מודל כאב גב עכבר הנגרם על ידי מפעיל אורוקינאז

Summary

שיטות להשראת מודל כאב גב פשוטה ומהירה בעכברים ניתנות כאן באמצעות הזרקה תוך רצועה של מפעיל פלסמינוגן בשתן.

Abstract

מודל של כאבי גב תחתון מתמשכים יכול להיגרם בעכברים באמצעות המתודולוגיה הפשוטה המתוארת כאן. שיטות שלב אחר שלב להשראת מודל כאב גב מתמשך ומהיר בעכברים מסופקות כאן באמצעות הזרקה של מפעיל פלסמינוגן מסוג אורוקינאז (אורוקינאז), פרוטאז סרין הקיים בבני אדם ובבעלי חיים אחרים. המתודולוגיה להשראת כאבי גב תחתון מתמשכים בעכברים כוללת הזרקה פשוטה של אורוקינאז לאורך אזור החדרת הרצועה בעמוד השדרה המותני. סוכן דלקתי urokinase מפעיל פלסמינוגן פלסמין. בדרך כלל, ניתן לגרום למודל תוך 10 דקות ורגישות יתר נמשכת לפחות 8 שבועות.

רגישות יתר, הפרעות הליכה ואמצעים סטנדרטיים אחרים דמויי חרדה ודיכאון יכולים להיבחן במודל המתמיד. כאבי גב הם סוג הכאב השכיח ביותר. כדי לשפר את המודעות לכאבי גב, האגודה הבינלאומית לחקר הכאב (IASP) הכריזה על 2021 כ"שנה הגלובלית על כאבי גב" ועל 2022 כ"שנה הגלובלית לתרגום ידע על כאב לתרגול". מגבלה אחת של ההתקדמות הטיפולית של טיפולי כאב היא היעדר מודלים מתאימים לבדיקת כאב מתמשך וכרוני. התכונות של מודל זה מתאימות לבחינת טיפולים פוטנציאליים שמטרתם הפחתת כאבי גב והמאפיינים הנלווים שלהם, ותורמים להכרזת IASP על 2022 כשנה הגלובלית לתרגום ידע כאב לתרגול.

Introduction

כאבי גב תחתון הם אחד הגורמים השכיחים ביותר לנכות, כאשר 1 מכל 5 אנשים סובל ברחבי העולם¹. למרות מאמצים אלה, מעט מודלים אמינים של כאבי גב בבעלי חיים משמשים באופן פופולרי במחקר בבעלי חיים בתחום הכאב, במיוחד בעכברים. מודלים קודמים עשו שימוש כמעט בלעדי בחולדות להשראת כאבי גב כרוניים (CBP), כגון אלה הנגרמים על ידי הזרקת מפעיל פלסמינוגן בשתן (uPA) למפרק הפאצט המותני ^2,3, הזרקת גורם גדילה עצבי (NGF) לשרירי הגו⁴, או מונוסודיום יודואצטט (MIA)⁵ או אינטרלוקין-1beta⁶ הזרקה בדיסק התוך חולייתי. כמובן, חולדות מועדפות עבור מודלים אלה בעיקר בשל גודלם הגדול יותר וקלות הגישה שלהם להזרקת חומרים דלקתיים.

למען הסר ספק, קיימים מודלים עכבריים של כאבי גב כגון מודל העכבר SPARC-null של ניוון דיסק בין-חולייתי המשמש במשך שנים רבות⁷, אך אלה יקרים יותר וגוזלים זמן רב יותר לביסוס מאשר מודלים מבוססי הזרקה. מחקר עכברים שנערך לאחרונה ביסס מודל של כאבי גב תחתון על ידי שילוב הזרקת NGF לשרירי הגב התחתון עם לחץ ריסון כרוני אנכי⁸. בפרוטוקול הבא, התאמנו את מודל CBP המושרה על ידי uPA מחולדות עבור עכברים². רגישות יתר נקבעת תוך שבוע אחד ונמשכת עד 6-8 שבועות. בנוסף, אנו קובעים כי עכברים מפתחים התנהגויות דמויות חרדה ודיכאון. בהתחשב בשכיחות כאבי גב והשימוש הנפוץ יותר בעכברים במחקר כאב מולקולרי, מודל עמיד זה מבוסס בקלות לשימוש בפיתוח אסטרטגיות טיפול חדשות להקלה על כאבי גב.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל הנהלים המתוארים בבעלי חיים תואמים את מדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. המחקרים אושרו על ידי הוועדה המקומית לטיפול ושימוש מוסדי (IACUC #23-201364-HSC) של המרכז למדעי הבריאות באוניברסיטת ניו מקסיקו. כל המחקרים תואמים למדיניות בחסות OLAW Assurance of Compliance (A3002-01) בנוגע לשימוש בבעלי חיים במחקר, כמתואר בחלק III. II. הבטחות ואישורים. בעלי החיים שוכנים במתקן הדיור של המרכז למשאבי בעלי חיים (ARC) המתוחזק על ידי צוות המעבדה וצוות האגף למשאבי מעבדה ובעלי חיים (DLAR). שיטת המתת חסד (100 μL של 59 מ"ג / מ"ל הזרקת pentobarbital) היא מהירה ואמינה ומאפשרת דיסקציה ואיסוף של רקמות שונות למחקר נוסף.

1. בעלי חיים

1. עכברי BALB/c בוגרים (~ 3-4 שבועות) זכרים ונקבות BALB/c (20-25 גרם) על מחזור הפוך של 12 שעות: 12 שעות אור: חושך, כך שזמן הפעילות שלהם בחושך מתרחש במהלך שעות העבודה במעבדה.
   הערה: זה יאפשר להעריך את כל הפרמטרים במהלך זמן הפעילות הטבעי של בעלי החיים, שכן מכרסמים הם בעלי חיים ליליים באופן טבעי. זה מקטין את התרומה של שינויים של השעון הצירקדי, כך בעלי חיים יכולים להיבדק במהלך הזמן הפעיל שלהם שהוא עכשיו בשעות היום.
2. עקוב אחר בעלי החיים פעמיים ביום.
3. שמרו על העכברים על צ'או רגיל של מגדל עכברים, שהוא נמוך יותר בתכולת חלבון סויה בהשוואה לצ'או מכרסם רגיל (הידוע כמשנה רגישות יתר) אם מעריכים את ההשפעות של תרופות על התנהגויות הקשורות לכאב.
4. לשקול את בעלי החיים פעם בשבוע כדי להבטיח שמירה על עלייה במשקל בריא.
   הערה: לא נצפו הבדלים קבוצתיים במשקל במהלך המחקרים שנמשכו 8-10 שבועות, מה שאיפשר עיוורון במחקר.

2. אינדוקציה לדגם

1. בצעו אינדוקציה של המודל על משטח שטוח סטרילי חם המצויד באמצעי לחיבור מעצורי ייצוב כדי להחזיק את העכבר במקומו (איור 1A). בצע את הניתוח במיקרוסקופ דיסקציה על משטח מעוקר.
   הערה: יש להשתמש בקולט אדים באיכות כימית אם לכידת הרדמה אינה זמינה.
2. השתמשו במשי כירורגי או אפילו בחוטים עם גומיות הקשורות בקצה המיתרים המחוברים לקצוות הצולעים של הצלחת כריסון אם אתם משתמשים בלוח הבסיס המומלץ בטבלת החומרים.
3. הניחו עמדת התאוששות של כרית חימום על משטח סמוך למערך הניתוח להעברת עכברים לתחנה מיד לאחר ההזרקה (איור 1B).
   הערה: הניחו כלוב דיור ריק על כרית החימום לפחות 10 דקות לפני ההזרקה כדי לאפשר לכלוב להתחמם לטמפרטורה נוחה (37°C). הניחו את חצי הכלוב מחוץ לרפד, כדי לאפשר לעכבר המתעורר העדפה של טמפרטורות התאוששות.
4. מכינים את האורוקינאז ומדללים אותו במים סטריליים. אלכוהול לנקות את מזרק המילטון ולשטוף במים סטריליים. הכינו את התמיסה מראש כך שהעכבר יהיה תחת הרדמה לזמן קצר ככל האפשר. השתמש 5 μL של 2 מ"ג / מ"ל מפעיל פלסמינוגן בשתן עבור המודל; עבור shams, להשתמש 5 μL של מלוחים סטריליים.
5. הגדר את תחנת ההרדמה isoflurane ברמה של 4% או פחות עבור הליך קצר זה. מקם את העכבר בתא האינדוקציה; בדרך כלל, קצב הנשימה המהיר של העכבר יואט תוך 1-2 דקות, ויעבור מתנועת החזה העליון לחזה התחתון.
6. השתמש ברמת חמצן של 1.5 ליטר לדקה ומיכל פחם פעיל F או עבוד תחת זרימה ביולוגית או מכסה מנוע פינוי עילי כדי לקרצף את האיזופלורן כדי למנוע חשיפה למנתח החיה. אם ההליך אינו זמין, יש לבצע את ההליך במכסה מנוע בטיחותי כימי.
7. העבירו במהירות את זרימת העכבר וההרדמה לאזור הניתוח על משטח חימום של 37°C, והניחו את אפו של העכבר בתוך חרוט האף כדי לשמור על רמת ההרדמה (איור 1C,D). בדוק כדי לוודא שלעכבר אין תנועה רפלקסיבית כדי לצבוט את הבוהן ולאחר מכן לרסן את העכבר על לוח הבסיס.
   הערה: אם יש תנועה בכלל, החזיר את העכבר לתא האינדוקציה וחזור על כך.
8. נקו את אזור עור הגב בעזרת ספוגית אלכוהול. כוונן את תאורת ה-LED לפי הצורך כדי לקבל תצוגה ברורה של גב העכבר המורדם.
   הערה: במידת הצורך, השתמש במכונת גילוח חשמלית כדי להסיר שיער מגבו של העכבר כך שיהיה נוף ללא הפרעה של רכסי עמוד השדרה מתחת לעור. אם מגולחים את עכברי הניסוי, יש לגלח גם את גבם של העכברים התמימים והמזויפים לצורך סינוור המחקר.
9. יש להזריק את העכבר כשהוא מורדם לחלוטין ומשותק (ללא רפלקס ימני וצביטה בבוהן). השתמשו בשתי אצבעות כדי להרגיש בעדינות היכן תחתית כלוב הצלעות של העכבר פוגשת את עמוד השדרה (איור 2A). מתחת לנקודה זו נמצאים מקטעי עמוד השדרה העצים; יש לכוון את הזריקה כאן לכיוון L2-L3.
10. הניחו את קצה מזרק המילטון ליד עמוד השדרה (איור 2B,C). כוונו את המזרק בזווית ~45° לתוך הרצועה הבין-שדרתית הצמודה מיד לעצם.
    הערה: בהתאם לקשיחות העור של העכבר, לפעמים הסתמכות על כוח הכבידה במקום לחץ פעיל וזווית של 90° יכולה לעבוד טוב יותר.
11. הכנס את קצה המחט בעדינות אך בחוזקה לתוך הרצועה הבין-שדרתית (איור 3B,C).
    הערה: המטרה היא לא לפרוץ את חלל הבטן אלא להזריק את הרצועה.
12. רוקנו את תוכן המחט באיטיות. אם בשלב כלשהו יש נוזל בקצה, המחט אינה דרך העור. המשך עד הזרקת כל 5 μL.
13. החזק את המחט במקומה במשך ~ 5 שניות כדי למנוע זרימה חוזרת מההזרקה. מומלץ להשתמש בצבע כחול בניסויי פיילוט סופניים או חריפים.
    הערה: אם עושים זאת נכון, הנוזל אמור להתפשט לתוך הרצועה כפי שמוצג (איור 3A).
14. הסר את המחט בעדינות ולאט. ודא שאין דם או הפרשות.
15. הכניסו את העכבר לתחנת החזרת החום עם ראש כלוב עד שיתעורר ויהיה נייד לפני החזרתו לכלוב הביתי.
    הערה: בהנחה שההליך בוצע במהירות, לא אמורה לחלוף יותר מדקה לפני שהעכבר מתעורר.
16. בדוק את העכברים במשך שעה לאחר הניתוח כדי להבטיח שכל התפקוד המוטורי הרגיל ממשיך כאמצעי זהירות.
    הערה: אם נעשה כראוי, לא אמורים להיות סיבוכים מהליך זה.
17. בדוק את העכברים מדי יום במשך השבוע שלאחר הניתוח, כולל הערכת משקל ובדיקת אתר ההזרקה כדי לוודא שלא התרחשו זיהום או סיבוכים. אין להשתמש בעכבר לניסויים נוספים אם יש שינוי בהתנהגות, כגון ירידה במשקל ועייפות.

איור 1: הגדרה להשראת CBP של אורוקינאז. (A) לוח הבסיס Fine Science Tools המומלץ לניתוחי עכברים. הקצוות המצולעים יכולים להיות מחוברים חוט עליהם להחזקת העכבר במקומו. (ב) תחנת שחזור. מומלץ כלוב דיור ריק, חציו על כרית החימום, חציו כבוי. מטלית נקייה מונחת בתחתית כדי לתת לעכבר אזור מנוחה נוח. (ג) המלצה להתקנת מכונת הרדמה. באמצעות מערכת הולכה דו-ערוצית, הגדירו צינור אחד לתא הזירוז וצינור נוסף לתחנת הניתוח. (D) מבט על מעצורי העכבר. שני מיתרים נקשרים על הקצוות המצולעים של לוח הבסיס, ואז נמשכים בעדינות לאורך צוואר העכבר ומאחוריו בהתאמה. הקפד לא לרסן את העכבר חזק מדי, כך שהוא עדיין יכול לנשום כרגיל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: השראת הזרקת אורוקינאז של CBP. (A) מבט על מיקום אתר ההזרקה. כפי שמוצג, הרגישו עם האצבעות כדי למצוא את החלק התחתון של כלוב הצלעות של העכבר עבור נקודת התייחסות עבור L4-L5. (B) מבט על תהליך ההזרקה, המראה את הזווית להזרקה נכונה. (C) זווית של 45° עדיפה כאן, אך התאימו לפי הצורך כדי להבטיח שהמחט תגיע לאן שהיא צריכה. במידת הצורך, יש לגלח את אתר ההזרקה להדמיה טובה יותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: תרשים של אתר ההזרקה. (A) צילום של מיקום אתר ההזרקה. דיו משמש כאן כדי לציין היכן הנוזל ייכנס לרצועה הבין-שדרתית בין חוליות L2 ו-L3. (B) תרשים המראה את המיקום הנכון של המחט ואת המיקום של אתר ההזרקה, המוצג ממבט מהצד. (C) תרשים המציג מבט מלמעלה למטה על החוליות, ואתרי הזרקה של הרצועות הבין-שדרתיות. ההזרקות יהיו בדרך כלל על הרצועות הבין-שדרתיות הסמוכות לעמוד השדרה, אך ניתן להחדיר את המחט גם לרווח שבין החוליות הרוחביות והרוחביות. השימוש בצבע כחול בניסויי פיילוט מומלץ כמוצג ב-(A). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. בדיקות התנהגותיות

1. בדיקת סף תגובת רפלקס מכני של פון פריי
   הערה: סף משיכה מכני הוא הכוח המינימלי הדרוש כדי לעורר תגובה 50% מהזמן עם סדרה של 8 מונופילמנטים של פון פריי המדורגים בקוטר עם ~0.2 גרם עליות, המספקים שינויים בשלב היומן בכוח מכני (טבלה של חומרים).
   1. בדוק גירוי מכני עם סיבי פון פריי המופעלים על הכף האחורית, שטח העצבוב של העצבים lumbosacral. קבע את ערכי נסיגת הכפות הבסיסיות לפני הניתוח. לאחר הניתוח, לקבוע את הסף המכני פעם בשבוע במהלך הניסוי הכרוני.
   2. הוציאו את בעלי החיים מחדר הדיור ואכסנו אותם בחדר הבדיקה למשך 30 דקות בכלובים הביתיים שלהם לפני הבדיקה. משם, הזיזו את בעלי החיים כדי לרסן אותם בנפרד בתאים קטנים ושקופים על שולחן הבדיקה עם המסך למשך 15-20 דקות, בהתאם לרמת הפעילות שלהם.
      הערה: הבדיקה יכולה להתחיל לאחר שהעכברים התמקמו בתנוחת מנוחה ואינם מסתובבים ונעים בחדר. ההסתגלות לתא הריסון ממזערת את ההשפעות הנובעות ממתח. אם עכברים נשמרו במחזור אור הפוך, הבדיקה צריכה להיעשות בתנאי אור אדום.
   3. המשך בבדיקה באמצעות סדרות מדורגות של סיבי פון פריי כמתואר להלן וב- Chaplan et ^al.9.
      1. בדוק את כרית כף הרגל בנקודה עקבית על כל חיה באמצעות חוט הלהט 3.61 פון פריי אשר כאשר כפוף מעורר כוח של 0.4 גרם (טבלה של חומרים). המשך עם גירוי עם חוט הלהט 4.08 פון פריי המעורר כוח של 1.0 גרם .
         הערה: אף אחד מהסיבים הללו אינו מעורר תגובות אצל בעלי חיים תמימים ומתאקלמים.
      2. יש למרוח כל חוט להט 5x במרווחים של >5 שניות בניצב לכרית כף הרגל, תוך זהירות שלא לגעת בקפל/נקיק או בשיער. תגובה חיובית היא נסיגה ברגל לשלושה מתוך חמישה גירויים. החל את חוט הלהט החלש הבא בסדרה עד שהחיה אינה מגיבה לגירוי המכני; בשלב זה, השתמש בנימה הגבוהה הבאה. אם הוא מעורר תגובה, השתמש שוב בחוט הלהט התחתון עד שיוחלו ארבעה ניסויים לאחר שינוי התגובה לגירוי מכני של כרית כף הרגל.
      3. השתמש בתבנית התגובה המתקבלת כדי לחשב את סף הנסיגה המכני, כמות הכוח המינימלית הדרושה כדי לעורר תגובה 50% מהזמן, באמצעות אלגוריתם התאמת עקומה⁹. ירידה בכוח הנדרש כדי לעורר תגובת נסיגה ברגל בהשוואה לעכברים תמימים או לקו הבסיס של החיה עצמה מצביעה על רגישות מוגברת של החיה.
2. בדיקת סף תגובת רפלקס תרמי
   הערה: ספי התגובה לחום ולקור נבדקים באמצעות בדיקות Hargreaves ו- cold plate, בהתאמה.
   1. מבחן Hargreaves
      1. הניחו את העכברים בתאים על משטח זכוכית המחומם באמצעות פולט אינפרא אדום מלמטה. רשום את זמן ההשהיה למשיכת כף הרגל כזמן בשניות מיישום גירוי האור האינפרא אדום (50 מעלות צלזיוס) המסופק על ידי המכשיר על כפו האחורית של העכבר עד לנסיגה מהגירוי.
   2. בדיקת צלחת קרה
      1. הניחו את העכברים על מכשיר הצלחת הקרה מקורר ל -9 מעלות צלזיוס. רשום את זמן ההשהיה למשיכת כף הרגל כזמן בשניות ממיקום העכבר על המכשיר ועד שהעכבר מתחיל להרים את רגלו.
      2. לחלופין, הניחו בדיקה קרה מקוררת לטמפרטורה של -9°C מתחת לכפה האחורית של העכבר בזמן שהעכבר כלוא בכלוב על גבי רשת תיל. רשום את זמן ההשהיה לסגת כזמן בשניות ממיקום המכשיר מתחת לכפה האחורית עד שהעכבר מתחיל להרים, ללקק או לרעוד. כדי להימנע מלעורר תגובה נוסיספטיבית, הרגילו את העכבר לכך שהגשושית נוגעת בו בטמפרטורת החדר.
3. מבחני התנהגות תלויי קוגניציה ורגש
   הערה: רגישות יתר מתמשכת אצל בעלי חיים גורמת לתפקוד לקוי רגשי ותלויי קוגניציה. אלה נמדדים בדרך כלל רק פעם אחת בשבוע 6 לאחר השראת מודל הכאב כדי למנוע השפעות תרגול.
   1. מבחני חרדה
      הערה: חרדה ודיכאון יכולים גם להיבדק באופן אמין כדי לוודא את היעילות של המודל. עדיף לחכות לפחות עד שבועות 4-6 לאחר הזרקת האינדוקציה כדי לאפשר את התפתחות התחלואה הנלווית. העדפה לחושך ולא לחדר האור היא מדד לחרדה הקשורה לנוסיספטיון. בניסויי מבוך אפס או פלוס, עכברי מודל כאב מבלים פחות זמן ברביע הפתוח מאשר חיות ביקורת נאיביות, תצוגה של התנהגות דמוית חרדה^10,11.
      1. בדיקת העדפת מקום בהיר/כהה: הכניסו כל בעל חיים לתיבת הבדיקה להעדפת מקום עם מעבר בין שני תאים (10 x 10 x 10 ס"מ³). חדר אחד של המנגנון מואר באור בהיר, בעוד הצד הנגדי נשאר חשוך. במהלך כל בדיקה של 10 דקות, עקוב אחר מיקום בעל החיים באמצעות מחשב כדי לקבוע זמני תפוסה של אור וחושך ומספר המעברים.
         הערה: לחלופין, הרכיבו מצלמת וידאו מעל תא הבדיקה ותיעדו ידנית את הזמן המושקע בכל חדר.
      2. מבוכים מוגבהים פלוס או אפס: הניחו את המכרסמים לדוגמה או בעלי חיים תמימים על המבוך והשתמשו בסטופר כדי להעריך את הזמן שבילו בחלקים הסגורים של המבוך. קבע את הזמן המושקע בשני האזורים ה"בטוחים" המוקפים חומה ובשני אזורים פתוחים "לא בטוחים". בעלי חיים הסובלים מכאב מעדיפים אזורים סגורים ובטוחים.
         הערה: התנהגות דמוית חרדה יכולה להיבחן במבוך אפס או פלוס (10 דקות). מבוך האפס הוא מסלול מעגלי בניגוד למבוך הפלוס, שהוא "בצורת סימן פלוס". לשניהם שני רבעים פתוחים ושני רבעים סגורים המאפשרים התנהגות חקרנית מתמשכת. שניהם מוגבהים 1 מ 'מעל הקרקע, או שביל עגול או בצורת פלוס מחולק לארבעה רבעים שווים בגודלם.
   2. בדיקת דיכאון נתז סוכרוז
      הערה: בדיקת התזת סוכרוז משמשת לקביעת התנהגות דמוית דיכאון. מבחן ההתזה מאפשר למדוד היעדר התנהגות טיפוח נורמלית כסימפטום של דיכאון הנובע מכאב כרוני.
      1. ציון התדירות, משך הזמן וההשהיה של הטיפוח במשך 10 דקות לאחר ריסוס תמיסת סוכרוז 10-30% על הפרווה הגבית (~ 250 μL ליד בסיס הזנב). משקיפים עיוורים סופרים את מספר תמרוני הטיפוח מהקלטות וידאו¹².
         הערה: מדד זה דווח כמושפע במודלים של מכרסמים של הפרעות במצב הרוח, כגון מתח כרוני קל, ויש לתקן אותו על ידי טיפול נוגד דיכאון כרוני¹³.
   3. בדיקת אובייקט חדשני
      הערה: תפקוד קוגניטיבי לקוי ניתן למדידה באמצעות מבחן האובייקט החדש.
      1. התאקלם עכברים בנפרד בכלוב פלסטיק שקוף עם ראש פתוח (56 x 30 x 20 ס"מ) למשך שעה אחת. הוסיפו שתי דמויות צעצוע זהות בפינות נגדיות של הכלוב למשך 5 דקות.
      2. ביום הניסוי, יש להרגיל את בעלי החיים לכלוב השקוף שוב למשך שעה אחת לפני הצבת שתי דמויות זעירות זהות באותן תנוחות של הכלוב למשך 5 דקות לפני החזרתן לכלוב הביתי.
      3. החליפו את אחת הדמויות המקוריות בחפץ חדשני שונה לחלוטין, החזירו את העכברים לכלוב הבדיקה כעבור 4 שעות, ותיעדו את הזמן שהוקדש לחקר החפצים.
      4. חשב את מדד הזיהוי המדווח (RI) כאחוז הזמן שהוקדש לחקר האובייקט החדש של זמן חקר האובייקט הכולל¹⁴.
   4. הערכת תפקוד מוטורי
      הערה: בדיקת תנועתיות כתם דיו^{והפרעות הליכה 15} מעריכה את התפקוד המוטורי במודל כאבי הגב.
      1. בנו מנהרה מצינור מגבת נייר חתוך לאורך בקצה אחד. יש לפתוח את המנהרה על פיסת נייר מדפסת נקייה.
      2. החזיקו את העכברים עטופים בעדינות במגבת עד שהם רגועים. הניחו את הכפות על כרית בולים רטובה בדיו הודי לא רעיל כדי לצפות אותן בדיו או צבעו את הדיו על תחתית רגלי העכבר באמצעות צמר גפן. שחררו את העכברים בפתח המנהרה ותנו להם לרוץ דרך המנהרה, וללכוד אותם בקצה.
      3. ציון הדפסות כפות בהתבסס על שלושה פרמטרים: אורך צעד (המרחק האנכי מהקצה האחורי של הדפסה אחת לאחרת), רוחב צעד (מרחק אופקי בין הדפסות) ופריסת בוהן (המרחק בין אצבעות הרגליים משני צדי הכפה).
         הערה: ניתן להשתמש בחטיפים מאושרים גם כדי לעודד את העכבר לעבור דרך המנהרה. אם טביעות הכפות מרוחות או לא ברורות, יש לחזור על הניסוי.

איור 4: רגישות יתר מכנית ותרמית בעקבות השראת CBP. הכאב ניתן למדידה שבוע לאחר זירוז המודל ונמשך 8 שבועות. (א) מבחן פון פריי. בדיקת סף מכנית מבוצעת עם חוטי פון פריי המוחלים על כרית כף הרגל דרך שולחן רשת עליון בשיטת מעלה-מטה כפי שמוצג כאן במשך 4 שבועות. הסף הזכרי התמים (ירוק) מוסתר מתחת לקו הכחול של נקבות העכברים התמימים. עכברי CBP (n = 4 זכרים, 4 נקבות) הראו רגישות מכנית מוגברת באופן משמעותי בהשוואה לבקרות התמימות (n = 2 זכרים, 2 נקבות). ANOVA דו-כיווני (מבחן ההשוואות המרובות של דנט) בוצע על נתונים אלה: n = 4 לכל קבוצה. בניתוחים פוסט-הוק , התאמת בונפרוני לכל ערכי ה-P להשוואות שבועיות של CBP לעומת נאיבי הניבה את כל 11 הערכים <-0.0011. עמ' < 0.0001. (B) מבחן Hargreaves. סף החום נבדק על משטח כף הרגל במבחן Hargreaves (50 מעלות צלזיוס). עכברי CBP (n = 12 זכרים, 12 נקבות) הראו רגישות מוגברת משמעותית לחום בהשוואה לקבוצת הביקורת התמימה (n = 6 זכרים, 6 נקבות). מבחן T דו-זנבי מאן-ויטני בוצע כדי לבדוק מובהקות (עמ' < 0.0001). (C) רגישות לקור. בדיקת הבדיקה הקרה בוצעה על ידי הצבת עכברים על מכשיר הצלחת הקרה מקורר ל -9 מעלות צלזיוס. חביון לנסיגה נרשם כזמן בשניות ממיקום העכבר על המכשיר ועד שהעכבר מתחיל להרים רגל, ללקק או לרעוד. בנתונים המוצגים, גשושית קרה מקוררת ל -9 מעלות צלזיוס הונחה מתחת לכפו האחורית של העכבר בזמן שהעכבר כלוא בכלוב על גבי רשת תיל. כל העכברים נבדקו 1-3 שבועות לאחר ההזרקה. עכברי CBP (n = 4 זכרים, 6 נקבות) הראו רגישות מוגברת משמעותית לקור בהשוואה לקבוצת הביקורת התמימה (n = 2 זכרים, 4 נקבות). מבחן t דו-זנבי מאן-ויטני בוצע כדי לבדוק מובהקות (p = 0.0002). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

בדיקות התנהגותיות הקשורות Nociceptive וניתוח נתונים
אמצעים מעוררים
רגישות יתר בכרית כף הרגל מתפתחת תוך יום מהזרקת אורוקינאז. בתוך שבוע אחד, סף הנסיגה יורד באופן משמעותי ונמשך עד המתת חסד; זה מוצג בשבוע 4 שלאחר הניתוח (איור 4A). חביון נסיגת כפות מנותח באמצעות ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מודל זה של כאבי גב כרוניים הוא פשוט לגרמה, ורגישות יתר שנקבעה תוך שבוע אחד יכולה להימשך עד (ואולי מעבר) 8 שבועות. זה מאפשר מחקר מדויק של מצב הכאב הכרוני בניגוד למודלים אקוטיים אחרים שנמשכים רק שבוע או שבועיים. בעוד אנו מראים את המודל בעכברים, מודל CBP המושרה על ידי uPA יכול להיות מבוסס גם בחולדות...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animals and Consumables
70% ethanol	Local Source
BALB/c mice	Envigo		20-25 g
Cotton balls	Fisher Scientific	19-090-702
Cotton-tipped applicators	Fisher Scientific	19-062-616
Isoflurane inhalant anesthetic	MedVet	RXISO-250
Labeling tape	Fisher Scientific	NGFP7002
Nitrile exam gloves	Fisher Scientific
Oxygen tank	Local Source
Surgical drape, Steri-Drape Utility Sheet, Absorbent Prevention	VWR	76246-788	cut into 15 x 15 cm pieces
Tygon tubing with 3 mm inner diameter	Grainger	22XH87
Equipment
#11 carbon steel scalpel blades	VWR	21909-612
Anesthesia induction chamber	Summit Medical Equipment Company	AS-01-0530-LG
Autoclave	Local Unit
Biology Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-30
Glass bead sterilizer Germinator 500	VWR	102095-946
IITC Life Sciences Series 8 Model PE34 Hot/Cold Plate Analgesia Meter	IITC	PE34
Integra Miltex cotton & dressing pliers	Safco Dental Supply	66-317
OPTIKA CL31 double arm LED illuminator	New York Microscope Company	OPCL-31
Plantar Test System with InfraRed Emitter, i. e. Hargreaves Apparatus	Ugo Basile	37370-001 and 37370-002
Scalpel Handle No. 3	VWR	25607-947
Small animal heating pad	Valley Vet Supply	47375
Student Vannas spring scissors, straight blade	Fine Science Tools	91500-09
Table top animal research portable anesthesia workstation “PAM”	Patterson Scientific	AS-01-0007
Von Frey Filaments	Ugo Basile	37450-275