Radyoaktif Etiketli Antikorların İmmobilize Antijenlere Bağlanma Afinitesinin (KD) Belirlenmesi

Özet

Burada, radyoaktif işaretli antikorların immobilize antijenlere bağlanma afinitesini (K_D) belirlemek için bir yöntem açıklanmaktadır. K_D , radyoaktif etiketli bir antikorun antijenine çeşitli konsantrasyonlarda toplam, spesifik ve spesifik olmayan bağlanmasını ölçerek bir doygunluk bağlama deneyinden belirlenebilen denge ayrışma sabitidir.

Özet

Bağlanma afinitesinin (K_D) belirlenmesi, radyoaktif olarak etiketlenmiş antikorların (rAb) karakterizasyonunun önemli bir yönüdür. Tipik olarak, bağlanma afinitesi denge ayrışma sabiti K_D ile temsil edilir ve antikor bağlanma bölgelerinin yarısının dengede işgal edildiği antikor konsantrasyonu olarak hesaplanabilir. Bu yöntem, radyoaktif olarak etiketlenmiş herhangi bir antikor veya diğer protein ve peptit iskelelerine genelleştirilebilir. Hücre bazlı yöntemlerin aksine, immobilize antijenlerin seçimi, antikorların uzun süreli depolanmasından sonra bağlanma afinitelerini doğrulamak, bispesifik antikor yapılarındaki fragman antijen bağlayıcı bölge (Fab) kollarının bağlanma afinitelerini ayırt etmek ve farklı hücre hatları arasında antijen ekspresyonunda değişkenlik olup olmadığını belirlemek için özellikle yararlıdır. Bu yöntem, kırılabilir 96 delikli bir plaka üzerinde belirtilen kuyucuklara sabit miktarda antijenin hareketsiz hale getirilmesini içerir. Daha sonra sığır serum albümini (BSA) ile tüm kuyucuklarda nonspesifik bağlanma engellendi. Daha sonra, rAb tüm kuyucuklara bir konsantrasyon gradyanında eklendi. rAb'nin doygunluğa ulaşmasına izin vermek için bir dizi konsantrasyon seçildi, yani tüm antijenlerin sürekli olarak rAb tarafından bağlandığı bir antikor konsantrasyonu. İmmobilize antijeni olmayan belirlenmiş kuyularda, rAb'nin spesifik olmayan bağlanması belirlenebilir. İmmobilize antijenli kuyucuklardaki toplam bağlanmadan spesifik olmayan bağlanma çıkarılarak, rAb'nin antijene spesifik bağlanması belirlenebilir. rAb'nin K_D'si , ortaya çıkan doygunluk bağlama eğrisinden hesaplandı. Örnek olarak, bağlanma afinitesi, epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) ve sitoplazmik mezenkimal epitel geçişi (cMET) proteinleri için bispesifik bir antikor olan radyoişaretli amivantamab kullanılarak belirlendi.

Giriş

Radyoaktif olarak etiketlenmiş antikorların (rAb) tıpta çeşitli kullanımları vardır. Onkolojide çoğunluğu görüntüleme ve terapötik ajanlar olarak kullanılırken, romatolojiye bağlı inflamasyon, kardiyoloji ve nöroloji için görüntüleme uygulamaları^{vardır 1}. Görüntüleme rAbs, lezyonları saptamak için yüksek duyarlılığa sahiptir ve tedavi için hasta seçiminde yardımcı olma potansiyeline sahiptir 2,3,4,5. Ayrıca kendi antijenleri için özgüllükleri nedeniyle tedavi için de kullanılırlar. Teranostik olarak bilinen bir stratejide, aynı rAb hem görüntüleme hem de tedavi için kullanılır⁶.

İdeal olarak, radyoetiketleme için seçilen antikor, radyo-etiketli olmayan yöntemler kullanılarak yüksek bağlanma afinitesine ve özgüllüğüne sahip olduğu zaten kanıtlanmış bir antikordur. Antikorların radyo-etiketlenmesi, antikorların kararlı kovalent bağlar (örneğin radyoiyot) oluşturan bir radyonüklid ile doğrudan kimyasal modifikasyonu yoluyla veya dolaylı olarak daha sonra radyometallere koordine olan şelatörlerle konjugasyon yoluyla sağlanabilir ^7,8. Radyoiyot gibi doğrudan radyoetiketleme, antikor üzerindeki tirozin ve histidin kalıntılarını spesifik olarak değiştirir. Bu kalıntılar antijen bağlanması için önemliyse, bu radyokonjugasyon bağlanma afinitesini değiştirecektir. Tersine, antikorların konjugasyonu ve dolaylı radyo-etiketlenmesi için birden fazla yerleşik protokol vardır. Örneğin, antikorların PET görüntülemesi için zirkonyum-89'u (⁸⁹Zr) bağlamak için kullanılan yaygın bir şelatör, ^9,10 antikorunun lizin kalıntılarına rastgele konjuge edilen p-izotiyosiyanatobenzil-desferiksamin (DFO) 'dir. Antijen bağlayıcı bölgede lizin kalıntıları varsa, bu bölgelerdeki konjugasyon sterik olarak antijen bağlanmasını engelleyebilir ve bu nedenle antikor-antijen bağlanmasını tehlikeye atabilir. Bu nedenle, antikorların dolaylı veya doğrudan radyoetiketlenmesi için kullanılan farklı radyokonjugasyon yöntemleri, antikor radyokonjugatının antijenine bağlanma yeteneği olarak tanımlanan immünoreaktiviteyi potansiyel olarak etkileyebilir ^7,11. Bölgeye özgü konjugasyon yöntemleri bu sınırlamayı aşabilir, ancak bu teknikler ek sistein kalıntılarını veya karbonhidrat kalıntıları üzerindeki enzimatik reaksiyonlarda uzmanlığı 12,13,14,15,16 dahil etmek için antikor mühendisliği gerektirir. Bir antikor radyo-etiketlendikten sonra, rAb'nin karakterizasyonunun bir parçası olarak immünoreaktivitenin korunup korunmadığını test etmek önemlidir. İmmünoreaktiviteyi ölçmenin bir yolu, rAb'nin bağlanma afinitesini belirlemektir.

Bu protokolün amacı, rAb-antijen bağlanmasını ölçmek için kurulmuş bir radyoligand doygunluk testi kullanarak rAbs için bağlanma afinitesini belirleme sürecini tanımlamaktır. Bağlanma eğilimi Şekil 1'de özetlenmiştir. Sabit miktarda immobilize antijene daha fazla rAb eklendikçe antijene bağlı antijen miktarı artacaktır. Tüm antijen bağlanma bölgeleri doygun hale getirildikten sonra, bir platoya ulaşılacak ve daha fazla rAbs eklenmesinin bağlı antijen miktarı üzerinde hiçbir etkisi olmayacaktır. Bu modelde, denge ayrışma sabiti (K_D), antijen reseptörlerinin yarısını kaplayan antikor konsantrasyonudur¹⁷. K_D, bir antikorun hedefine ne kadar iyi bağlandığını ve daha yüksek bir bağlanma afinitesine karşılık gelen daha düşük bir K_D ile temsil eder. Daha önce ideal bir rAb'nin 1 nanomolar veya daha az¹⁸ K_D'ye sahip olması gerektiği bildirilmişti. Bununla birlikte, düşük nanomolar aralıkta K_D ile daha yeni rAb'ler geliştirilmiştir ve noninvaziv görüntüleme uygulamaları için uygun olduğu düşünülmektedir 19,20,21,22. rAbs'nin radyoligand doygunluk testinde belirlenebilen bir diğer parametre, maksimum antijen bağlanma miktarına karşılık gelen B_max'tır. B_max, gerekirse antijen moleküllerinin sayısını hesaplamak için kullanılabilir.

Resim 1: Temsili doygunluk bağlama eğrisi. Antijene bağlı yüzdesi, sabit miktarda antijene eklenen artan antikor konsantrasyonlarına karşı çizilir. Pop-out'lar çeşitli noktalarda bağlanmayı gösterir. Sırasıyla K_D ve B_max'e karşılık gelen konsantrasyon ve bağlanma gösterilmiştir. Bu figür BioRender.com ile yaratılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu tahlil, radyoaktif etiketli bispesifik antikor yapılarının, radyoaktif işaretli bispesifik antikorun kendi antijenlerine bağlanan her bir fragman antijen bağlayıcı bölgesi (Fab) için K_D'yi belirlemesi için özellikle önemlidir. Bu protokol, her bir Fab kolunun K_D'sini immobilize antijenler üzerinde ayrı ayrı belirlemek için kullanılabilir ve radyokonjugasyondan sonra her bir Fab kolunun kendi antijenine bağlanma afinitesinin etkilenip etkilenmediğini bağımsız olarak karakterize eder. Bu protokol, epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) ve sitoplazmik mezenkimal epitelyal geçiş (cMET) proteinleri için bispesifik bir antikor olan radyoaktif işaretli amivantamabın kullanımı^{ile gösterilmiştir 19}. Bir Fab kolunun EGFR (α-EGFR) veya cMET'e (α-cMET) bağlandığı ve diğer Fab kolunun bir izotip kontrolü olduğu radyoaktif etiketli tek kollu antikorlar da örnek olarak kullanılmıştır¹⁹. Bu protokol, immobilize edilebilen bilinen bir antijene sahip herhangi bir radyoaktif etiketli antikor için de uygundur. Bu protokolde, rAb'nin her bir Fab kolu için spesifik olarak belirlenmiş kuyucuklarda sabit miktarda immobilize antijene rAb'nin seyreltme serisi eklenir. rAb ayrıca, spesifik olmayan bağlanmayı belirlemek için antijen olmadan sadece sığır serum albümini (BSA) ile bloke edilmiş kuyucuklara da eklenir. Spesifik bağlanmayı belirlemek için, immobilize antijene spesifik olmayan bağlanma, toplam rAb bağlanmasından çıkarılır. Elde edilen doygunluk bağlama eğrisi daha sonra yukarıda açıklandığı gibi K_D'yi belirlemek için kullanılır.

Bu yöntemin bir avantajı, saflaştırılmış antijenler kullanıldığında, antijen ekspresyon seviyelerinin hücre kültürü sırasında etkilenebileceği ve farklı hücre hatlarının değişken antijen ekspresyon seviyelerine sahip olduğu göz önüne alındığında, antijenlerin kaynağı olarak hücre hatlarının kullanılmasına kıyasla daha yüksek tekrarlanabilirliktir. Radyoaktif etiketli bispesifik antikorlar söz konusu olduğunda, antijenlerden sadece birini diğeri olmadan eksprese eden hücre hatları mevcut olmayabilir, bu da bireysel Fab kollarının bağlanma afinitesini karakterize etmeyi çok zorlaştırır. Özellikle, radyoligand doygunluk testi yönteminin radyoaktif etiketli olmayan yöntemlere göre en önemli avantajı, rAb'nin konjuge edilmemiş fraksiyonunun katkısı olmadan rAb'nin bağlanma afinitesinin spesifik karakterizasyonudur. Yazarların bilgisinin en iyisine göre, şu anda rAb'yi ana konjuge edilmemiş antikorundan ayırmak için herhangi bir saflaştırma tekniği yoktur. Şelatör ve radyonüklidin nispeten küçük boyutu göz önüne alındığında, rAb'nin genel moleküler ağırlığına katkıları, boyut dışlama kromatografisinde önemsizdir. Bu nedenle, herhangi bir radyoetiketleme tekniğinden üretilen ürün hemen hemen her zaman rAb ve ana konjuge edilmemiş antikorun bir karışımıdır. Radyoetiketli doygunluk testi kullanılarak bağlanma afinitesinin karakterize edilmesi, test edilen ürünün yalnızca rAb olmasını sağlar.

Protokol

NOT: Protokolün grafiksel bir gösterimi için Şekil 2'ye bakın.

Şekil 2: Protokolün şeması. Satır ve sütun etiketleri, kırılabilir 96 delikli plakayı ayarlamak için bir kılavuz olarak gösterilir. Beklenen bağlanma, antijen ve BSA için iyi bir örnekte gösterilmiştir. Kavisli ok, yalnızca BSA ile kuyulardan yıkanması beklenen rAb'yi belirtir. Bu figür BioRender.com ile yaratılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Tampon hazırlama

1. 50 mL immobilizasyon tamponu hazırlayın (50 mM Na_{2 CO 3'lük}sulu çözelti; pH = 9.0).
   1. Tartım kağıdına 191 mg NaHCO 3 ve 23,9 mg Na₂CO₃ tartın ve 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın. Çözünmesi için 40 mL 18 MΩ su ve vorteks ekleyin. Toplam hacmi 18 MΩ su ile 50 mL'ye getirmeden önce gerekirse pH'ı 9,0'a ayarlayın.
2. 250 mL'lik bir şişeye 200 mL PBS ve ardından 100 μL Ara-20 ekleyerek yaklaşık 200 mL yıkama tamponu (% 0.05 Tween-20 içeren fosfat tamponlu salin (PBS)) hazırlayın.
3. 50 mL bağlayıcı tampon hazırlayın (%0.05 Ara-20 ve %0.1 sığır serum albümini (BSA) içeren PBS).
   1. Tartım kağıdına 50 mg BSA tartın ve 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Tüpe 50 mL PBS ve ardından 25 μL Ara-20 ekleyin. Karıştırmak için yavaşça girdap.
4. 50 mL blokaj tamponu hazırlayın (PBS'de %3 BSA).
   1. Tartım kağıdına 1,5 g BSA tartın ve 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın. 50 mL PBS ekleyin ve karıştırmak için yavaşça girdap yapın.
      NOT: En iyi sonuç için tüm tamponların 4 °C'de 1 haftaya kadar saklanması önerilir.

2. Antijen immobilizasyonu

1. Antijeni immobilizasyon tamponunda seyrelterek 5 μg/mL konsantrasyona ulaşın.
2. 8 x 3 dizide kırılabilir 96 kuyulu, düz tabanlı bir plakanın 24 kuyucuğunun dibine antijen kuyucuğu başına 100 μL ekleyin (A-H satırları için 1-3 sütunları). Plakayı sızdırmazlık bandı ile örtün.
   NOT: Kuyu plakasının yüzeyinin, karışık hidrofobik ve hidrofilik alanların adsorpsiyonunu en üst düzeye çıkarmak için işlendiğinden emin olun. Bu ön işlem görmüş plakalar ticari olarak temin edilebilir.
3. Gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
4. Ertesi gün, plakayı 3x yıkama tamponu ile yıkayın.
   1. Sıvıyı atmak için plakayı lavaboda hızlı bir şekilde ters çevirin ve fazla sıvıyı çıkarmak için plakayı bir kağıt havlu yığınına dokunun.
   2. Çok kanallı pipet kullanarak, antijeni içeren kuyucuklara yıkama tamponu kuyucuğu başına 300 μL ilave edin. Sıvıyı 2.4.1'de açıklandığı gibi çıkarın. Yıkama adımını toplam üç kez tekrarlayın.

3. BSA ile spesifik olmayan sitelerin engellenmesi

1. Çok kanallı pipet kullanarak, 96 delikli plakanın 24 antijen kaplı kuyucuğuna ve 24 boş kuyucuğuna (A-H sıraları için sütun 1-6) blokaj tamponu kuyucuğu başına 300 μL ekleyin.
2. Plakayı ortam sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin.
3. Plakayı yıkama tamponu kuyusu başına 300 μL ile toplam üç kez yıkayın. Plakanın yıkanmasının ayrıntılı bir açıklaması için adım 2.4'e bakın.
    

4. Seri seyreltmeler ve rAb çözeltisinin eklenmesi

DİKKAT: Aşağıdaki adımlar radyoaktiviteyi içerir. Adımlar sadece radyasyon güvenliği eğitimi almış kişiler tarafından gerçekleştirilmelidir. Araştırmacılar eldiveni iki katına çıkarmalı ve yeterli kalkanla adımlar atmalıdır.

1. Seçim yöntemini kullanarak incelenen rAb'yi sentezleyin. Örnek olarak kullanılan rAb'ler daha önce açıklandığı gibi sentezlendi¹⁹.
   NOT: Bu protokol, radyo-etiketli bir rAb'nin karakterizasyonuna odaklanır.
2. Bağlayıcı tamponda rAb'nin 8 x 3 kat seri seyreltmesini (plakadaki A-H sıraları için belirlenmiş) yapın.
   NOT: Seri seyreltmelerin konsantrasyonları her rAb için değişecektir. Ayrıntılar Tartışma bölümünde ele alınmıştır. Seyreltme faktörü değişirse, her seyreltme için gereken hacim, 1) her bir kuyucukta rAb'nin bağlanması, 2) aşağıdaki seyreltmenin tohumlanması ve 3) her bir kuyucuğa eklenen toplam rAb'nin radyoaktivitesini ölçmek için gama sayımı için rAb standart bir çözeltinin alıntılanması için yeterli hacim sağlamak üzere yeniden hesaplanmalıdır.
   1. İlk konsantrasyonun 1,2 mL'lik bir çözeltisini yapmak için gereken stok rAb hacmini hesaplayın (A olarak etiketleyin).
   2. B, C, D, ... için H. Bağlanma tamponunun 4.2.1. adımında hesaplanan hacim eksi 1,2 mL'yi A etiketli bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin.
   3. 4.2.1 olarak hesaplanan stok rAb hacmini A tüpüne ekleyin. Vorteksi yavaşça karıştırın ve ardından tüpün altındaki tüm sıvıyı toplamak için mini bir mikro santrifüj kullanarak aşağı doğru döndürün.
   4. A tüpünden B tüpüne 400 μL ekleyin. Mini bir mikrosantrifüj kullanarak karıştırmak ve daha sonra döndürmek için vorteks. B'den C'ye, C'den D'ye, ..., G'den H'ye eklemeyi tekrarlayın.
3. Her seyreltmenin kuyucuğu başına 100 μL'yi, antijenle hareketsiz hale getirilmiş üç kuyucuğa ve sadece BSA ile bloke edilmiş üç kuyucuğa ekleyin. Örneğin, A1-A3 (antijen) ve A4-A6 (BSA) kuyularına seyreltme A ekleyin.
4. Her seyreltmenin 100 μL'sini A std - H std etiketli mikrosantrifüj tüplerine ekleyin. Bu tüpleri gama sayacında test edilmek üzere rAb standartları olarak saklayın.
5. Plakayı 37 ° C'de 1 saat boyunca hafifçe sallayarak inkübe edin.

5. Yıkama plakaları ve tahlil radyoaktivitesi

1. Her kuyucuk için mikrosantrifüj tüplerini etiketleyin (A1 ila A6, B1 ila B6 ... H1-H6 aracılığıyla). İstenirse numuneleri renk kodlamak için iki farklı renkli işaretleyici kullanın; biri antijenle kaplanmış kuyular için, diğeri ise yalnızca BSA'lı kuyular için.
2. Bir vakum aspiratörü kullanarak rAb'yi her kuyucuktan aspire edin.
3. Çok kanallı pipet kullanarak her bir kuyucuğa 300 μL yıkama tamponu ekleyin. Yıkama tamponunu aspire edin. Yıkamayı toplam beş kez tekrarlayın.
4. Kuyucukları uygun mikrosantrifüj tüplerine ayırın.
5. Bir gama sayacı kullanarak tüplerdeki radyoaktiviteyi sayın. Önce antijenli tüpleri (H1, H2, H3 ila A1, A2, A3) ve sonra sadece BSA'lı tüpleri (H4, H5, H6 ila A4, A5, A6) sayın. Paraziti en aza indirmek için, her seyreltmenin standartlarını (H std'den A std'ye) farklı bir zamanda ayrı ayrı sayın.

6. Veri analizi

NOT: Ek dosyalar, verileri analiz etmek ve çizmek için ilgili elektronik tabloyu ve istatistiksel analiz şablonlarını içerir.

1. Bir elektronik tabloda, her örnek için toplam, özel ve spesifik olmayan bağlamayı hesaplayın (ek dosya olarak eklenen elektronik tablo şablonuna bakın).
   1. "Bağlı Etkinlik"i, numunenin (gama sayacından elde edilen) dakika başına sayımlarının (BGBM) uygun standardın BGBM'sine bölünmesiyle hesaplayın. "% Bound"u Bağlı Etkinlik çarpıları 100 olarak hesaplayın.
   2. "Toplam Bağlı, mol/L"yi "% Bağlı" ile rAb eklenmiş konsantrasyonu (mol/L) ile çarparak hesaplayın. "Toplam Bağlı, mol/L"yi litre (0,0001 L) cinsinden eklenen rAb hacmiyle çarparak "Toplam Bağlı, mol" değerini hesaplayın.
   3. BSA seyreltilerinin "Toplam Bağlı, mol" ü antijen seyreltilerinden çıkararak "Spesifik Bağlanma, mol" ü hesaplayın, böylece A1 A4 ile, A2 A5 ile, A6 ile A3, B1 B4 vb.
   4. Her bir kuyucuk için "Toplam Bağlama, mol" den "Özel Bağlama, mol" çıkararak "Spesifik Olmayan Bağlama, mol" ü hesaplayın.
2. İstatistiksel analiz çizim yazılımında, x ekseninde eklenen rAb (nmol / L) konsantrasyonunu y ekseninde bağlama (mol) ile grafiğini çizin. Üçlü toplam bağlama, belirli bağlama ve özgül olmayan bağlama içinde çizim yapmak için ayrı gruplar oluşturun. Kullanılan yazılımda aşağıdaki parametreleri seçerek doğrusal olmayan bir uyum analizi gerçekleştirin (Malzeme Tablosu; ek dosya olarak ekteki istatistiksel analiz şablonuna bakın).
   1. Yeni Analiz'i seçin. XY analizleri altında, Doğrusal olmayan regresyon (eğri uyumu) seçeneğini belirleyin. Hangi veri kümelerini analiz et? altında tüm verilerin seçili olduğundan emin olun ve ardından Tamam'ı seçin.
   2. Model sekmesinde, Bağlama - Doygunluk altında, Bir site - Belirli bağlama'yı seçin. Güven sekmesinde, 'belirsiz' uyumları tanımla'yı seçin. Diğer tüm parametreleri varsayılan olarak bırakın ve Tamam'ı seçin.
      NOT: Bu, toplam, spesifik ve spesifik olmayan bağlama için K_D ve Bmax'ı hesaplar. Spesifik bağlanmanın K D'si, antijene bağlı rAb'nin nmol / L'sindeki K_D'dir.

Sonuçlar

Bu yöntem, sabit miktarda immobilize antijene farklı konsantrasyonlarda rAb eklendiği doygunluk bağlama testine dayanarak bir rAb için bağlanma afinitesini (K_D) hesaplar. Bağlanma eğrisi, başlangıçta dik olduğu logaritmik büyümeyi takip etmeli ve daha sonra antijen doygun hale geldikçe platolar oluşturmalıdır. Belirlenen_K D'nin doğru olduğundan emin olmak için, rAb konsantrasyonları doygunluğa ulaşacak kadar yüksek olmalıdır. Bu test için, radyoaktif etiketli antikorlar D...

Tartışmalar

rAbs'nin geliştirilmesinin bir parçası olarak, bir rAb'nin hedefine özellikle yüksek bağlanma afinitesi ile bağlanmasını sağlamak önemlidir. Bağlanma afinitesinin belirlenmesi, rAb'nin immünoreaktivitesinin, immobilize antijen kullanılarak radyoligand doygunluk testi yoluyla radyokonjugasyondan etkilenip etkilenmediğini bildirebilir. BSA'ya rAb bağlanmasının belirlenmesi, immobilize antijene spesifik bağlanmayı daha doğru bir şekilde ölçmek için spesifik olmayan bağlanmayı ölçmek için kullan...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9647
Gamma Counter	Hidex	Hidex Automatic Gamma Counter
GraphPad Prism Software	GraphPad		version 9.2; used for statistical analyses in this study
Immuno Breakable MaxiSorp 96-well plates	Thermo Scientific	473768
Microplate Sealing Tape	Corning	4612
Microsoft Excel	Microsoft
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190144
Sodium Bicarbonate	JT Baker	3506-01
Sodium Carbonate	Sigma-Aldrich	S7795
Tween-20	Sigma-Aldrich	P7949