פרוטוקול לבניית מודל פצע חולדה של סוכרת מסוג 1

Summary

מודל פצעי הסוכרת הנגרמים על ידי סטרפטוזוצין בחולדות SD זכרים הוא כיום המודל הנפוץ ביותר לחקר ריפוי פצעים בסוכרת מסוג I. פרוטוקול זה מתאר את השיטות המשמשות לבניית מודל זה. הוא גם מציג ומתייחס לאתגרים פוטנציאליים ובוחן את ההתקדמות ואת המאפיינים האנגיוגניים של פצעים סוכרתיים.

Abstract

מינון גבוה אחד של הזרקת סטרפטוזוטוצין ואחריו כריתת עור בעובי מלא על גבי חולדות היא שיטה נפוצה לבניית מודלים של בעלי חיים של פצעי סוכרת מסוג 1. עם זאת, מניפולציה לא נכונה עלולה להוביל לחוסר יציבות במודל ולתמותה גבוהה בחולדות. למרבה הצער, יש מעט הנחיות קיימות על מודלים פצע סוכרת סוג 1, והם חסרים פירוט ואינם מציגים אסטרטגיות התייחסות ספציפיות. לכן, פרוטוקול זה מפרט את ההליך המלא לבניית מודל פצע סוכרתי מסוג 1 ומנתח את ההתקדמות והמאפיינים האנגיוגניים של פצעי הסוכרת. מידול פצע סוכרתי מסוג 1 כולל את השלבים הבאים: הכנת הזרקת סטרפטוזוטוצין, השראת סוכרת מסוג 1 ובניית מודל הפצע. אזור הפצע נמדד ביום ה-7 וביום ה-14 לאחר הפציעה, ורקמות העור של החולדות הוצאו לצורך ניתוח היסטופתולוגי ואימונופלואורסצנטי. התוצאות הראו כי סוכרת מסוג 1 הנגרמת על ידי סטרפטוזוטוצין במינון 55 מ"ג/ק"ג הייתה קשורה לתמותה נמוכה יותר ולשיעור הצלחה גבוה. רמות הגלוקוז בדם היו יציבות יחסית לאחר 5 שבועות של זירוז. שיעור ריפוי פצעי הסוכרת היה נמוך משמעותית מזה של פצעים רגילים ביום 7 וביום 14 (p < 0.05), אך שניהם יכלו להגיע ליותר מ -90% ביום ה -14. בהשוואה לקבוצה הרגילה, סגירת שכבת האפידרמיס של פצעי סוכרת ביום ה -14 לא הייתה שלמה ועיכבה אפיתל מחדש ואנגיוגנזה נמוכה משמעותית (p < 0.01). מודל פצעי סוכרת מסוג 1 שנבנה על בסיס פרוטוקול זה הוא בעל מאפיינים של ריפוי פצעים כרוניים, כולל סגירה לקויה, אפיתל חוזר מושהה ואנגיוגנזה מופחתת בהשוואה לפצעים רגילים של חולדות.

Introduction

סוכרת מסוג 1 (T1DM) היא מחלה מטבולית כרונית המאופיינת בהיפרגליקמיה והרס תאי β הלבלב¹. פצע סוכרת סוג 1 הוא פצע כרוני שאינו מרפא והסיבוך השכיח וההרסני ביותר של סוכרת בבני אדם ^2,3. מודלים של בעלי חיים הם אבות הטיפוס המתאימים ביותר לחקר השינויים הפתולוגיים במהלך ריפוי פצעים והבטיחות והיעילות של סוכנים טיפוליים פוטנציאליים⁴. בהשוואה לסוגים אחרים, חולדות Sprague-Dawley (SD) זכרים רגישים יותר לסטרפטוזוטוצין (STZ) ומראים שיעור תמותה נמוך יותר, מה שהופך אותם לפופולריים במחקר פצעי סוכרת ^5,6.

תוארו שיטות רבות לבניית מודלים של פצעי T1DM. לגבי מודל T1DM, מחקרים התמקדו בעיקר בהשפעת שיטת הזרקת STZ על שיעור ההצלחה של השראת סוכרת ^7,8. עם זאת, תהליך המידול סובל מפעולה לא עקבית של אותו שלב. במחקר אחד, חולדות צמו במשך 18 שעות לפני זריקת STZ; חולדות עם רמות גלוקוז גבוהות מ-16.67 mmol / L שבוע לאחר זריקת STZ נחשבו סוכרתיות, והפצע הסוכרתי הוצג לאחר 3 שבועות⁹. לעומת זאת, במחקר קשור, ז'ו ועמיתיו צמו חולדות במשך 12 שעות לפני זריקת STZ; חולדות עם רמות גלוקוז גבוהות מ-16.7 mmol / L לאחר 72 שעות לאחר ההזרקה נחשבו לסוכרתיות, והפצע הסוכרתי הוצג לאחר 4 שבועות¹⁰. בסך הכל, יש חוסר עקביות בפרוטוקולי הזרקת STZ, בקריטריונים לאבחון סוכרת ובזמני החדרת פצעים.

במונחים של מידול פצעים, ברוב המחקרים, עובי מלא של העור הגבי נכרת לבניית פצעי T1DM לאחר השראת סוכרת מוצלחת^11,12,13. למרות שמודל זה רגיש להתכווצות העור בחולדות, זהו המודל הנפוץ ביותר במחקר ריפוי פצעים מכיוון שהוא פחות דורש עבודה והוא זול^14,15. עם זאת, חסר מחקר מונחה שיטה על טכניקת כריתה זו בעובי מלא. יתר על כן, אין סטנדרטים אחידים במחקרים הקיימים לגבי גודל הפצע ומיקומו^12,16. גודלו ומיקומו של הפצע יכולים להשפיע בעקיפין על עקביות תכנון הניסוי ועל התוקף המדעי של התוצאות. לכן, יש צורך דחוף בפרוטוקול סטנדרטי להשראת סוכרת סוג 1 ומידול פצעים כנקודת התייחסות לחוקרים. מטרת מחקר זה היא לדמיין פרוטוקול ספציפי למידול פצעי T1DM שיכול לשמש כהתייחסות למחקרי פצעי T1DM.

Protocol

הפרוטוקול נערך בעקבות הצהרת הלסינקי, וכל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת הניהול מאוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית (רשומה מס '2021-13).

1. הכנת הזרקת סטרפטוזוטוצין

1. בחרו 15 חולדות ללא פתוגן ספציפי לזכר SD (SPF) בנות 8 שבועות ובמשקל 220 גרם ±-20 גרם. באמצעות שיטת האקראיות הפשוטה, חלקו את החולדות לקבוצת סוכרת (n = 10) ולקבוצה רגילה (n = 5).
2. למדוד את המשקל ההתחלתי של החולדות, ולקבוע את המינון של STZ באמצעות מתן של 55 מ"ג / ק"ג.
   הערה: בהתבסס על ניסויים מקדימים, 55 מ"ג/ק"ג הוא מינון STZ האופטימלי.
3. שקלו את אבקת STZ במדויק, והניחו אותה במיכל חסין אור.
4. הוסף כמות מתאימה של 0.1 mol/L נתרן ציטראט חוצץ (pH 4.5) כדי להמיס את STZ לריכוז של 1%.
   הערה: יש לקרר מראש את מאגר הנתרן ציטראט למשך שעתיים במקרר בטמפרטורה של 4°C לפני השימוש. הכנת פתרון STZ חייבת להבטיח סטריליות.
5. נערו במשך 30 שניות באמצעות מתנד סמים. מניחים בקופסת קרח ומניחים בצד.
   הערה: יש להשתמש בזריקה תוך 15 דקות.

2. אינדוקציה של מודל T1DM

1. לפני הזרקת STZ, צמו את החולדות במשך 18 שעות, ואפשרו גישה חופשית למים.
2. בצע הזרקה intraperitoneal של 1% STZ פתרון.
   1. תופסים את החולדה, וחושפים את עור הבטן ואת אזור ההזרקה (הצטלבות הקו המחבר בין שורשי שתי הירכיים וקו האמצע של הבטן).
   2. יש לחטא את אזור ההזרקה פעמיים באמצעות כדור צמר גפן ספוג ב-75% אלכוהול (פעם נגד כיוון השעון ופעם נגד כיוון השעון). הניחו את ראשה של החולדה מתחת לבטן.
   3. יש להחדיר את המחט במקביל לקו האמצע של הבטן בזווית של 45°, ולאחר פירסינג העור, להקטין את זווית המחט ל-30°, ולאחר מכן להחדיר את המחט 2-3 מ"מ. משוך בעדינות את פקק המחט, וודא שלא נשאבים דם או נוזלים לתוך המזרק. הזריקו את תמיסת STZ, שלפו את המחט ועצרו את הדימום בעזרת צמר גפן.
      הערה: אם נוזל צהוב נמשך חזרה לתוך המזרק, ייתכן שהמחט חדרה לשלפוחית השתן, ואם נשאב נוזל ירוק כהה, המחט עלולה הייתה לחדור למעי הגס או לצאקום. בכל מקרה, יש להסיר את המחט באופן מיידי. בעל החיים צריך להיות מוערך על ידי צוות וטרינרי.
3. למדוד את רמות הגלוקוז בדם מזדמנים (לא בצום או בצום) בשעה 09:00 בבוקר ביום 3 וביום 7 לאחר השראת STZ.
   הערה: הזמן למדידת גלוקוז בדם באופן אקראי קבוע. בפרוטוקול זה, הוא קבוע בשעה 09:00 בבוקר. עם זאת, זה לא הזמן היחיד בשימוש. דם שנאסף מהווריד הקאודלי על ידי ניקוב מחט רגיש פחות לנוזל רקמות מאשר דם שנלקח מזנב קטוע, ולכן ערכי הגלוקוז בדם מדויקים יותר.
   1. השתיקו את החולדה באמצעות מתקן קיבוע חולדות (איור 1).
   2. מצא את המיקום של הווריד הקאודלי. יש לחטא את זנב החולדה פעמיים באמצעות כדור צמר גפן ספוג ב-75% אלכוהול.
   3. נקב את הווריד הקאודלי כדי לגרום לדימום, ולמדוד את רמת הגלוקוז בדם באמצעות גלוקומטר. לעצור את הדימום עם צמר גפן.
      הערה: רמת גלוקוז גבוהה מ-16.7 mmol / L ביום 7 לאחר הזרקת STZ נחשבת T1DM.
4. שקלו את החולדות מדי שבוע, ומדדו את רמות הגלוקוז בדם ופרמטרים אחרים, כולל תזונה, צריכת מים ותפוקת שתן.
5. להאכיל את בעלי החיים בדרך כלל במשך 8 שבועות לאחר השראת STZ.

3. בניית מודל הפצע

1. לגלח את החולדות עם סכין גילוח חשמלי 1 יום לפני דוגמנות פצע. אזור מגולח של 5 ס"מ x 5 ס"מ בצד האחורי של החולדה הוא בדרך כלל אידיאלי.
2. נגבו את האזור המגולח עם כדור צמר גפן חמים רגיל, הניחו לו להתייבש ולאחר מכן מרחו קרם מסיר שיער למשך 5 דקות. נקה את האזור עם גזה, ולשטוף כל שאריות קרם depilatory עם מלוחים רגילים חמים.
3. לשקול את החולדות, ולחשב את המינון הנדרש של Nembutal על בסיס תקן 35 מ"ג / ק"ג. ממיסים את הנמבוטל באמצעות מי מלח רגילים לריכוז של 3%. ניתן להשתמש בחומרי הרדמה כללית אחרים כגון קטמין/קסילזין או איזופלורן לצורך הליך זה. אנא עבדו עם ועדות מוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים כדי להבטיח את הטוב ביותר.
   הערה: כדי להבטיח יעילות, התמיסה צריכה להיות מוכנה טרייה, ואת אבקת Nembutal ואת הפתרון צריך להיות מוגן מפני אור.
4. צמו את החולדות במשך 12 שעות לפני ההרדמה. להזריק את ההרדמה intraperitoneally. השתמש משחת עיניים טטרציקלין או חומר סיכה כללי לעין כדי למנוע יובש בעיניים לאחר מתן הרדמה.
   הערה: הרדמה נחשבה בינונית כאשר שרירי החולדה היו רפויים יחסית, תנועות העיניים נעלמו, הנשימה הייתה סדירה והתגובה לגירויים מכאיבים הייתה קטנה.
5. יש לחטא את העור הגבי פעמיים באמצעות כדורי צמר גפן ספוגים ביוד (פעם נגד כיוון השעון ופעם נגד כיוון השעון) ו-75% אלכוהול (סיבובים חלופיים).
6. לאחר הייבוש, חותכים את העור עם ניקוב ביופסיה עגול בקוטר 20 מ"מ.
7. אוהל את העור עם מלקחיים סטריליים, ולאחר מכן להשתמש מספריים כירורגיים סטריליים כדי להסיר את העור בעובי מלא לאורך סימני חיתוך אגרוף. עצור את הדימום עם כדור צמר גפן מלוחים רגיל.
   הערה: הגבול העליון של הפצע צריך להיות 5-10 מ"מ מתחת לגבול השכמה התחתון ו-5-10 מ"מ מימין/משמאל לעמוד השדרה של החולדה (איור 2). הפצעים סימטריים לאורך עמוד השדרה כאשר נבנים שני פצעים.
8. השתמש בגזה וזלין כדי לכסות את הפצעים, ולעטוף אותם עם גזה ותחבושת נושמת מוחזק במקום עם סרט גומי. יש להזריק קרפרופן תת עורית (5 מ"ג/ק"ג) פעם ביום כדי להקל על כאבים לאחר הניתוח. שנה את תחבושת הפצע פעם ביום (שימוש בקרפרופן לשיכוך כאבים).
   הערה: יש להתבונן בתנועה ובנשימה של החולדה בכל חריגה לאחר השלמת התחבושת, ולוודא שהתחבושת הנושמת הדוקה כראוי.
9. מניחים סרגל מתחת לפצע, ומצלמים את הפצע במצלמה דיגיטלית עד היום ה-14. יש להרדים את החולדות ביום ה-14 בהתאם להנחיות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים. חותכים את רקמת עור הפצע 5 מ"מ מקצה הפצע. חלק את דגימת הרקמה לשני חלקים, שטוף אותם עם PBS כדי להסיר כתמי דם גלויים, ולאחר מכן לתקן אותם עם תמיסת 4% paraformaldehyde.

4. חישוב אזור הפצע באמצעות תוכנת ImageJ

1. לחץ על קובץ כפתור לאחר פתיחת התוכנה, ולאחר מכן נפתח ולחץ על פתח כדי לפתוח את תמונות הפצע.
2. בחרו בכלי ישר וציירו קו ישר של 1 ס"מ לאורך הסרגל בתמונות הפצע.
3. לחץ על הפקודה קבע קנה מידה בתפריט נתח והגדר את המרחק הידוע ל- 1.
4. בחר בכלי בחירות חופשיות ושרטט את קווי המתאר של הפצע בתמונה.
5. לחץ על הפקודה Measure בתפריט Analyze וקרא את ערך האזור לאחר שהתוצאה צצה.

5. צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E)

1. הסר את רקמת העור מן הקיבוע, לחתוך אותו לחלקים דקים עם אזמל במכסה אדים, ומניחים אותו בתוך קלטת התייבשות.
2. שים את קלטת התייבשות במכונת התייבשות, ולייבש את הרקמות בשלבים הבאים: 75% אלכוהול במשך 4 שעות; 85% אלכוהול במשך 2 שעות; 90% אלכוהול במשך 2 שעות; 95% אלכוהול במשך 1 שעות; אתנול נטול מים I ו- II למשך 30 דקות כל אחד; אלכוהול בנזן במשך 5-10 דקות; קסילן I ו- II למשך 5-10 דקות כל אחד; ושעווה I, II ו-III במשך שעה אחת כל אחד.
3. הטמיעו את הרקמות בשעווה. מצננים ב-20- מעלות על שולחן הקפאה, ומתקנים את גוש השעווה בצורה מסודרת.
4. חותכים את גושי השעווה לאורכם באמצעות מכונת חתך פרפין למקטעים בעובי 3 מיקרומטר.
5. השרו ברצף את הקטע בקסילן I ו-II למשך 20 דקות כל אחד, אתנול נטול מים I ו-II למשך 5 דקות כל אחד, ומי ברז למשך 5 דקות.
6. הציפו את הרקמות בכתם המטוקסילין למשך 3-5 דקות, התמיינות תמיסת חומצה הידרוכלורית מימית 0.5%, תמיסת אמוניה מימית 0.5% חזרה לכחול ושטפו במים.
7. לייבש את קטעי הרקמה עם 85% ו 95% אלכוהול. להציף את הרקמות עם תמיסת צביעת eosin במשך 5 דקות.
   הערה: בדרך כלל, צביעת אאוסין אורכת 30 שניות עד 2 דקות, וניתן להתאים את הזמן בהתאם לתוצאות הצביעה ולדרישותיה.
8. יש לייבש את החלקים ברצף בתמיסות הבאות: אתנול נטול מים I, אתנול נטול מים II, אתנול נטול מים III, קסילן I וקסילן II, כל אחד למשך 5 דקות. לבסוף, מכסים את מגלשות הזכוכית בבלזם ניטרלי.
9. בחן את הרקמות המוכתמות ב- H&E מתחת למיקרוסקופ ב- 40x, 20x ו- 10x, וצלם תמונות כדי לשמור תמונות מייצגות של כל שקופית.

6. צביעת CD31 immunofluorescence

1. משרים את חלקי הרקמה בקסילן I ו-II למשך 15 דקות כל אחד, אתנול נטול מים I ו-II למשך 5 דקות כל אחד, 85% אלכוהול למשך 5 דקות ו-75% אלכוהול למשך 5 דקות, ושוטפים במים מזוקקים.
2. תיקון אנטיגן
   1. הוסף חיץ מתאים של 10 mM חומצת לימון של pH 6.0 למיכל תנור מיקרוגל, חמם אותו לרתיחה גבוהה ולאחר מכן הנח לתוכו את מגלשת הזכוכית.
   2. מרתיחים במשך 8 דקות על אש בינונית, מפסיקים למשך 8 דקות, ואז מרתיחים שוב על אש בינונית-נמוכה במשך 7 דקות.
   3. תנו לשקופיות להתקרר, הניחו אותן ב-PBS (pH 7.4), וכבסו אותן שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחת באמצעות שייקר להסרת צבע.
3. מוסיפים 5% סרום עיזים בעיגול, ודגרים במשך 30 דקות.
4. נערו בעדינות את תמיסת הסגירה (5% סרום עיזים), והוסיפו נוגדן ארנב נגד CD31 (מדולל באמצעות PBS ביחס של 1:200) על המקטעים. מניחים את החלקים בקופסה רטובה, ודגרים למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
5. שטפו את המגלשות שלוש פעמים עם PBS (pH 7.4) על שייקר להסרת צבע למשך 5 דקות כל אחת. נערו קלות את החלקים כדי לייבש אותם, ולאחר מכן כסו אותם בטיפה עגולה של IgG נגד ארנב עז עם תווית FITC. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 50 דקות בחושך.
6. שטפו את המגלשות שלוש פעמים עם PBS (pH 7.4) על שייקר להסרת צבע למשך 5 דקות כל אחת. יבשו את המקטעים באוויר עם טלטול קל, והוסיפו תמיסת צביעה DAPI. דוגרים על המקטעים בחושך במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
7. לאחר ייבוש המקטעים, ציירו עיגולים סביב הרקמה עם הפפפן (כדי למנוע אובדן נוגדנים), הוסיפו לעיגולים חומר מרווה אוטופלואורסצנטי (0.3% סודן שחור B) למשך 5 דקות, ולאחר מכן שטפו אותם תחת מים זורמים במשך 10 דקות.
8. שטפו את המגלשות שלוש פעמים עם PBS (pH 7.4) על שייקר להסרת צבע למשך 5 דקות כל אחת. נערו מעט את המקטעים, ואטמו אותם באמצעי הרכבה נגד דהייה.
9. התבוננו וצלמו את המקטעים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ברזולוציה של 40x, 20x ו-10x.
   הערה: אורך גל עירור UV DAPI הוא 330-380 ננומטר, ואורך גל הפליטה הוא 420 ננומטר (אור כחול). אורך גל העירור FITC הוא 465-495 ננומטר, ואורך גל הפליטה הוא 515-555 ננומטר (אור ירוק).

7. ניתוח סטטיסטי

1. אסוף ונתח את הנתונים באמצעות SPSS.
2. דווח על הנתונים כממוצע ± סטיית תקן.
3. השתמש בבדיקת t דגימות עצמאית כדי לנתח את ההבדלים בין קבוצות סוכרת ונורמליות.
4. הגדר את המובהקות הסטטיסטית על **p < 0.01 ו- *p <- 0.05.

תוצאות

בסך הכל 10 חולדות SD קיבלו זריקה תוך-צפקית STZ אחת כדי לגרום למודל T1DM. חולדה אחת מתה בטרם עת (10%), אך סוכרת נגרמה בכל החולדות (100%). לאחר 3 ימים של הזרקת STZ, רמות הגלוקוז בדמן של כל החולדות היו גבוהות מ-16.7 מילימול לליטר, ורמות הגלוקוז בדם התייצבו 5 שבועות לאחר הזירוז (איור 3A). משקלה של קבוצת הסוכרת עלה בהדרגה לאחר זריקת STZ אך ירד בשבוע 3 ואז עלה שוב לאט לאט משבוע 4 (איור 3B). לעומת זאת, משקל החולדות בקבוצה הנורמלית עלה בהתמדה, והמשקל הממוצע שלהן 3 ימים לאחר השראת הסוכרת היה גבוה מזה של קבוצת הסוכרת (איור 3B). כל החולדות הסוכרתיות הציגו תסמינים אופייניים של צמא, פוליאוריה וירידה במשקל, בדומה לממצאים של Hao et ^al.17.

ביום ה-7 וביום ה-14 לאחר הפציעה, הניתוח המאקרוסקופי גילה שאפיתל מחדש היה בולט יותר בחולדות בקבוצה הרגילה מאשר בקבוצת הסוכרת (איור 4A). התוצאות הכמותיות הראו כי שיעור ריפוי הפצעים היה נמוך משמעותית בקבוצת הסוכרת מאשר בקבוצה הרגילה ביום 7 וביום 14 (p < 0.01). עם זאת, ביום ה-14, שיעורי ריפוי הפצעים יכולים להיות גבוהים מ-90% גם בקבוצת הסוכרת (p < 0.05, איור 4B). זה מצביע על כך שמודל הפצע T1DM מאופיין בסגירה לקויה, אך לא במידה של אי ריפוי כרוני שנראה בפצעי סוכרת אנושיים.

צביעת H&E ביום ה-14 לריפוי הפצע חשפה אפידרמיס פצע לא שלם, התפשטות איטית של קרטינוציטים ועיכוב באפיתל מחדש בקבוצת הסוכרת בהשוואה לקבוצה הרגילה. פצעי הסוכרת הראו אובדן חלקי של זקיקי השיער ובלוטות החלב. היו גם פחות נימים גלויים (איור 5).

סוכרת גורמת לתפקוד לקוי של תאי אנדותל, גליקוזילציה של חלבוני מטריצה חוץ-תאיים, וניתוק עצבים וסקולרי¹⁸. סיבוכים אלה גורמים לאנגיוגנזה נמוכה מהרגיל של הפצע בפצעי סוכרת¹⁸. אנגיוגנזה נחוצה לריפוי פצעים, ואנגיוגנזה של פצעים מנותחת לעתים קרובות על-ידי CD31 immunostaining (איור 6A)^19,20. בהתבסס על הצפיפות האופטית הממוצעת (AOD) של ביטוי CD31, אנגיוגנזה באתר הפצע הייתה גבוהה משמעותית בנורמלי מאשר בקבוצת הסוכרת (p < 0.01, איור 6B).

איור 1: תמונה של חולדות משותקות על-ידי קיבוע. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: דיאגרמה של מיקום פצע החולדה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: רמות הגלוקוז בדם והמשקלים של חולדות הניסוי. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: פצעי עור בעובי מלא (בקוטר 20 מ"מ) על גבן של חולדות הניסוי. (A) המראה המאקרוסקופי של הפצעים ביום 0, ביום 7 וביום ה-14. תמונות המורפולוגיה של הפצע ביום 0, יום 7 ויום 14 צולמו במצלמה דיגיטלית. (B) אזור הפצע נמדד באמצעות תוכנת ImageJ ושימש לחישוב קצב ריפוי הפצע. שיעור ריפוי הפצע (%) חושב באופן הבא: (אזור הפצע הראשוני - אזור הפצע בנקודת הזמן שצוינה)/אזור הפצע הראשוני × 100. הערכים מוצגים כממוצע ± SD (n = 14). מובהקות סטטיסטית נקבעה על ** p < 0.01 ו * p < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: תמונות H&E היסטופתולוגיות מייצגות ביום ה-14 לאחר הופעת הפצע. החיצים הכחולים מציינים נימים. החיצים האדומים מראים את התפשטות הקרטינוציטים. קנה מידה שמאלי: סרגל אחד = 200 מיקרומטר; קנה מידה ימני: סרגל אחד = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: ניתוח צביעה אימונופלואורסצנטית לביטוי CD31. רמות CD31 שימשו כדי לקבוע את מצב האנגיוגנזה. (A) תמונות מייצגות של צביעת CD31 immunofluorescence בקבוצות סוכרת ונורמליות. ערך הצפיפות האופטית המשולבת (IOD) ואזור הפיקסלים (AREA) עבור כל דגימת עור חושבו באמצעות תוכנת Image-Pro Plus 6.0. כמו כן נגזר ערך הצפיפות האופטית הממוצעת (AOD) (AOD = IOD/AREA). ערך AOD היה ביחס ישר לביטוי החיובי של CD31. (B) השוואה כמותית של ביטוי חיובי CD31 בקבוצות הסוכרתיים והנורמליים. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. ** p < 0.01. קנה מידה: סרגל אחד = 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

פרוטוקול זה מבהיר את הפעולות השנויות במחלוקת במידול פצעים T1DM. חששות לגבי פרוטוקולי הזרקת STZ, קריטריוני הצלחה של השראת T1DM, זמן ייצוב גלוקוז בדם ומיקום וגודל הפצע טופלו בעבודה זו. כמו כן, הובהרו המאפיינים הפתולוגיים והפרמטרים המדידים להערכת ריפוי פצעים מסוג T1DM.

החולדות צמו במשך 18 שעות לפני זריקת STZ כדי למנוע קשירה תחרותית של גלוקוז או אנלוגים שלו לתאי β, אשר יכול להשפיע על היעילות של STZ. השיטה הנפוצה ביותר להשראת סוכרת סוג 1 היא מינון גבוה יחיד של STZ, אשר מעלה את רמת הגלוקוז בדם על ידי פגיעה באיונים והפחתת הפרשת אינסולין²¹. ניסויים טרום ניסויים גילו כי מינון STZ האופטימלי לשיעור הצלחה גבוה ושיעור תמותה נמוך היה 55 מ"ג / ק"ג, שהוא נמוך מהמינונים האופטימליים שדווחו במחקרים קודמים^22,23,24. בפרוטוקול זה, T1DM הושרה באמצעות זריקה תוך צפקית יחידה של 55 מ"ג / ק"ג STZ.

רמות הגלוקוז בדם היו גבוהות מ-16.7 mmol / L 3 ימים לאחר הזרקת STZ. עם זאת, רמת גלוקוז בדם גבוהה מ -16.7 mmol / L ביום 7 לאחר הזרקת STZ היא הקריטריון המומלץ למידול T1DM מוצלח, מכיוון שמידת הנזק לאי משתנה בין חולדות, והארכה מתאימה של זמן האבחון יכולה להפחית את שיעור השלילי הכוזב. בנוסף, תנודות הגלוקוז בדם התייצבו 5 שבועות לאחר הזרקת STZ, והחולדות עלו במשקל בהדרגה במהלך תקופה זו, בהתאם לממצאים קודמים^25,26. זה מצביע על כך שיש לייצב את רמת הגלוקוז בדם במודל T1DM למשך 6 שבועות לפחות, ועלייה במשקל החולדה לאחר 6 שבועות מפחיתה את שיעורי התמותה במהלך מידול הפצע. לפיכך, פרוטוקול זה ביצע מידול פצעים 8 שבועות לאחר הזרקת STZ.

שיעור סגירת הפצע ביום ה-7 וביום ה-14 לאחר הפציעה היה נמוך משמעותית בחולי סוכרת מאשר בקבוצת הפצע הרגילה, מה שמצביע על החלמה איטית. יתר על כן, אפיתל מחדש של פצע ואנגיוגנזה היו נמוכים משמעותית בסוכרת מאשר בקבוצה הרגילה. זה מדגים כי מודל הפצע T1DM מראה ריפוי פצעים איטי יותר ואפיתל מחדש מושהה מאשר בחולדות רגילות, אשר עשוי להיות קשור לשינויים פתולוגיים של אנגיוגנזה פצע מופחת. עם זאת, ביום ה-14, שיעור ריפוי הפצעים בסוכרת סוג 1 היה גם הוא מעל 90%, וזה שונה מאי-הריפוי הכרוני המאפיין פצעי סוכרת אנושיים. ייתכן שהסיבה לכך היא שהמנגנונים הפיזיולוגיים של מכרסמים לריפוי פצעים שונים מאלה של בני אדם²⁷ . כתוצאה מכך, קוטר הפצע הטוב ביותר הוא לפחות 20 מ"מ, שהוא גדול מספיק כדי לאפשר זמן להעריך את יעילות ההתערבות במחקר פצע סוכרתי. מיקום הפצע צריך להימנע מעצם השכמה ועמוד השדרה, שכן תנועה רציפה בשני אתרים אלה עלולה לשבש את ריפוי הפצע.

לסיכום, בניית מודל הפצע T1DM בשיטה של פרוטוקול זה יעילה. הפרוטוקול משכפל חלק מהמאפיינים של פצעי סוכרת כרוניים, כגון ריפוי פצעים איטי יותר, אפיתל חוזר מושהה ואנגיוגנזה מופחתת בהשוואה לפצעי חולדות רגילים. עם זאת, לא ידוע אם המודל יכול לשכפל פנוטיפים כרוניים אחרים של פצעי סוכרת. יתר על כן, פרוטוקול זה מתאר את השיטה הבסיסית והנפוצה ביותר, שאינה לוקחת בחשבון את נושא התכווצות העור בחולדות. מחקר עתידי יכול לשלב את השימוש בסד פצע בפרוטוקול זה או לחקור מודלים נוספים של פצעי סוכרת כרוניים, שיהוו אתגר משמעותי לחוקרים בעתיד.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antifade mounting medium	Southern Biotechnology Associates, Inc.	0100-01
AutoFluo Quencher	Servicebio Technology co., Ltd.	G1221
Automatic slide stainer	Thermo Fisher Scientific Inc.	Varistain™ Gemini ES
CD31	Servicebio Technology co., Ltd.	GB11063-2
Citrate antigen retrieval solution	Servicebio Technology co., Ltd.	G1201
Cover glass	Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd.	10212432C
DAPI	Servicebio Technology co., Ltd.	G1012
Decolorization shaker	Scilogex	S1010E
Depilatory cream	Guangzhou Ruixin Biotechnology Co., Ltd.	—
Dimethyl benzene	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	64-17-5
Drug oscillator	Shenzhen Jiashi Technology Co., Ltd.	VM-370
Electric razor	Shanghai Flyco Electrical Appliance Co., Ltd.	FC5908
Embedding machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd.	JB-P5
Ethanol absolute	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	1330-20-7
Fitc-labeled goat anti-rabbit IgG	Servicebio Technology co., Ltd.	GB22303
Goat serum	Thermo Fisher Scientific Inc.	16210064
Hematoxylin and eosin staining solution	Beijing Regan Biotechnology Co., Ltd.	DH0020
Image J software	National Institutes of Health	—
Microwave oven	Midea Group Co., Ltd.	M1-L213B
Mini centrifuge	Scilogex	D1008
Neutral balsam	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10004160
PBS buffer	Biosharp	G4202
Portable blood glucose meter	Sinocare Inc.	GA-3
Rapid tissue processor	Thermo Fisher Scientific Inc.	STP420 ES
Rat fixator	Globalebio (Beijing) Technology co., Ltd	GEGD-Q10G1
Slicing machine	Thermo Fisher Scientific Inc.	HM325
Slides glass	Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd.	80312-3181
sodium citrate buffer	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	c1013
Streptozotocin	Sigma	57654595