בדיקת תרופות אורגנואידיות של גידולים רב-פרמטריים באמצעות הדמיית תאים חיים של Widefield לניתוח בתפזורת ואורגנואיד יחיד

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה אוטומטית למחצה לבדיקות סמים אורגנואידיות בתפוקה בינונית עד גבוהה ותוכנת ניתוח תמונה אוטומטית אגנוסטית למיקרוסקופ לכימות ולהמחשה של תגובות תרופתיות רב-פרמטריות בעלות אורגנואיד יחיד ללכידת הטרוגניות תוך-גופית.

Abstract

אורגנואידים סרטניים שמקורם בחולה (PDTOs) טומנים בחובם הבטחה גדולה למחקר פרה-קליני ותרגום ולחיזוי תגובת הטיפול בחולה מהקרנות של תרופות ex vivo . עם זאת, מבחני בדיקת התרופות הנוכחיים המבוססים על אדנוזין טריפוספט (ATP) אינם לוכדים את המורכבות של תגובת תרופה (ציטוטסטטית או ציטוטוקסית) והטרוגניות תוך-סרטנית שהוכחה ככזו שנשמרת ב-PDTOs עקב קריאה בתפזורת. הדמיית תאים חיים היא כלי רב עוצמה להתגבר על בעיה זו ולדמיין תגובות לתרופות בצורה מעמיקה יותר. עם זאת, תוכנת ניתוח תמונה לרוב אינה מותאמת לתלת-ממדיות של PDTOs, דורשת צבעי כדאיות פלואורסצנטיים, או שאינה תואמת לפורמט microplate של 384 בארות. מאמר זה מתאר מתודולוגיה חצי אוטומטית לזרע, טיפול ותמונה של PDTOs בפורמט בעל תפוקה גבוהה של 384 בארות תוך שימוש במערכות הדמיה קונבנציונליות, רחבות שדה ותאים חיים. בנוסף, פיתחנו תוכנה לניתוח תמונות ללא סמני כדאיות כדי לכמת מדדי תגובה לתרופות המבוססים על קצב גדילה המשפרים את יכולת ההתרבות ומתקנים שינויים בקצב הצמיחה בין קווי PDTO שונים. באמצעות מדד התגובה לתרופות מנורמלות, אשר מדרג את תגובת התרופה בהתבסס על קצב הגדילה המנורמל למצב בקרה חיובי ושלילי, וניתן להבחין בקלות בין צבע מוות של תאים פלואורסצנטיים, תגובות ציטוטוקסיות ותרופות ציטוטסטטיות, מה שמשפר באופן עמוק את הסיווג של מגיבים ושאינם מגיבים. בנוסף, הטרוגניות של תגובת תרופה יכולה לכמת מניתוח תגובה של תרופה חד-אורגנואידית כדי לזהות שיבוטים פוטנציאליים ועמידים. בסופו של דבר, שיטה זו נועדה לשפר את הניבוי של תגובת הטיפול הקליני על ידי לכידת חתימת תגובה רב-פרמטרית לתרופה, הכוללת מעצר גדילה קינטי וכימות מוות של תאים.

Introduction

בשנים האחרונות, גילוי תרופות לסרטן במבחנה , בדיקת תרופות ומחקרים בסיסיים עברו משימוש במודלים מסורתיים של סרטן דו-ממדי (2D) עם קווי תאים אימורטליים למודלים רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית של סרטן תלת-ממדי (3D). זה דרבן את האימוץ של ספרואידים סרטניים עם קווי תאים סרטניים מבוססים, אשר משחזרים אינטראקציות מורכבות יותר בין תאים ומבנים הקיימים בגידולים מוצקים. כיום, אורגנואידים של גידולים שמקורם בחולה (PDTOs) הם מודל הסרטן התלת-ממדי המתקדם והרלוונטי ביותר מבחינה פיזיולוגית הזמין לחקר סרטן במבחנה , שכן הם מספקים יתרונות נוספים על פני ספרואידים סרטניים, כלומר ההטרוגניות שנמצאת בחולי סרטן¹. PDTOs נוצרים מרקמת גידול שמקורה בחולי סרטן, ולכן שומרים הן על פנוטיפ הגידול והן על הגנוטיפ. ככאלה, PDTOs הופכים להיות יקרי ערך עבור מחקר סרטן בסיסי ותרגום ויש להם את הפוטנציאל לשפר מאוד אונקולוגיה מדויקת².

למרות הפוטנציאל המבטיח שלהם, מודלים מתוחכמים אלה של סרטן תלת-ממד במבחנה אינם מנוצלים לעתים קרובות בשל היעדר שיטות ניתוח מתקדמות. הבדיקה הנפוצה ביותר קובעת את מספר התאים בני קיימא ב- PDTO באמצעות כימות של ATP³ תוך תאי. מבחנים אלה הם בדרך כלל ניתוחים חד-פעמיים בתפזורת, ובכך מתעלמים מתגובות תלויות זמן קריטיות ומזניחים תגובות קלונליות. באופן ספציפי, היכולת לעקוב אחר הצמיחה של PDTOs (קצב גדילה) ותגובתם לטיפולים ספציפיים היא בעלת עניין רב ^4,5. תגובת התרופה המנורמלת (NDR), אשר מדרגת את תגובת התרופה בהתבסס על קצב הצמיחה המנורמל למצב חיובי (ctrl+) ובקרה שלילית (ctrl-), דווחה לאחרונה גם היא כמדד מכריע להערכת רגישות לתרופות לסרטן באמצעות הקרנה מבוססת תאים, אם כי הדבר נעשה בעיקר עבור קווי תאים דו-ממדיים⁶. לכן, יש צורך בשיטות ניתוח מתוחכמות יותר כדי לנצל באופן מלא את המודלים התלת-ממדיים המייצגים והמורכבים יותר מבחינה קלינית של סרטן. מיקרוסקופיה נחשבת לגישה רבת עוצמה לחקר המורכבות של מודלים אורגנואידים אלה⁷.

מאמר זה מתאר שיטה לניטור תגובות של תרופות קינטיות במודלים תלת-ממדיים של סרטן, תוך שימוש במיקרוסקופים קונבנציונליים רחבים ובמערכות הדמיה של תאים חיים. נעשו התאמות לפרוטוקול שתואר על ידי Driehuis et ^al.4 כדי להיות תואם לאוטומציה באמצעות רובוט פיפטינג, מתקן תרופות דיגיטלי ומערכת הדמיה של תאים חיים כדי להגביר את יכולת ההתרבות ולהפחית את מספר שעות העבודה 'המעשיות'. שיטה זו מאפשרת הקרנה של תרופות בתפוקה בינונית עד גבוהה של שני הספרואידים של הגידול עם קווי תאים סרטניים מבוססים (ראו טבלה משלימה S1 עבור קווי התאים שנבדקו), כמו גם של PDTOs, בפורמט של 384 מיקרו-פלטות ומולטי-אורגנואידים. על ידי שימוש בתהליך למידת מכונה קונבולוציוני ברשת, זיהוי ומעקב אוטומטיים של כדורואידים סרטניים בודדים או PDTOs יכולים להתבצע אך ורק מהדמיית שדה בהיר וללא שימוש בצבעי תיוג פלואורסצנטיים של תאים חיים⁸. יש לכך יתרון רב, שכן רוב הזיהוי עם הדמיית שדה בהיר דורש ביאור ידני (שהוא מייגע וגוזל זמן) או דורש תוספת של צבעים פלואורסצנטיים, שיכולים לבלבל תגובות תרופתיות הקשורות לעקה חמצונית הנגרמת על ידי פוטוקסיטי⁹.

תוכנת ניתוח התמונה המתקבלת שפותחה בתוך החברה מרחיבה את הפונקציונליות של מערכות הדמיה קונבנציונליות של תאים חיים, מכיוון שמודולי ניתוח תמונה תלת-ממדיים אינם זמינים, מוגבלים בפלטפורמה או אינם תואמים למיקרו-לוחות של 384 בארות והדמיה של באר שלמה. בנוסף, מודולים אלה הם לעתים קרובות במחיר גבוה ומציעים קריאות אורגנואידים בתפזורת מוגבלת. לכן, שיטה זו רלוונטית מאוד למדענים שיש להם גישה למערכות הדמיה של תאים חיים הזמינות באופן נרחב ומטרתם לחלץ מידע רב יותר על תגובה לתרופה בהשוואה לבדיקה מבוססת ATP בתקן זהב אך בסיסית. עם תוספת של אינדיקטורים ספציפיים למוות תאי, ניתן להבחין בין תגובות תרופות ציטוטסטטיות לבין תגובות ציטוטוקסיות, ובכך לספק תובנה נוספת לגבי פעולות תרופה מכניסטיות שאינן ניתנות להשגה כיום מניתוח נקודת זמן אחת. לבסוף, הדמיית תאים חיים מאפשרת מעקב אחר אורגנואידים בודדים כדי לקבל מדדי תגובה של תרופה אורגנואידית יחידה כדי ללכוד הטרוגניות של תגובה ולזהות תת-מולקולות עמידות פוטנציאליות.

המטרה של שיטה זו והתוכנה הנלווית לניתוח תמונות היא ליישם אוטומציה בעלות נמוכה בסינון תרופות אורגנואידיות כדי להגביל את התערבות המשתמש ולהפחית את השונות בטיפול, ניתוח תמונות וניתוח נתונים. כדי להפוך תוכנה זו לזמינה לחוקרים, היא אגנוסטית למיקרוסקופ ולפלטפורמה, ואפליקציה מבוססת ענן זמינה. לפיכך, על ידי תמיכה במערכות הדמיה קונבנציונליות של תאים חיים, אנו שואפים גם לשפר את הפונקציונליות שלהן עבור יישומים וניתוח תלת-ממדיים.

Protocol

נעשה שימוש באורגנואידים שמקורם בסרטן הלבלב האנושי (PDAC) שמקורם בחולה. שברי כריתת רקמות התקבלו מחולים שעברו ניתוח מרפא בבית החולים האוניברסיטאי של אנטוורפן. הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל המטופלים, והמחקר אושר על ידי ועדת האתיקה של UZA (ref. 14/47/480). פרטים הקשורים לכל החומרים, הריאגנטים, הציוד והתוכנות המשמשים בפרוטוקול זה מסופקים בטבלת החומרים. סקירה כללית של זרימת העבודה מוצגת באיור 1. נתונים לדוגמה מסופקים בחומר המשלים כדי לשחזר את הפרוטוקול.

1. יום 0: הכנת אורגנואידים בני יומיים או שלושה

1. מחממים את המיקרו-פלטות ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה ומפשירים את המטריצה החוץ-תאית (ECM) ב-4 מעלות צלזיוס.
2. הכן מדיום תרבית אורגנואידית מלאה של PDAC: תוסף ADF+++ (DMEM/F12 מתקדם, תוסף גלוטמין 1%, 1% HEPES ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין) עם 0.5 nM חלבון פונדקאי-Fc-Fusion, 4% מדיום מותנה של חלבון פיוז'ן Noggin-Fc, 4% מדיום מותנה של חלבון פיוז'ן Rpso3-Fc, 1x B27, 1 mM N-אצטיל ציסטאין (NAC), 5 mM ניקוטין-אמיד, 500 ננומטר A83-01, 100 ננוגרם/מ"ל FGF10 ו-10 ננומטר גסטרין).
3. להקים את PDTOs על פי שיטת הבחירה.
   הערה: פרוטוקול מפורט מסופק על ידי Driehuis et al., המתאר את השיטה הקונבנציונלית להקמה, תרבות ומעבר PDTOs בכיפות ECM⁴.
4. באופן אנזימטי לנתק את האורגנואידים בכיפות ECM.
   1. שאפו את המדיום ושטפו פי 1 עם מי מלח עם אגירת פוספטים (PBS). הוסיפו אנזים דיסוציאציה (לדוגמה, 2 מ"ל במיקרו-פלטה של 6 בארות) ופיפטה למעלה ולמטה פי 10 עם פיפטה של 1 מ"ל כדי לנתק מכנית את האורגנואידים ואת כיפות ה-ECM.
   2. דגירה במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, פיפטה למעלה ולמטה, ולבדוק אם האורגנואידים מנותקים לתאים בודדים. חזור על שלב זה במידת הצורך.
   3. אסוף את מתלה התא בצינור של 15 מ"ל, הוסף ADF+++ לנפח של 10 מ"ל, צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-450 × גרם בטמפרטורת החדר, ושאף את הסופרנטנט עם פיפטה פסטר ומשאבת יניקה.
   4. יש להשעות את הכדור ב-100-200 μL של מדיום מלא בהתאם לגודל הכדור ולספור את מספר התאים בשיטה המועדפת. לדוגמה: לערבב 10 μL של מתלה התא + 10 μL של Trypan Blue ולספור עם מונה תא אוטומטי.
5. צלחת תאים בודדים בכיפות ECM.
   1. יש לדלל את מתלה התא ולהוסיף 2/3 ECM בהתאם לטבלה 1. פיפטה עד עשר טיפות 20 μL לכל באר בצלחת 6 בארות שחוממה מראש. להפוך את הצלחת ולדגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
   2. כיסוי עם מדיום מלא בתוספת 10 μM Y-27632 ודגירה במשך 2-3 ימים באינקובטור.
      הערה: עשר כיפות המכילות 75,000 תאים כל אחת מספיקות בדרך כלל כדי למלא מיקרו-פלטה אחת של 384 בארות בריכוז של 200 אורגנואידים/באר, לא כולל הבארות שבקצה.

2. ימים 2 - 3: קציר וזרעים אורגנואידים בני יומיים או שלושה

1. לאסוף אורגנואידים שלמים מכיפות ECM.
   הערה: אורגנואידים נוטים להידבק למשטחי פלסטיק (למשל, צינורות, קצות פיפטה). כדי להימנע מכך, ניתן לשטוף מראש כלי פלסטיק עם תמיסת אלבומין בסרום בקר (BSA)/PBS של 0.1%.
   1. שאפו את המדיום ושטפו 1x עם PBS. הוסיפו 1-2 מ"ל של תמיסת קצירת אורגנואיד קרה (4 מעלות צלזיוס) לצלחת של 6 בארות, בהתאם למספר כיפות ה-ECM, ודגרו על קרח על משטח טלטול למשך 10 דקות.
   2. פיפטה למעלה ולמטה עם פיפטה של 1 מ"ל כדי לנתק את כיפות ה- ECM, לדגור במשך 10 דקות נוספות על קרח, ולבדוק חזותית תחת מיקרוסקופ אם ה- ECM מנותק.
   3. אופציונלי: אם עדיפה חלוקת גודל אחידה יותר, סנן את המתלה דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לפני הצנטריפוגה.
   4. אסוף את האורגנואידים בצינור 15 מ"ל מצופה מראש ב-0.1% BSA/PBS, הוסף ADF+++ עד 10 מ"ל, וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב-200 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס. שאפו את הסופר-נאטנט והחזירו את הכדור בעד 1,000 μL של מדיום אורגנואידי PDAC מלא, תלוי בגודל הכדור כדי להשיג ריכוז של >6,000 אורגנואידים/מ"ל.
   5. ספרו את האורגנואידים בכל שיטת ספירה שתבחרו, רצוי שיטת ספירה מבוססת תמונה.
2. זרע את האורגנואידים.
   הערה: עיין בטבלת החומרים עבור הנפח/הבאר המינימליים עבור שני סוגים שונים של לוחות מיקרו-פלטות 384-well המשמשים בפרוטוקול זה.
   1. יש לדחוס מראש את כל כלי הפלסטיק בטמפרטורה של -20°C או על קרח למשך 20 דקות לפחות לפני השימוש כדי למנוע התמצקות של ה-ECM.
   2. הכן את תמיסת הזריעה מתמיסת המלאי האורגנואידית 1 מ"ל (שלב 2.1.6) תוך שימוש במדיום מלא עד זרע ~ 200 אורגנואידים לבאר ב- 50 μL, הנפח המינימלי המשמש למילוי באר. השתמש בקובץ משלים 1 כדי לחשב את כמות תמיסת הזריעה האורגנואידית. הוסף נפח שיורי של 1,500 μL בעת שימוש במאגר של 25 מ"ל ובפיפטה רב-ערוצית או ברובוט פיפטינג.
   3. זרעו את האורגנואידים באמצעות רובוט פיפטינג.
      הערה: יש לקרר גם את תמיסת הזריעה וגם את המיקרו-פלטה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הפיפטינג כדי למנוע התמצקות של ה-ECM. לכן, מאגר של 25 מ"ל ומחזיק מיקרו-פלטה הודפסו בתלת-ממד כדי לשמש בשילוב עם רובוט הפיפטינג שיכול להכיל רכיבי קירור המפורטים בטבלת החומרים. קבצי STL להדפסה תלת-ממדית של תוכנות המעבדה המותאמות אישית (קובץ משלים 2 וקובץ משלים 3) וקבצי JSON מותאמים אישית של labware עבור הרובוט pipetting (קובץ משלים 4 וקובץ משלים 5) מסופקים.
      1. עצב את פרוטוקול החלוקה באמצעות כלי מעצב הפרוטוקולים המקוון. קובץ JSON לדוגמה (קובץ משלים 6) מסופק, שבו labware מותאם אישית כבר נטען פיפטה p300 (Gen2) שמונה ערוצים עם טיפים pipette המתאימים משמש.
      2. פתח את אפליקציית בקרת הרובוט pipeting, בחר פרוטוקולים, לחץ על ייבוא וגרור ושחרר קובץ משלים 6 לשדה המיועד.
      3. בחר את הפרוטוקול המיובא והנח את כל כלי המעבדה, כולל רכיבי קירור וכלי פלסטיק, בחפיסות בהתאם לפריסה המוצגת בשדה הגדרת הסיפון . השתמש בחריץ השמאלי עבור המאגר 25 מ"ל ואלמנט הקירור כפי שמוצג בקובץ משלים 7.
      4. לחץ על פרוטוקול הפעלה והמשך להתקנה. פתח את הכרטיסייה הגדרת Labware, לחץ על הפעל בדיקת מיקום Labware ופעל לפי ההוראות כדי לכייל את הרובוט pipetting לחומרה החדשה.
         הערה: ניתן לאחסן נתוני הסטה של Labware למועד מאוחר יותר, אך מומלץ להפעיל את בדיקת המיקום של תוכנת המעבדה לפני כל הפעלה.
      5. מלא את מאגר 25 מ"ל (ממוקם על גבי אלמנט הקירור) עם פתרון זריעת אורגנואיד מקורר ולחץ על התחל לרוץ.
         הערה: הבארות העליונות והתחתונות מתמלאות גם בתמיסת תרחיף אורגנואידי עקב השימוש בפיפטה בעלת שמונה התעלות.
      6. צנטריפוגה את המיקרופלטה למשך דקה אחת ב 100 × גרם ב 4 מעלות צלזיוס.
      7. דגירה ב-37°C למשך 30 דקות לפחות.
      8. מלא את הבארות הריקות החיצוניות בלפחות 50 μL של H₂O כדי למנוע אידוי.
      9. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי להסיר בועות בבאר שיכולות להפריע לניתוח התמונה.

3. יום 4: טיפול תרופתי וחלוקת ריאגנטים עם מתקן סמים דיגיטלי

1. צור את פרוטוקול חלוקת התרופות באמצעות תוכנת הבקרה הדיגיטלית של מתקן התרופות.
   1. רחף מעל לוח 1 מעל פריסת הלוחית, בחר תכונות לוח עריכה ומלא את סוג הלוח: 384 היטב, נפח נוסף (μL): 50, ומגבלת DMSO (%): 1.
   2. הוסף נוזלים על ידי לחיצה על כפתור + לצד נוזלים. לחץ פעמיים על הנוזל החדש שנוצר ותן לו שם; בחר מחלקה (מבוססת DMSO או מימית+Tween 20) וריכוז.
      הערה: יש להמיס את כל התרופות והריאגנטים ב-100% DMSO או ב-0.3% Tween-20. ניתן להשתמש בפתרון מלאי של 1-10 mM, תוך התחשבות בריכוז DMSO מרבי של <1%. טבלה 2 מספקת דוגמאות לדילולים הנדרשים עבור ריאגנטים וטיפולים פלואורסצנטיים נפוצים.
   3. פריסת לוחות
      1. עבור טיטרציה סמים, בחר בארות ולחץ על טיטרציה. עבור נוזל, בחר את התרופה המעניינת, בחר את הריכוז הגבוה ביותר (למשל, 2,000 ננומטר) ואת הריכוז הנמוך ביותר (למשל, 10 ננומטר); למשכפלים, בחרו מינימום 2 ובחרו בתבנית הטיטרציה הרצויה.
         הערה: תבנית הטיטרציה תהיה תלויה בגורמים רבים, כולל כמה תרכובת יש להתאים לצלחת אחת, האם הבארות צריכות להיות אקראיות, ומספר השכפולים והפקדים.
      2. לקבלת שליטה חיובית, בחר שלוש בארות, לחץ על הגדר ערך, ומלא 2 μM staurosporine מתוך 10 mM מלאי ב- DMSO, אשר יגרום למוות תאים מקסימלי.
      3. עבור Cytotox Green, בחר את כל הבארות המשומשות, לחץ על הגדר ערך והזן 60 ננומטר / טוב.
         הערה: צביעת הפלואורסצנט הירוקה של Cytotox מציינת תאים שמתו, ולכן לא תפריע לניטור התגובה התרופתית. כאן, אין צורך בסמן פלואורסצנטי לתאים חיים.
      4. עבור הבקרה השלילית ונורמליזציה של DMSO, בחר את כל הבארות עם ארבע בארות נוספות לבקרת הרכב, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני, בחר נורמליזציה, בחר נרמל את מחלקת הנוזלים: מבוסס DMSO, ונרמל לנפח המחלקה הגבוהה ביותר כדי לקבל ריכוז DMSO שווה בכל באר.
         הערה: ריכוזי DMSO צריכים להיות <1%. קובץ טיטרציה של תרופות TDD לדוגמה (קובץ משלים 8) מסופק.
      5. לחץ על החץ תחת הפעלה בפינה השמאלית העליונה, בחר תמיד לדמות ולחץ על הדמיה כדי לזהות שגיאות ולקבל את הנפחים של כל תרופה להיות מוכן.
         הערה: כדי להתגבר על אזהרה כאשר נפח החלוקה הראשוני נמוך מדי, "מומלץ להוציא באר אזהרה של 30 nL ומעלה עבור כל נוזל בכל צלחת", בחר שתי בארות בקצה המלאות במים, בחר הגדר ערך והזן 10 μM של התרופה שעבורה מתרחשת האזהרה. זה primes מחסנית התרופה עם נפח גבוה מ 30 nL. ניתן להשתמש באותן בארות כדי להכין את מחסנית ה-DMSO על-ידי הגדרת נורמליזציה ל-% מערך הנפח הכולל (לדוגמה, 0.5%).
2. בטל את הסימון של 'הווה תמיד ' מתחת ללחצן ' הפעלה' ; לחץ על הפעל כדי להתחיל את פרוטוקול חלוקת התרופות ופעל לפי ההוראות.
3. מרחו את קרום האיטום על המיקרו-פלטה כדי למנוע אידוי.
4. לדגום את הצבע הירוק Cytotox 1-2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור ולהמשיך לשלב 4.

4. רכשו תמונות עם הדמיית התא החי

הערה: עבור קצב הצמיחה ו- NDR, יש לרכוש סריקה בנקודת זמן 0 (T0 = התחל טיפול) 1-2 שעות לאחר הוספת Cytotox Green.

1. פתח את תוכנת בקרת התמונות של תאים חיים, בחר עורך שיטות חדש, עבור אל קובץ > ייבוא ובחר את קובץ XML של השיטה לדוגמה (קובץ משלים 9). לחלופין, צור קובץ חדש ובחר לוח: (CORE384fb_OpticalImaging) - קורנינג 384 שחור שטוח (קורנינג #4588), ללא מכסה וללא קלטת לחות; יישום: תמונות בלבד; מטרה: 4x; דוגמא: מרכזי; בדוק ערוצים ברייטפילד וירוק (עוצמת LED (%) = 40; זמן חשיפה (ms) = 200).
   הערה: הגדרות הערוץ הירוק פועלות היטב עבור ריכוז של 60 nM Cytotox ירוק. ניתן להשתמש באפשרות 'מציג חי' כדי להתאים את היסט המיקוד ו/או את הגדרות ה-LED בזמן אמת.
2. לחץ על התחל כדי להתחיל סריקה ב- T0.
3. חזור על הסריקה כל 24 שעות למשך עד 5 ימים באותה שיטה. לחלופין, כדי להפעיל את מדידת ההילוך בזמן באופן אוטומטי, התאם את השיטה בתוכנת בקרת התמונות של תאים חיים לניסוי קינטי על-ידי לחיצה וגרירה של הכרטיסייה 'לולאה קינטית' לשדה השיטה. באופן דומה, יש לגרור את כרטיסיות הטמפרטורה והגז לשדה השיטה כדי להגדיר את המערכת ל-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ כדי להבטיח את התנאים הנכונים בתוך ההדמיה של התא החי במהלך הניסוי.

5. ניתוח תמונות ונתונים

1. מיזוג ודחיסה של נתונים
   1. תוכנת Control של הדמיית תאים חיים יוצרת תיקייה עבור כל סריקה בכל נקודת זמן. צור תיקיה חדשה, העתק את תיקיות הניסוי הבודדות לתיקיית האב החדשה והוסף _0h, _24h, _48h, _72h, _96h ו - _120h לשמות תיקיות הניסוי המתאימות.
   2. הכן מפת צלחות XLSX מתוכנת הבקרה של מתקן התרופות הדיגיטלי על ידי לחיצה ימנית על פריסת מפת הלוחות מפרוטוקול חלוקת התרופות והעתק את כל הבארות; הדבק את הנתונים בקובץ XLSX. הסר את הנתונים של Cytotox Green ו-staurosporine והוסף מטריצה עבור Cell Line ו-Replicate. הזן ctrl- ו- ctrl+ . ראה קובץ משלים 10 למפת לוחות לדוגמה.
   3. פתח את כלי דחיסת הנתונים, לחץ על עיון, בחר את תיקיית האב ולחץ על הפעל כדי ליזום דחיסת נתוני תמונה. כל קבצי התמונה של TIFF עבור נקודות הזמן השונות נדחסים ל- HDF5 יחיד עבור כל באר בתיקיית ערכות נתונים חדשה בתוך תיקיית ההורים.
2. ניתוח תמונות
   1. עבור אל פלטפורמת webapp לניתוח תמונות, התחבר ולחץ על הוסף פרויקט חדש בכרטיסייה בית . הזן את שם הפרויקט, המשך, בחר הוסף ניסוי חדש והעלה את תיקיית ערכות הנתונים המכילה את קבצי HDF5.
   2. לאחר ההעלאה, עבור אל תיקיית הפרויקט והניסוי ולחץ על העלה Platemap לקבלת פונקציות נוספות. לחץ על הפעל ניתוח, בחר ניתוח רב-אורגני, פרמטרי ברירת מחדל ולחץ על נתח כדי ליזום ניתוח תמונה.
   3. לחץ על הורד תוצאות כדי להוריד את טבלאות הנתונים הגולמיים המכילות את המדידות עבור כל באר (למשל, שטח שדה בהיר כולל, שטח ירוק פלואורסצנטי כולל וכו ') ואת התמונות / הסרטונים המפולחים כדי לאשר את דיוק הניתוח ועיבוד נתונים נוסף.
3. מדדי תגובה לתרופות המבוססים על קצב גדילה ותגובה מנורמלת לתרופות
   1. בחר את קובץ Raw_NDR.xlsx מתיקיית התוצאות (נדרשת מפת לוחות) (קובץ משלים 11) וטען אותו ב- Official_NDR_7point R-script (קובץ משלים 12) כדי ליצור באופן אוטומטי טבלאות ערכים GR (מנורמל ל- ctrl-) ו- NDR (מנורמל ל- ctrl- ו- ctrl+) (קובץ משלים 13, קובץ משלים 14, קובץ משלים 15 וקובץ משלים 16 ). ערכי GR ו- NDR מחושבים מהפרמטר כפי שמוצג במשוואה (1) באמצעות סקריפט R (קובץ משלים 12).
      סה"כ שטח הישרדות = סה"כ שטח ברייטפילד - סה"כ שטח ירוק (1)
      כאשר 0 < NDR <1 = אפקט ציטוטסטטי (מעצר גדילה), ו- NDR < 0 = תגובה ציטוטוקסית (מוות תאי).
      הערה: תסריט ה-R עובד מ-Gupta et ^al.6.
   2. מהטבלה clonal_data.xlsx, אחזר נתוני תגובה של אורגנואיד יחיד והתווה אותם כמתווה בועה.
   3. השתמש בגורם Z¹⁰ כדי להעריך את איכות מסך התרופה של ריצה (ראה משוואה (2)). בטל ניסוי עם גורם Z < 0.5.
      (2)

תוצאות

פרוטוקול הפיפטינג האוטומטי מבטיח חלוקה שווה של PDAC_060 PDTOs בכל העמודות של המיקרו-פלטה בעלת 384 הבארות (איור 2A). כצפוי, נצפתה שונות במספר ובשטח הממוצע של PDTOs בין הבארות (איור 2A,B). שטח ההישרדות הכולל (שטח שדה בהיר כולל - שטח ירוק כולל) משלב את הסגמנטציה האורגנואידית נטולת התוויות עם אות המוות התאי המבוסס על פלואורסצנציה, והוא, מניסיוננו, הפרמטר החזק ביותר לחקר תגובות לתרופות לאורך זמן (איור 2C)⁸. כדי להסביר את השונות בזריעת התאים ובגודל האורגנואידים, יש להשתמש במדדים המבוססים על קצב גדילה כדי להפחית את השונות בין המשכפלים, כפי שמוצג על-ידי פסי השגיאה המופחתים באיור 2D לעומת איור 2C, וגורם Z גבוה יותר המצביע על שיפור משמעותי באיכות מסך התרופות (איור 2E).

עקומת תגובת המינון של NDR (איור 2G), המנורמלת ל-ctrl ו-ctrl+, עדיפה בבירור על עקומת תגובת המינון GR (איור 2F), המנורמלת ל-ctrl-, מכיוון שהיא מגדילה את ההפרדה של עקומות התגובה לתרופות ומייצגת בצורה מדויקת יותר תגובות של תרופות ציטוטוקסיות. דוגמה לתמונות המשויכות עבור ctrl-, ctrl+ ו-400 nM gemcitabine/80 nM שטופלו בפקליטקסל PDTO מוצגת באיור 3. תצפית מעניינת היא שההשפעה הציטוטוקסית של גמציטאבין הייתה דומיננטית בטיפול המשולב מכיוון שלא נצפה ערך מוסף של פקליטקסל.

לאחר מכן נעשה שימוש בשני קווי PDTO נוספים, PDAC_052 ו-PDAC_087. נצפה הבדל ברור בקצב הצמיחה בין קווים אלה (איור 4A), התומך בשימוש במדדי GR. שוב, עקומות תגובת המינון של NDR (איור 4C) גרמו לעלייה בטווח הדינמי ובהפרדה בין שלושת המטופלים השונים בהשוואה לעקומות GR (איור 4B). יתר על כן, הפרוטוקול מאפשר לקבוע NDR לאורך זמן ומראה כי PDAC_052 ו-PDAC_060 היו בעלי תגובה ציטוסטטית דומה מאוד למינון נמוך של gem-pac (איור 4D), בעוד שניתן היה לראות תגובה ציטוסטטית דיפרנציאלית ברורה לעומת תגובה ציטוטוקסית עבור המינון האמצעי (איור 4E) והמינונים הגבוהים (איור 4F) של gem-pac. תגובות התרופות האלה היו עקביות עם התגובות הקליניות שנצפו בחולים (איור 4G).

לבסוף, יתרון מרכזי של הגישה והתוכנה הוא שניתן לכמת תגובות של תרופות בעלות אורגנואיד יחיד כדי לחקור את ההטרוגניות של התגובה ולזהות תת-מולקולות שעשויות להיות עמידות. איור 5 מספק סקירה ברורה של הדינמיקה השבטית של החולים השונים ומראה כי PDAC-087 היה בעל התת-חלקיקים העמידים ביותר לאחר הטיפול, מה שעולה בקנה אחד עם המחלה האגרסיבית והעמידה מאוד שנצפתה בחולה. באופן מעניין, חולה זה היה גם הכי פחות רגיש ל- ctrl + staurosporin.

איור 1: מבט כולל על זרימת עבודה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: דיוק בזריעה ומדדי תגובה לתרופות . (A) ספירות/באר אורגנואידיות של PDAC_060 PDTOs שנזרעו במיקרו-פלטה של 384 בארות באמצעות רובוט הצינורות. כל נקודה מייצגת את הספירה בבאר אחת והמגרשים מופרדים על ידי עמודי המיקרו-לוחות בעלי 384 הבארות. (B) מתכוון לאזור PDTO/באר. (C) שטח הישרדות כולל (שטח שדה בהיר כולל - שטח ירוק כולל) ו- (D) קצב צמיחה (שטח הישרדות כולל מנורמל ל- T0 = 1) של PDAC_060 PDTOs שטופלו ביחס של 5:1 של גמציטאבין/פקליטקסל. (E) גורם Z כמדד לאיכות הבדיקה. (F) עקומת התגובה של קצב גדילה-מינון מנורמלת ל-ctrl- ו-(G) עקומת התגובה לתרופות מנורמלות ל-ctrl ו-ctrl+. קווי שגיאה מציינים ממוצע ± SD של שתי בארות. קיצורים: PDAC = אדנוקרצינומה של צינור הלבלב; PDTO = אורגנואיד גידול שמקורו בחולה; GR = קצב צמיחה; NDR = תגובת סמים מנורמלת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: תמונות לדוגמה. תמונות מייצגות של PDAC_060 PDTO שטופלו ברכב (ctrl-), 400 ננומטר גמציטאבין/80 ננומטר פקליטקסל, ו-2 מיקרומטר סטאורוספורין (ctrl+). העמודה השמאלית מציגה תמונות שדה בהיר, העמודה האמצעית מציגה את האות הפלואורסצנטי הירוק Cytotox, והעמודה הימנית מציגה את תמונות השדה הבהיר ללא תוויות באמצעות מודול הניתוח האורגנואידי. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: PDAC = אדנוקרצינומה של צינור הלבלב; PDTO = אורגנואיד גידול שמקורו בחולה; GemPac = gemcitabine/paclitaxel. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4: השוואת התגובה של תרופות בין-אשפוזיות . (A) השוואת קצב הצמיחה (בהתבסס על שטח ההישרדות הכולל) של קווי PDTO PDAC_052, PDAC_060 ו-PDAC_087. (B) עקומת התגובה של קצב גדילה-מינון מנורמלת ל-ctrl- ו-(C) עקומת התגובה לתרופות מנורמלות ל-ctrl- ו-ctrl+. NDR קינטי של (D) נמוך, (E) באמצע, ו-(F) מינון גבוה של גמציטאבין/פקליטקסל (יחס של 5:1). (G) המאפיינים הקליניים של חולי PDAC. קווי שגיאה מציינים ממוצע ± SD של שתי בארות. קיצורים: PDAC = אדנוקרצינומה של צינור הלבלב; PDTO = אורגנואיד גידול שמקורו בחולה; GR = קצב צמיחה; NDR = תגובת סמים מנורמלת; FFX = פולפירינוקס. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 5: מדדים אורגנואידיים בודדים. תגובת מינון אורגנואידית יחידה המבוססת על מוות תאי (אזור ירוק/אזור שדה בהיר) ואזור (שדה בהיר) של PDAC_052, PDAC_060 ו-PDAC_087 PDTOs שטופלו ברכב (ctrl-), 400 ננומטר גמציטאבין/80 ננומטר פקליטקסל, ו-2 מיקרומטר סטאורוספורין (ctrl+). אזורים ירוקים מצביעים על אורגנואידים בני קיימא; אזורים כחולים מציינים טווח x-as של חלקות GemPac ו- ctrl+. קיצורים: PDAC = אדנוקרצינומה של צינור הלבלב; PDTO = אורגנואיד גידול שמקורו בחולה; GemPac = gemcitabine/paclitaxel. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

מלאי מתלי תאים	תאים/שחרור	# טיפות (20 μL)	מלאי (1/3)	ECM (2/3)
1.13 × 107 תאים/מ"ל	75,000	10	75 יו"ל	150 מיקרוגרם
1.13 × 107 תאים/מ"ל	75,000	5	40 יו"ל	80 מיקרוגרם

טבלה 1: דילול לציפוי בכיפות ECM. קיצור: ECM = מטריצה חוץ-תאית.

תרכובת	ריכוז מניות	דילול	ריכוז עבודה	הממס	ריכוז טוב	הערות
ציטוקס ירוק	1 מ"מ (DMSO)	1/10	10 מיקרומטר	DMSO	60 נאנומטר	סמן מוות תאי
ציטוקס אדום	1 מ"מ (DMSO)	1/10	10 מיקרומטר	DMSO	250 נאנומטר	סמן מוות תאי
קספז 3/7 ירוק	5 דקות(DMSO)	1/2	2.5 מ"מ	DMSO	2.5 מיקרומטר	סמן אפופטוטי
הוכסט	20 מ"מ (גובה2או')	1/200	100 מיקרומטר	0.33% טווין/PBS	50 נאנומטר	סמן גרעיני
סטאורוספורין	10 מ"מ (DMSO)	/	1 - 10 דקות	/	2 – 5 מיקרומטר	שליטה חיובית
גמציטאבין	10 מ"מ (DMSO)	/	1 - 10 דקות	/	טיטרציה	כימותרפיה
פקליטקסל	10 מ"מ (DMSO)	/	1 - 10 דקות	/	טיטרציה	כימותרפיה
ציספלטין	5 mM (0.9% NaCl)	1/2	2.5 מ"מ	0.6% טווין/PBS	טיטרציה	כימותרפיה

טבלה 2: דוגמאות לדילולים של תרופות נפוצות וריאגנטים פלואורסצנטיים. כל תרכובת צריכה להיות מומסת ב-100% DMSO או 0.3% Tween/PBS.

טבלה משלימה S1: סקירה כללית של קווי תאים סרטניים תואמים. סטטי: ספרואידים אינם נודדים. מיזוג: הספרואידים נודדים זה לעבר זה ומתמזגים יחד. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 1: כלי חישוב פתרון זריעה אורגנואידית. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2: קובץ STL להדפסת תלת מימד של כלי מעבדה מותאמים אישית 'מחזיק Microplate'. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 3: קובץ STL להדפסת תלת מימד מותאמת אישית '2 x 25 מ"ל מחזיק מאגר'. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 4: קובץ JSON עבור רובוט צנרת מותאם אישית של תוכנות מעבדה 'מחזיק Microplate'. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 5: קובץ JSON עבור רובוט צנרת מותאם אישית '2 x 25 מ"ל מאגר Holder_WithCooler'. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 6: קובץ JSON לפרוטוקול רובוט צנרת 'Plating_ PDO_384well_Cooled_Row2-23'. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 7: סקירה כללית של הגדרת שולחן הרובוט pipeting. (A) רכיבי קירור ו-(B) מאגר ומיקרופלטה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 8: קובץ TDD לפרוטוקול של מתקן התרופות הדיגיטלי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 9: קובץ XML לפרוטוקול של תמונת התא החי להדמיית שדה בהיר ופלואורסצנטי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 10: מפת לוחות לדוגמה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 11: קובץ קלט לדוגמה עבור סקריפט NDR R. קיצור: NDR = תגובה מנורמלת לתרופות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 12: סקריפט NDR R מנורמל לתגובת תרופה. קיצור: NDR = תגובה מנורמלת לתרופות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 13: קובץ פלט לדוגמה של ערכי GR של סקריפט NDR R. קיצורים: GR = קצב צמיחה; NDR = תגובת סמים מנורמלת. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 14: קובץ פלט לדוגמה של סקריפט NDR R עם ערכי GR שעברו חילוף. קיצורים: GR = קצב צמיחה; NDR = תגובת סמים מנורמלת. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

S upplementary קובץ 15: קובץ פלט לדוגמה של ערכי NDR R script NDR. קיצור: NDR = תגובה מנורמלת לתרופות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 16: קובץ פלט לדוגמה של סקריפט NDR R עם ערכי NDR שעברו חילוף. קיצור: NDR = תגובה מנורמלת לתרופות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

בדיקת תרופות PDTO בתפוקה בינונית עד גבוהה מסתמכת לעתים קרובות על קריאות המחלימות רק שבריר מהמידע שהאורגנואידים עשויים לספק. יותר ויותר ברור שכדי שהטכנולוגיה האורגנואידית המתפתחת במהירות תממש פוטנציאל מדעי וקליני גדול יותר, נדרשים באופן קריטי מבחנים, קריאות ושיטות ניתוח תלת-ממדיות מתקדמות יותר. כאן מתואר צינור סינון מתקדם, אשר לא רק מגדיל את יכולת השחזור, אלא גם משפר במידה ניכרת את יכולת התרגום הקלינית על ידי שילוב קריאת הדמיה של תאים חיים המונעת על ידי בינה מלאכותית. בנוסף לתוכנת ניתוח שפותחה בתוך החברה, מיושם השימוש במדד התגובה התרופתית המנורמלת (NDR), המדגים בבירור את יכולתו להגדיר הבדלים ספציפיים למטופל בתגובה לטיפול⁶.

הכללתו של מדד נורמליזציה זה תהיה ללא ספק בעלת ערך עצום, ומזכירה כי מחקרים רבים שואפים להגדיר את תגובות הטיפול בהתבסס על הבדלים קלים באזור שמתחת לעקומה (AUC) או בריכוז מעכב חצי מקסימלי (IC₅₀) (שכן רוב עקומות המינון-תגובה חופפות/ממוקמות קרוב זו לזו)^11,12 . מדדי קצב הצמיחה כבר יושמו בפרוטוקולי סינון תרופות אורגנואידיות באמצעות הבדיקה מבוססת ATP, אך מסתמכים על הנורמליזציה של בארות ייחוס בנקודת זמן 0⁴. לעומת זאת, שיטה זו מאפשרת נורמליזציה של קצב גידול תוך-ביתי, אשר לא רק לוקחת בחשבון הבדלים בין-אשפוזיים בקצב הצמיחה של PDTO, אלא גם הבדלים בין-חיים הנובעים משינויים בצפיפות הזריעה והשפעות תלויות מיקום צלחת כדי להגדיל את יכולת השחזור. יתר על כן, התאמנו את ה- NDR כדי להגדיל עוד יותר את ההפרדה של תגובת PDTO בין-אשפוזית על ידי הכללת בקרה חיובית לנורמליזציה ^6,8.

יתר על כן, הניתוח, התואם לפורמטים של תפוקה גבוהה ואוטומציה, יכול לזהות במדויק תגובות אורגנואידיות בודדות, מה שמאפשר לכמת את ההתנגדות התת-שבטית - הכוח המניע העיקרי של הישנות הגידול והתקדמותו¹³. לדוגמה, למרות ש-PDAC052 ו-PDAC060 הראו תגובה טובה לטיפול במבחנה (בהתבסס על ה-NDR), הניתוח הנוסף של אורגנואיד יחיד הצליח לזהות אוכלוסייה קטנה (גדולה יותר עם PDAC060) של תת-קבוצות שאינן מגיבות לטיפול. מעניין, זה התכתב מאוד עם התצפית הקלינית, בהתחשב בכך PDAC052 ו PDAC060 היה תגובה עמידה (לא זוהתה פעילות הגידול) אבל בסופו של דבר שניהם אובחנו עם התקדמות הגידול המקומי (בשל נוכחות של שיבוטים עמידים). בהשוואה לקריאות התלת-ממד הקונבנציונליות (בדיקה מבוססת ATP וגודל/מספרים), צינור סינון מתקדם זה צפוי לשפר את ביצועי הניבוי על ידי חילוץ מידע רלוונטי יותר מבחינה קלינית מתוך 'מטופלים במעבדה' אלה. השערה זו נבדקת כעת על ידי סינון דגימות PDTO קליניות במעבדה של המחברים בשיטה זו כדי לתאם ex vivo עם תגובה in vivo ותוצאה קלינית.

כדי לקבל תובנות נוספות על המנגנונים של תגובה לתרופה, ריאגנטים קונבנציונליים להדמיית תאים חיים פלואורסצנטיים, בנוסף לצבעי ציטוטוקסיות, תואמים לשיטה זו כדי לחקור מנגנונים של מוות תאי. הראינו בעבר את התאימות של שיטה זו עם הריאגנט הירוק Sartorius Caspase 3/7 לחקר אינדוקציה תלוית קספאז של אפופטוזיס לאחר טיפול בסיספלטין⁸. התאימות עם צבעים אחרים לחקר עקה חמצונית (ריאגנטים של CellROX) או היפוקסיה (ריאגנטים של Image-iT Hypoxia) עדיין נבדקת. עם זאת, ריאגנטים אלה כבר שימשו בהצלחה מודלים 3D in vitro ^14,15.

תוכנת ניתוח התמונה תואמת גם לפורמטים אחרים של צלחות או לשיטות culturing (למשל, לוחות microcavity, כיפות ECM) אם ניתן ללכוד תמונות ברורות וממוקדות של האורגנואידים. לעתים קרובות זה מאתגר עבור אורגנואידים שגודלו בכיפות מכיוון שהם גדלים במישורי z שונים, מה שדורש פונקציונליות z-stacking של המיקרוסקופ שלא תמיד זמינה. לכן, אנו ממליצים להשתמש במיקרו-לוחות ULA 384-well בעלי תחתית שטוחה כדי להבטיח תמונות באיכות מספקת.

בנוסף, הניתוח תואם למערכות הדמיה אחרות של תאים חיים, כפי שהוצג בעבר עבור תמונות ניגודיות פאזה שצולמו עם מערכת זום IncuCyte⁸. מגבלה של מערכת ההדמיה של תאים חיים של Spark Cyto ששימשה בכתב יד זה היא הקיבולת של צלחת אחת למדידות קינטיות. עם זאת, הרחבת Spark Motion מגדילה את הקיבולת שלה לעד 40 מיקרו-לוחות שניתן למסך בכמויות גדולות. התאימות של התוכנה שפותחה בתוך החברה תורחב למערכות אלה ואחרות כדי להציע פתרון אגנוסטי לפלטפורמה, במטרה לתקנן ולהפוך צינורות ניתוח תמונה ונתונים לאוטומטיים. היישום מבוסס האינטרנט יכלול גם כלי גרפים אינטראקטיביים וחישובים אוטומטיים של מדדי תרופות, כפי שמוצג במאמר זה, כדי לקצר את זמן הניתוח הידני.

אלגוריתם הסגמנטציה PDTO נטול התוויות אומן ונבדק על מודלים שונים של ספרואידים ו-PDTO שגודלו בבית עם הבדלים מורפולוגיים מובהקים (מוצק, מוצק למחצה, ציסטי), וכתוצאה מכך יכול לזהות אותם בדיוק גבוה⁸. מגבלה של המודל היא שהכללת PDTOs ציסטיים הגבירה את הגילוי הלא רצוי של בועות הקיימות בבאר שלאחר הזריעה. עם זאת, דגירה במהלך הלילה הספיקה כדי להסיר את רוב הבועות הללו, מה שאפשר סריקה איכותית של נקודת זמן 0. הדיוק של פילוח התמונה האורגנואידית והשיטה צריכים להיות מאומתים על ידי משתמשים אחרים, ועל סמך המשוב שלהם, ניתן לאמן את התוכנה עוד יותר כדי להשיג אלגוריתם ניתוח תמונה חזק ואוטומטי. בנוסף, אנו שואפים להשיג נתונים קליניים נוספים כדי לתאם את תגובת התרופה ex vivo המכמתת בשיטה זו לתגובה הקלינית בחולה כדי לזהות את הפרמטרים הטובים ביותר לניבוי תגובת הטיפול ולהמשיך לפתח שיטה זו לרפואת סרטן מדויקת תפקודית¹⁶.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	Greiner	657160
8-Channel p300 (GEN 2) pipette	Opentrons
300 µL Tips	Opentrons
384-well flat-bottom ULA microplate	Corning	4588	minimum volume 50 µL
384-well flat-bottom ULA Phenoplate	Perkin Elmer	6057802	minimum volume 75 µL
A8301	Tocris Bioscience	2939
ADF+++			Advanced DMEM/F12, 1% GlutaMAX, 1% HEPES, 1% penicillin/streptomycin
Advanced DMEM/F-12	ThermoFisher Scientific	12634
B27	ThermoFisher Scientific	17504044
Breathe easy sealing membrane	Sigma-Aldrich	Z380059
Caspase 3/7 Green	Sartorius	4440
Cell Counting Slides for TC10/TC20	Bio-Rad Laboratories	1450017
CellTiter-Glo 3D	Promega	G9681	ATP-assay
Cooler for 25 mL reservoir	VWR (Diversified Biotech)	490006-908
Cooling element 12 x 8 x 3 cm	Bol.com	9200000107744702	For custom microplate holder OT-2
Cultrex Organoid Harvesting Solution	R&D systems	3700-100-01
Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2	R&D systems	3533-010-02	extracellular matrix (ECM)
Cytotox Green	Sartorius	4633
Cytotox Red	Sartorius	4632
D300e	Tecan		Digital drug dispenser
D300e Control v3.3.5	Tecan		Control software D300e
FGF10	Peprotech	100-26
Full Medium			ADF+++ supplemented with 0.5 nM WNT surrogate-Fc-Fusion protein, 4% Noggin-Fc Fusion Protein conditioned medium, 4% Rpso3-Fc Fusion Protein conditioned medium, 1x B27, 1 mM N-acetyl cysteine (NAC), 5 mM nicotinamide, 500 nM A83-01, 100 ng/mL FGF10, and 10 nM Gastrin
Gastrin	Sigma-Aldrich	G9145
Gemcitabine	Selleck Chemicals	S1714
GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	35050
HEPES	ThermoFisher Scientific	15630056
Hoechst 33342 Solution (20 mM)	ThermoFisher Scientific	62259
Human pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) patient-derived organoids	Biobank@uza (Antwerp, Belgium; ID: BE71030031000; Belgian Virtual Tumorbank funded by the National Cancer Plan)
N-acetyl-cysteine	Sigma-Aldrich	A9165-25G
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636-100G
Noggin-Fc Fusion Protein conditioned medium	Immunoprecise	N002
Opentrons App v6.0.1	Opentrons		OT-2 control software
Opentrons Protocol Designer Tool	Opentrons		https://designer.opentrons.com/
Orbits data compression tool			www.orbits-oncology.com or contact corresponding author
Orbits image analysis webapp	University of Antwerp		www.orbits-oncology.com or contact corresponding author
OT-2	Opentrons		Pipetting robot
Paclitaxel	Selleck Chemicals	S1150
Pasteur Pipette 230 mm	Novolab	A33696
Peniciline-Streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140
Prism 9	GraphPad
Rspo3-Fc Fusion Protein conditioned medium	Immunoprecise	N003
Spark Cyto 600	Tecan		Live-cell imaging and multi-mode platereader
SparkControl v3.1	Tecan		Spark Cyto control software
Staurosporine	Tocris Bioscience	1285
Sterile 25 mL reservoir	VWR (Diversified Biotech)	10141-922
T8 plus cassette	Tecan
TC20	Bio-Rad Laboratories		automated cell counter
TrypLE	ThermoFisher Scientific	12604-021	dissociation enzyme
Tween-20	Acros Organics	233360010
WNT Surrogate-Fc-Fusion protein	Immunoprecise	N001
Y-27632	Selleck Chemicals	S1049