). Posteriormente, a RAB foi adicionada em um gradiente de concentração a todos os poços. Uma série de concentrações foi escolhida para permitir que a RAB alcançasse a saturação, ou seja, uma concentração de anticorpos em que todos os antígenos são continuamente ligados pela RAB. Em poços designados sem antígeno imobilizado, pode ser determinada ligação inespecífica da RAB. Subtraindo a vinculação inespecífica da ligação total nos poços com antígeno imobilizado, pode-se determinar a ligação específica da RAB ao antígeno. O K_D do rAb foi calculado a partir da curva de ligação de saturação resultante. Como exemplo, a afinidade vinculante foi determinada usando proteínas de amivantamab radiolabeled, um anticorpo bispecífico para receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR) e proteínas de transição mesenquimal-epitelial citoplasmática (cMET).

Introdução

Anticorpos radiolabeled (rAb) têm uma variedade de usos na medicina. Enquanto a maioria é utilizada na oncologia como agentes de imagem e terapêutica, existem aplicações de imagem para inflamação, cardiologia e neurologia^relacionadas à reumatologia 1. As imagens têm alta sensibilidade para detectar lesões e têm potencial para auxiliar na seleção do paciente para tratamento 2,3,4,5. Eles também são usados para terapia devido à sua especificidade para seus respectivos antígenos. Em uma estratégia conhecida como teranostics, o mesmo rAb é usado tanto para imagem quanto para tratamento⁶.

Idealmente, o anticorpo escolhido para radiolabeling é um já comprovado ter alta afinidade vinculante e especificidade usando métodos não radiolabeled. A rotulagem radiolaclante de anticorpos pode ser alcançada através de modificação química direta de anticorpos com um radionuclídeo que forma ligações covalentes estáveis (por exemplo, radioiodina), ou indiretamente através de conjugação com queladores que posteriormente coordenam para radiometals ^7,8. A rotulagem direta, como com radioiodina, modifica especificamente os resíduos de tyrosina e histidina no anticorpo. Se esses resíduos são importantes para a ligação de antígeno, então essa radioconjugação alteraria a afinidade de ligação. Por outro lado, existem vários protocolos estabelecidos para a conjugação e radiolabelação indireta de anticorpos. Por exemplo, um quedoro comum usado para ligar zircônio-89 (⁸⁹Zr) para imagem PET de anticorpos é o p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamina (DFO), que é conjugado aleatoriamente para resíduos de lise de lysina do anticorpo ^9,10. Se houver resíduos de lise na região de ligação de antígenos, a conjugação nesses locais pode dificultar a ligação de antígeno e, portanto, comprometer a ligação anticorpo-antígeno. Assim, os diferentes métodos de radioconjugação utilizados para radiolabeltação indireta ou direta de anticorpos podem potencialmente afetar a imunoreatividade, definida como a capacidade do radioconjugado de anticorpos de se ligar ao seu antígeno ^7,11. Métodos de conjugação específicos do local podem contornar essa limitação, mas essas técnicas requerem engenharia de anticorpos para incorporar resíduos adicionais de cisteína ou experiência em reações enzimáticas em resíduos de carboidratos 12,13,14,15,16. Uma vez que um anticorpo é radiola rotulado, é importante testar se a imunoreatividade é mantida como parte da caracterização da rAb. Uma maneira de medir a imunoreatividade é determinar a afinidade vinculante da RAB.

O objetivo deste protocolo é descrever um processo para determinar a afinidade vinculante para rAbs usando um ensaio de radioligidade e saturação estabelecido para quantificar a ligação rAb-antígeno. A tendência de vinculação está descrita na Figura 1. A quantidade de antígeno ligado aumentará à medida que mais rAb for adicionado a uma quantidade fixa de antígeno imobilizado. Uma vez que todos os locais de ligação de antígenos estejam saturados, um platô será atingido, e adicionar mais rAbs não terá efeito sobre a quantidade de antígeno ligado. Neste modelo, a constante de dissociação de equilíbrio (K_D) é a concentração de anticorpos que ocupa metade dos receptores de antígeno¹⁷. O K_D representa o quão bem um anticorpo se liga ao seu alvo com um K_D inferior correspondente a uma maior afinidade de ligação. Foi relatado anteriormente que um rAb ideal deveria ter um K_D de 1 nanomolar ou menos¹⁸. No entanto, os rAbs mais recentes foram desenvolvidos com K_D na faixa de nanomolar baixo, e são considerados adequados para aplicações de imagem não invasivas 19,20,21,22. Outro parâmetro que pode ser determinado no ensaio de radiolig e saturação de rAbs é b_max, que corresponde à quantidade máxima de ligação de antígeno. B_max pode ser usado para calcular o número de moléculas de antígeno, se necessário.

Figura 1: Curva de ligação de saturação representativa. A porcentagem de antígeno ligado é plotada contra o aumento das concentrações de anticorpos adicionados a uma quantidade fixa de antígeno. Pop-outs demonstram vinculação em vários pontos. A concentração e a ligação correspondentes a K_D e B_max, respectivamente, são mostradas. Este número foi criado com BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Este ensaio é particularmente importante para construções de anticorpos bisespecíficos radiolabeled para determinar o K_D para cada fragmento braço de região de ligação de antígeno (Fab) do anticorpo bisespecífico radiolabeled que se liga com seus respectivos antígenos. Este protocolo pode ser usado para determinar o K_D de cada braço Fab separadamente em antígenos imobilizados para caracterizar independentemente se a afinidade vinculante de cada braço Fab para seu respectivo antígeno foi afetada após a radioconjugação. Este protocolo é demonstrado pelo uso de amivantamab radiolabeled, um anticorpo bispecífico para receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR) e proteínas de transição mesenquimal-epitelial citoplasmática (cMET)¹⁹. Anticorpos de braço único radiolabeled, onde um braço Fab se liga ao EGFR (α-EGFR) ou ao cMET (α-cMET) e o outro braço Fab é um controle de isótipo, também foram usados como exemplos¹⁹. Este protocolo também é apropriado para qualquer anticorpo radiolabeled com um antígeno conhecido que pode ser imobilizado. Neste protocolo, uma série de diluição da rAb é adicionada a uma quantidade fixa de antígeno imobilizado em poços designados específicos para cada braço Fab da rAb. O rAb também é adicionado a poços que só foram bloqueados com albumina de soro bovino (BSA), sem antígeno, para determinar a vinculação inespecífica. Para determinar a vinculação específica, a ligação inespecífica ao antígeno imobilizado é subtraída da vinculação total da RAB. A curva de ligação de saturação resultante é então usada para determinar K_D, conforme descrito acima.

Uma vantagem deste método é a maior reprodutibilidade ao usar antígenos purificados em comparação com o uso de linhas celulares como fonte de antígenos, dado que os níveis de expressão de antígeno poderiam ser afetados durante a cultura celular e que diferentes linhas celulares têm níveis variáveis de expressão de antígeno. No caso de anticorpos bisespecíficos radiolabeled, linhas celulares que só expressam um dos antígenos sem o outro podem não estar disponíveis, o que tornaria muito desafiadora a caracterização da afinidade vinculante dos braços fab individuais. Notavelmente, a principal vantagem do método de ensaio radiolig e saturação sobre métodos não radiolabeled é a caracterização específica da afinidade vinculante do RAB sem a contribuição da fração não conjugada da RAB. Para o melhor do conhecimento dos autores, atualmente não há técnicas de purificação para separar o RAB de seu anticorpo não julgado pai. Dado o tamanho relativamente pequeno do quequeador e radionuclídeo, sua contribuição para o peso molecular geral da RAB é insignificante na cromatografia de exclusão de tamanho. Assim, o produto gerado a partir de qualquer técnica de radiolabeling é quase sempre uma mistura do rAb e seu anticorpo não julgado pai. Caracterizar afinidade vinculante usando o ensaio de saturação radiolabeled garante que o produto que está sendo testado seja apenas o rAb.

Protocolo

NOTA: Consulte a Figura 2 para uma representação gráfica do protocolo.

Figura 2: Esquema do protocolo. Os rótulos de linha e coluna são indicados como um guia para configurar a placa de 96 poços quebráveis. A ligação antecipada é mostrada em um exemplo bem para o antígeno e o BSA. A seta curva designa o rAb que deverá ser lavado de poços apenas com BSA. Este número foi criado com BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Preparação do buffer

1. Prepare 50 mL de tampão de imobilização (solução aquosa de 50 mM Na₂CO₃; pH = 9,0).
   1. Pesar 191 mg de NaHCO₃ e 23,9 mgs de Na₂CO₃ em papel de pesagem e transferir para um tubo cônico de 50 mL. Adicione 40 mL de 18 MΩ de água e vórtice para dissolver. Ajuste o pH para 9,0 se necessário antes de levar o volume total para 50 mL com água de 18 MΩ.
2. Prepare aproximadamente 200 mL de tampão de lavagem (salina tampão-fosfato tampão (PBS) contendo 0,05% Tween-20) adicionando 200 mL de PBS e depois 100 μL de Tween-20 a uma garrafa de 250 mL.
3. Prepare 50 mL de tampão de ligação (PBS contendo 0,05% Tween-20 e 0,1% de albumina de soro bovino (BSA)).
   1. Pese 50 mg de BSA no papel de pesagem e transfira para um tubo cônico de 50 mL. Adicione 50 mL de PBS e depois 25 μL de Tween-20 ao tubo. Vórtice suavemente para misturar.
4. Prepare 50 mL de tampão de bloqueio (3% BSA em PBS).
   1. Pese 1,5 g de BSA no papel de pesagem e transfira para um tubo cônico de 50 mL. Adicione 50 mL de PBS e vórtice suavemente para misturar.
      NOTA: Recomenda-se que todos os buffers sejam armazenados por até 1 semana a 4 °C para melhores resultados.

2. Imobilização de antígeno

1. Diluir o antígeno no tampão de imobilização para atingir uma concentração de 5 μg/mL.
2. Adicione 100 μL por poço de antígeno ao fundo de 24 poços de uma placa de fundo plana de 96 poços em uma matriz 8 x 3 (colunas 1-3 para as linhas A-H). Cubra a placa com fita de vedação.
   NOTA: Certifique-se de que a superfície do poço tenha sido tratada para maximizar a adsorção de domínios hidrofóbicos e hidrofílicos mistos. Estas placas pré-tratadas estão disponíveis comercialmente.
3. Incubar a 4 °C durante a noite.
4. No dia seguinte, lave a placa 3x com tampão de lavagem.
   1. Inverta a placa rapidamente na pia para descartar o líquido e bata a placa em uma pilha de toalhas de papel para remover o excesso de líquido.
   2. Usando uma pipeta multicanal, adicione 300 μL por poço de tampão de lavagem a poços que contenham o antígeno. Remova o líquido conforme descrito em 2.4.1. Repita a etapa de lavagem um total de três vezes.

3. Bloqueio de locais não específicos com BSA

1. Usando uma pipeta multicanal, adicione 300 μL por poço de tampão de bloqueio aos 24 poços revestidos de antígeno e 24 poços vazios da placa de 96 poços (colunas 1-6 para as linhas A-H).
2. Incubar a placa por 1h em temperatura ambiente.
3. Lave a placa com 300 μL por poço de tampão de lavagem um total de três vezes. Consulte a etapa 2.4 para obter uma descrição detalhada da lavagem da placa.
    

4. Diluições seriais e adição da solução rAb

ATENÇÃO: As seguintes etapas envolvem radioatividade. As etapas só devem ser realizadas por aqueles com treinamento de segurança de radiação. Os pesquisadores devem dobrar a luva e executar etapas com blindagem adequada.

1. Sintetizar o RAB sob investigação usando o método de escolha. Os rAbs usados como exemplo foram sintetizados como descrito anteriormente¹⁹.
   NOTA: Este protocolo se concentra na caracterização de um rAb uma vez rotulado por rádio.
2. Faça diluições de série de 8 x 3 vezes (designadas para as linhas A-H na placa) do rAb no buffer de ligação.
   NOTA: As concentrações das diluições seriais variam para cada rAb. Os detalhes são discutidos na seção Discussão. Se o fator de diluição mudar, o volume necessário para cada diluição deve ser recalculado para garantir volume suficiente para 1) vinculação do rAb em cada poço, 2) semeando a seguinte diluição e 3) aliquotando uma solução padrão rAb para contagem de gama para medir a radioatividade do rAb total adicionado a cada poço.
   1. Calcule o volume de estoque rAb necessário para fazer uma solução de 1,2 mL da primeira concentração (rótulo como A).
   2. Adicione 800 μL de tampão de ligação aos tubos de microcentrifuuge rotulados B, C, D, ... para H. Adicione 1,2 mL menos o volume calculado na etapa 4.2.1 do buffer de ligação a um tubo de microcentrífuga rotulado A.
   3. Adicione o volume de rAb calculado em 4.2.1 para o tubo A. Vórtice suavemente para misturar e, em seguida, girar para baixo usando um mini microcentrifuuge para coletar todo o líquido na parte inferior do tubo.
   4. Adicione 400 μL do tubo A ao tubo B. Vórtice para misturar e, em seguida, girar para baixo usando um mini microcentrifuge. Repita a adição de B a C, C a D, ..., G a H.
3. Adicione 100 μL por poço de cada diluição a três poços imobilizados com antígeno e três poços bloqueados apenas com BSA. Por exemplo, adicione diluição A aos poços A1-A3 (antígeno) e A4-A6 (BSA).
4. Adicione 100 μL de cada diluição aos tubos de microcentrifusagem rotulados de DST - H std. Guarde esses tubos como padrões rAb a serem testados no contador gama.
5. Incubar a placa por 1h a 37 °C com balanço suave.

5. Lavar placas e avaliar radioatividade

1. Rotular tubos de microcentrifuuge para cada poço (A1 a A6, B1 a B6 ... através de H1-H6). Use dois marcadores coloridos diferentes para amostras de código de cor, se desejar-um para poços revestidos com antígeno e um para poços apenas com BSA.
2. Aspire o rAb de cada poço usando um aspirador de vácuo.
3. Usando uma pipeta multicanal, adicione 300 μL de tampão de lavagem a cada poço. Aspire o tampão de lavagem. Repita a lavagem um total de cinco vezes.
4. Desmonte os poços nos tubos de microcentrifuuagem apropriados.
5. Conte a radioatividade nos tubos usando um contador gama. Conte primeiro os tubos com o antígeno (H1, H2, H3 a A1, A2, A3), e depois aqueles com BSA apenas (H4, H5, H6 a A4, A5, A6). Para minimizar a interferência, conte separadamente as normas para cada diluição (H std to A std) em um momento diferente.

6. Análise de dados

NOTA: Os arquivos suplementares contêm modelos correspondentes de planilha e análise estatística para análise e plotagem dos dados.

1. Em uma planilha, calcule a vinculação total, específica e não específica para cada amostra (consulte o modelo de planilha anexado como um arquivo suplementar).
   1. Calcule "Atividade Vinculada" como contagem por minuto (CPM) da amostra (obtida a partir do contador gama) dividida pelo CPM da norma apropriada. Calcule "% Vinculado" como Atividade Vinculada vezes 100.
   2. Calcule "Total Bound, mol/L" multiplicando "% Vinculado" com a concentração (mol/L) da rAb adicionada. Calcule "Total Bound, mol" multiplicando "Total Bound, mol/L" com o volume de rAb adicionado em litros (0,0001 L).
   3. Calcule "Ligação específica, mol" subtraindo "Total Bound, mol" das diluições BSA das diluições de antígeno, de modo que A1 emparelhe com A4, A2 com A5, A3 com A6, B1 com B4, etc.
   4. Calcule "Vinculação inespecífica, mol" subtraindo "Ligação específica, mol" de "Total Binding, mol" para cada poço.
2. No software de plotagem de análise estatística, plote a concentração de rAb adicionada (nmol/L) no eixo x versus vinculação (mol) no eixo y. Crie grupos separados para traçar em vinculação total triplicada, vinculação específica e vinculação inespecífica. Realize uma análise de ajuste não linear selecionando os seguintes parâmetros no software utilizado (Tabela de Materiais; consulte o modelo de análise estatística anexado como um arquivo suplementar).
   1. Selecione Nova Análise. Em análises XY, selecione regressão não linear (ajuste de curva). Certifique-se de que todos os dados estão selecionados em Analisar quais conjuntos de dados e, em seguida, selecione Ok.
   2. Na guia Modelo , em Vinculação - Saturação, selecione Um site - Vinculação específica. Na guia Confiança , selecione Identificar ajustes 'ambíguos'. Deixe todos os outros parâmetros como padrão e selecione Ok.
      NOTA: Isso calculará o K_D e o Bmax para a ligação total, específica e não específica. O K_D da ligação específica é o K_D em nmol/L do rAb ligado ao antígeno.

Resultados

Este método calcula a afinidade de ligação (K_D) para um rAb com base no ensaio de ligação de saturação onde diferentes concentrações de rAb foram adicionadas a uma quantidade fixa de antígeno imobilizado. A curva de ligação deve seguir o crescimento logarítmico, onde é inicialmente íngreme e, em seguida, planaltos como o antígeno está saturado. Para garantir que o K_D determinado seja preciso, as concentrações de rAb devem ser altas o suficiente para alcançar a saturação. Para e...

Discussão

Como parte do desenvolvimento de rAbs, é importante garantir que um rAb se ligue especificamente ao seu alvo com alta afinidade de ligação. A determinação da afinidade vinculante pode informar se a imunoreatividade da RAB é afetada pela radioconjugação através do ensaio de radioligidade e saturação usando antígeno imobilizado. A determinação da vinculação rAb ao BSA pode ser usada para quantificar a vinculação inespecífica para medir a vinculação específica ao antígeno imobilizado com mais precisã...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9647
Gamma Counter	Hidex	Hidex Automatic Gamma Counter
GraphPad Prism Software	GraphPad		version 9.2; used for statistical analyses in this study
Immuno Breakable MaxiSorp 96-well plates	Thermo Scientific	473768
Microplate Sealing Tape	Corning	4612
Microsoft Excel	Microsoft
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190144
Sodium Bicarbonate	JT Baker	3506-01
Sodium Carbonate	Sigma-Aldrich	S7795
Tween-20	Sigma-Aldrich	P7949