במאמר זה אנו מתארים הליך המאפשר זיהוי כלל איברי של חיידקים פתוגניים במהלך ההדבקה וכימות של פעילות המדווח הפלואורסצנטי.
רוב הזיהומים מתרחשים בתוך רקמות מארח תלת מימדיות עם אנטומיה מורכבת ופיזיולוגיה מקומית משתנה של המארח. מיקומם של תאי פתוגן בסביבה מגוונת זו משפיע באופן משמעותי על רמות הלחץ שלהם, תגובותיהם, גורלם ותרומתם להתקדמות הכוללת של המחלה ולכישלון הטיפול. עם זאת, בשל הקשיים הטכניים באיתור תאי פתוגן בגודל מיקרומטר בתוך איברים מארחים בגודל ס"מ, תחום מחקר זה כמעט ולא נחקר. כאן אנו מציגים שיטה להתמודדות עם אתגר זה. אנו משתמשים בטומוגרפיה סדרתית של שני פוטונים ובניתוח תמונה משופר באמצעות בינה מלאכותית כדי לאתר תאי סלמונלה בודדים בכל הטחול, אונות הכבד ובלוטות הלימפה השלמות של עכברים נגועים. באמצעות כתבים פלואורסצנטיים ומתן נוגדנים in vivo , ניתן לקבוע את קצב השכפול של תאי סלמונלה בודדים, את האינטראקציה המקומית שלהם עם תאי חיסון ספציפיים ואת תגובות החיידקים לאנטיביוטיקה. מתודולוגיות אלו פותחות אפיקים לבחינה מקיפה של זיהומים, מניעתם והטיפול בהם בהקשר התלת-ממדי של הרקמה.
זיהומים מתרחשים ברקמות עם אנטומיה מורכבת ופיזיולוגיה ממודרת. המיקרו-סביבות המגוונות המתקיימות יחד ברקמה הנגועה יכולות לקבוע את גורלן של תת-קבוצות פתוגנים מקומיות ואת תרומתן לתוצאה הכוללת של המחלה 1,2,3. עם זאת, מיפוי תלת-ממדי מקיף של פתוגנים מיקרוביאליים ברקמות בגודל ס"מ נותר מאתגר4. הדמיה של המוח ואיברים אחרים היא תחום מחקר פעיל מאוד עם שיפור מתמיד של אסטרטגיות ניסוי5, אך שיטות רבות עדיין חסרות את הרזולוציה תת-מיקרומטר שתידרש כדי לזהות פתוגנים חיידקיים בגודל מיקרומטר בביטחון. לעומת זאת, טומוגרפיה טורית של שני פוטונים (STP)6 מאפשרת הדמיה אוטומטית מרובת צבעים ונטולת עיוותים של רקמות שלמות ברזולוציה תת-מיקרומטרית במישור, ומניבה מערכי נתונים נפחיים מלאים. שיטה זו משלבת חתך פיזי חוזר ונשנה של הרקמה באמצעות ויברטום, עם הדמיה לסירוגין של שני פוטונים של פני הבלוק המתהווים עם אור אינפרא אדום. טומוגרפיית STP נמצאת בשימוש נרחב למיפוי אקסונים דקים במוח כדי ליצור מפות קישוריות 7,8,9,10.
טומוגרפיית STP מאפשרת גם מיפוי תלת ממדי של תאי פתוגן מיקרוביאליים בודדים (סלמונלה, טוקסופלסמה) בכל הרקמות הנגועות11,12 באמצעות טומוגרף. הדור השני-הרמוני חושף את מעטה הקולגן סביב העורקים וברצועות סיביות כגון טרבקולה של הטחול, ובכך מספק הקשר אנטומי. ניתן להשתמש בנוגדנים פלואורסצנטיים מוזרקים In vivo כדי להכתים תאים מארחים ולחשוף אינטראקציות בין תאי פתוגן בודדים לבין תאים חיסוניים חודרים כגון נויטרופילים. כאן מתואר הצינור הכולל עיבוד הרקמה, הדמיה, תפירה של אריחי הדמיה עם תיקון תאורה, ערימה של תמונות בתלת מימד וסגמנטציה באמצעות כלי למידת מכונה. צינור זה מניב מיקומים תלת-ממדיים של פתוגנים, תאים ומיקרו-מושבות בודדים בהקשר המארח שלהם. ספירת מספר התאים הבודדים בתוך מיקרו-מושבות נותרה קשה בגלל מגבלות רזולוציה, אך ניתן להעריך מספרים כאלה בהתבסס על הבהירות המשולבת של המיקרו-מושבה. ניתן להתאים את הצינור בקלות למודלים אחרים של זיהום אם פתוגנים מבטאי GFP או YFP רקומביננטיים זמינים.
כל הניסויים בבעלי חיים המתוארים כאן אושרו על ידי הרשויות (רישיון 2239, Kantonales Veterinäramt Basel) ופועלים בהתאם להנחיות המקומיות (Tierschutz-Verordnung, Basel) ולחוק הגנת בעלי החיים השוויצרי (Tierschutz-Gesetz).
1. הכנה ואחסון של רקמות נגועות
2. הטבעה לדוגמה
3. הכנת המיקרוטום והכנת הבמה
4. הקצאת פני השטח ורכישת תמונות דו-ממדיות
5. מציאת קצוות הדגימות והגדרת הלייזר לנקודת ההתחלה
סריקת 6. 3D / חתך
7. עיבוד תמונה וניתוח נתונים
ההליך המתואר מאפשר זיהוי של תאי סלמונלה בודדים באיברי עכבר שלמים כגון טחול, כבד, בלוטות לימפה מזנטריות ומדבקות פייר11 (איור 5 ואיור 6). הוא גם מזהה טפילי Toxoplasma gondii במוח העכבר12. חלק מהרקמות הנגועות, כולל כבד, מדבקות פייר וטחול, פולטות אוטופלואורסצנטיות משמעותית בטווח הירוק-צהוב. Autofluorescence משופר עוד יותר על ידי קיבוע עם paraformaldehyde, אשר יש צורך לשמר את מבנה הרקמה. זיהוי פלואורסצנטיות ירוקה מ-GFP, mWasabi והרכיב הירוק שלTIMER bac על רקע אוטופלואורסצנטי זה משופר על ידי הצבת מסנן פס פס צר 510/20 ננומטר (המשדר את רוב פליטות ה-GFP אך חוסם חלק גדול מהספקטרום האוטופלואורסצנטי) לפני מכפיל אור 2 (האוסף פליטות ירוקות) ועל ידי הפחתת אוטופלואורסצנטיות רקמות על ידי אחסון רקמות קבועות למשך 3 ימים או יותר בהגנה קריואורסנטית11. עם זאת, חיידקים עדיין צריכים לבטא לפחות כמה אלפי עותקים לכל תא של GFP או חלבונים פלואורסצנטיים אחרים. מצד שני, יש להימנע מרמות חלבון פלואורסצנטיות מוגזמות כדי למזער את עלויות הכושר שעלולות להוביל לאלימות מוחלשת23.
פילוח נכון של חיידקים פלואורסצנטיים ברקמות יכול להיות מאושר על ידי אימונוהיסטוכימיה של קטעי רקמה שאוחזרו לאחר הדמיה. באופן ספציפי, עצמים שמוכתמים בנוגדן לרכיבי פני השטח של חיידקים כמו ליפופוליסכריד יכולים להיות מיושרים עם התמונה הפלואורסצנטית שמתקבלת בטומוגרפיית STP (איור 5). חשוב לציין כי חלק מתאי הסלמונלה המוכתמים חסרים חלבונים פלואורסצנטיים ולכן ניתן לזהות פלואורסצנטיות הן במיקרוסקופ קונפוקלי והן בטומוגרפיה STP. תאים אלה הם סלמונלה שהומתו על ידי מערכת החיסון המארחת, כפי שמודגם על ידי תרביות מיון ציטומטרי של זרימה ותרביות גדילה מתאים ממוינים בודדים, כמו גם המתאם ההדוק בין מספר היחידות יוצרות המושבה על לוחות אגר לבין מספר תאי הסלמונלה הפלואורסצנטיים כפי שנקבע על ידי ציטומטריית זרימה24. בנוסף, אובדן פלסמיד יכול לגרום לתאים קיימא שאינם פלואורסצנטיים וזה צריך להיבדק על ידי ציפוי על מדיה עם וללא אנטיביוטיקה מתאימה המתאימה סמן הבחירה על פלסמיד. עבור פלסמידים שמקורם ב-pSC101, אובדן פלסמיד in vivo הוא נדיר19. עבור רוב קלטות הביטוי המשולבות כרומוזומלית כגון sifB::gfp המשמשות ב-11, אובדן הביטוי אינו ניתן לגילוי in vivo. אם הפילוח אינו עולה בקנה אחד עם נתוני האימונוהיסטוכימיה, יש לשנות את צינור הסגמנטציה.
הרזולוציה של טומוגרפיית STP אינה מספיקה כדי לפתור תאי חיידקים בודדים בתוך מיקרו-מושבות צפופות. עם זאת, עוצמת הפלואורסצנטיות הכוללת של המיקרו-מושבה מאפשרת להעריך את מספר תאי הסלמונלה . זה דורש זן פלואורסצנטי עם רמות פלואורסצנטיות הומוגניות מאוד כגון סלמונלה sifB::gfp11. שילוב המספר המשוער של תאי סלמונלה עבור כל המיקרו-מושבות והתאים הבודדים מניב עומסי רקמה חיידקיים הכוללים עומסים התואמים שיטות חלופיות כגון ציפוי או ציטומטריית זרימה של הומוגנטים ברקמה11. ציטומטריית ציפוי וזרימה לא יכולה להיעשות ישירות מאותן רקמות מכיוון שהן צריכות להיות קבועות זילוח לטומוגרפיה STP. במקום זאת, הם צריכים להיעשות עם בעלי חיים נוספים שאינם קבועים. אם עומסי החיידקים החציוניים כפי שנקבעו על ידי הגישות השונות שונים ביותר מפי 3, הכדאיות של חיידקים פלואורסצנטיים עלולה להיפגע (במקרה של יחידות יוצרות מושבה נמוכות יותר) או שחיידקים מסוימים איבדו את מבנה המדווח הפלואורסצנטי (במקרה של יחידות יוצרות מושבה גבוהות יותר). ניסוי בקרה יידרש כדי לזהות את המקור לפערים כאלה.
טומוגרפיית STP מספקת לוקליזציה של תאי חיידקים בתוך המבנה התלת-ממדי של הרקמות הנגועות. האותות ההרמוניים השניים של קולגן מספקים ציוני דרך אנטומיים כגון עורקים וטרבקולה. נוסף על כך, תאים מארחים יכולים להיות מוכתמים in vivo על-ידי הזרקת נוגדן לסמנים לפני השטח לפני הזילוח (איור 5 ואיור 6). צביעה זו מספקת ציוני דרך נוספים לתאי רקמות ולמיקרו-סביבות ספציפיות, כולל מוקדי דלקת (סמנים תוך-תאיים ותאים מסוימים עם מחסומי דיפוזיה כגון מוך לבן טבורי או המוח אינם נגישים בקלות, מתאימים לצביעת in vivo זו). גישה זו חשפה את מוך הלבן הטבורי כתא רקמה המאפשר הישרדות ארוכת טווח של סלמונלה במהלך כימותרפיה מיקרוביאלית11.
לבסוף, סלמונלה המשוכפלת בקצב מתון או איטי ניתן לזהות ולמקם בתוך המבנה התלת-ממדי של רקמות באמצעות זנים המבטאים טיימרbac, מדווח תא בודד לקצב שכפול11,15.
איור 1: הליך הדמיה של איברים שלמים באמצעות טומוגרפיה טורית של שני פוטונים (STP). (A-B) האיבר נקצר לאחר זילוח טרנסקרדיאלי ומאוחסן למשך הלילה ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-4°C. (C-E) האיבר מוטבע באגרוז מחומצן ומקושר צולב, ואז הרקמה נסרקת ונחתכת באמצעות טומוגרפיית STP. הפרוסות נאספות עבור אימונוהיסטוכימיה עוקבת. (פ-י) צינורות ניתוח חישוביים לכימות מספרי חיידקים, אישור חיידקים פלואורסצנטיים ושחזור תלת ממדי של מיקומי חיידקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מערך טומוגרפיה טורי של שני פוטונים (STP). (A) טומוגרף המשלב (B) הדמיה של 2 פוטונים עם (C) חתך אוטומטי של רקמות טוריות. (D) פרוסות רקמה שנאספו לצורך חקירות מעקב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תפירת אריחים ותיקוני תאורה. אריחים נתפרים ותאורה לא אחידה מתוקנת לשימוש בפיזור עוצמה מתוקן באמצעות מזעור אנרגיה מוסדר (CIDRE). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: סגמנטציה של סלמונלה המבטאת את החלבון הפלואורסצנטי הירוק (GFP) באמצעות מכונת וקטור תמיכה (SVM) ורשת עצבית קונבולוציונית (CNN). (A) תמונות מייצגות של אובייקטי GFP המפולחים לפי SVM (משמאל) ותמונות תואמות (מימין) עם אזורים המפולחים לפי SVM (סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר). (B) התפלגות ערכים מקובצים באשכולות אדום-ירוק-כחול (RGB) עבור האזורים המפולחים. (C) תמונות מייצגות של עצמים שאינם GFP שזוהו באופן שגוי על-ידי שרת אחסון וירטואלי כחיידקים (משמאל). CNN מבטל אותם בצדק כרקע (מימין, סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: זיהוי סלמונלה המבטאת את החלבון הפלואורסצנטי הירוק (GFP) באמצעות טומוגרפיה ואישור על-ידי אימונוהיסטוכימיה. תמונות של אותו קטע שנרכשו על ידי טומוגרפיה (משמאל) או מיקרוסקופ קונפוקלי לאחר צביעה עם נוגדן סלמונלה lipopolysaccharide (מימין). נויטרופילים (באדום) הוכתמו על ידי הזרקת in vivo של נוגדן אנטי-Ly-6G שכותרתו PE לפני הזלוף. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: שחזור תלת-ממדי ולוקליזציה של סלמונלה בטחול עכבר נגוע. (A) שחזור תלת ממדי (3D) של פרוסת טחול בעובי 5 מ"מ ומוכתמת in vivo לפני זילוח עם נוגדן נגד CD169 (אדום). האות הכחול מייצג קולגן שזוהה על ידי הרמוניות שניות. (B) מישור אופטי אחד של ערימת התלת-ממד המוצג ב-(A). המיקומים של תאי סלמונלה או microcolonies מסומנים על ידי כוכבים. (C) שחזור תלת-ממדי של מיקומי סלמונלה (כוכבים) בכבד נגוע. העורקים נראים על סמך מעטה הקולגן שלהם (כחול). סרגל קנה מידה: 1 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
ההקשר הרקמתי המקומי של פתוגנים חיידקיים חיוני לקביעת התקפות מארח מקומיות, התאמות חיידקיות, התוצאה המקומית של אינטראקציות הפתוגן המארח וכימותרפיה מיקרוביאלית, והתרומה האישית לתוצאה הכוללת של המחלה. הדמיה של חיידקים בגודל מיקרומטר באיברים בגודל סנטימטרים הייתה מאתגרת. טומוגרפיה טורית של שני פוטונים (STP) מספקת רזולוציה מרחבית מספקת כדי לזהות תאי חיידקים בודדים באיברים שלמים, חתך והדמיה אוטומטיים, ותפוקה מספקת (~ איבר אחד ליום)11. בעוד אנטיגנים מארח יכול להיות מוכתם in vivo, תאים פתוגניים צריכים לבטא חלבונים פלואורסצנטיים מתאימים כדי להבטיח זיהוי מקיף של תאים פתוגניים תאיים. מערכי הנתונים המתקבלים (0.5-1.5 טרה-בייט לכל איבר) מציבים אתגרים משמעותיים בפני תשתיות IT לניתוח ואחסון נתונים.
ישנם מספר שלבים קריטיים בשיטה זו. ראשית, נדרש זן פתוגן עם ביטוי ניתן לזיהוי והומוגנית של חלבון פלואורסצנטי GFP או YFP. באופן אידיאלי, קלטת ביטוי כרומוזומלית25 משמשת כדי למזער הטרוגניות פלואורסצנטית עקב וריאציה של מספר העתק פלסמיד. נדרשת עוצמה פלואורסצנטית מספקת, אך יש להימנע מרמות מוגזמות של חלבון פלואורסצנטי כדי למנוע ליקויי כושר של הפתוגן23. ניתן לקבל רמות ביטוי מתאימות על ידי בחירת מקדם מתאים וכוונון עדין של אתר הקישור הריבוזומלי25 או כל האזור הלא מתורגם (UTR) 5' 26. שנית, קיבוע הזלוף צריך לכלול שטיפה ראשונית עם חיץ כדי להסיר כמה שיותר אריתרוציטים ממחזור הדם. זה קריטי במיוחד עבור הטחול והכבד (אם כי הסרה מלאה של אריתרוציטים מאיברים אלה קשה). אריתרוציטים נותרים בולעים אור בחלק הנראה של הספקטרום ופוגעים באיכות ההדמיה27. שלישית, אחסון הרקמות הקבועות בהגנה הקפויה הוא קריטי להפחתת הפלואורסצנטיות של הרקמות, שהיא גבוהה במיוחד ברקמות דלקתיות ויכולה להאפיל על הפלואורסצנטיות החלשה יחסית של תאי הפתוגן11. רביעית, הקישור הצולבות היעיל של הרקמה לגוש האגרוז שמסביב הוא קריטי לחיתוך ויברטומי חלק מבלי שהרקמה תקפוץ החוצה מגוש האגרוז. חמישית, אותות פלואורסצנטיים וזיהויים כתאי פתוגן חייבים להיות מאומתים באופן עצמאי באמצעות גישות אורתוגונליות כגון צביעה בנוגדנים לרכיבים פתוגניים (כגון ליפופוליסכריד לחיידקים גראם-שליליים) ומיקרוסקופ קונפוקלי של המקטעים שנשלפו מטומוגרף11. חלק מהרקמות הנגועות מכילות חלקיקים פלואורסצנטיים אוטומטיים בעלי צורה דומה וספקטרום פלואורסצנטי חופף שניתן לפרש בקלות בטעות כתאי פתוגן. שישית, יש להשוות את כמות התאים הפתוגניים בתוך מיקרו-מושבות לגישות אורתוגונליות כגון מיקרוסקופ קונפוקלי כדי להעריך את הדיוק. יש לאמת את העומסים החיידקיים הכוללים המבוססים על חישובים אלה בהשוואה לגישות אורתוגונליות כגון ציטומטריית זרימה וציפוי.
שינויים חשובים בפרוטוקול STP הנמצא בשימוש נרחב כוללים הצבת מסנן פס צר 510/20 ננומטר לפני מכפיל אור 211, כדי להפחית את ההפרעה של אוטופלואורסנציה ירוקה-צהובה החזקה במיוחד בכבד, בטחול ובמדבקות פייר נגועות ומודלקות. האוטופלואורסצנטיות החזקה ופיזור האור המוגבר של איברים כאלה בהשוואה למוח (השולט ביישומים אחרים של STP) יוצרים גם צורך בתיקון יעיל יותר להארה לא אחידה. כשינוי נוסף, פרוטוקול זה משתמש בגישת CIDRE22 למטרה זו (איור 3) ופילוח מבוסס בינה מלאכותית של חיידקים. לבסוף, עיבוד מקדים של רקמות השתנה על ידי הכללת שלב הדגירה בהגנה קריופרוטקטורית ב -20 °C אשר מפחית את autofluorescence רקמות ובכך מקל על זיהוי של תאים פתוגניים קטנים עם פלואורסצנטיות חלשה יחסית11.
פתרון בעיות עשוי להיות נחוץ אם לא ניתן לזהות אותות פתוגנים, או שסגמנטציה מניבה רגישות לא מספקת (יותר מדי תאי פתוגן מתפספסים) או דיוק לא מספיק (יותר מדי חלקיקי רקע מפולחים כתאי פתוגן). אם ניתן לזהות אוטופלואורסצנטיות של רקמת הרקע אך יש מעט מדי אותות פתוגנים, הפתוגנים עשויים להכיל כמויות לא מספיקות של חלבונים פלואורסצנטיים. ניתן לבדוק זאת באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי של חלקי רקמה מאותה רקמה נגועה או ציטומטריית זרימה של הומוגנטים ברקמה19,28. סיבות בסיסיות יכולות להיות רמות ביטוי לא מספיקות או חוסר יציבות של קלטת הביטוי. אסטרטגיות הפחתה יכולות לכלול מקדמים חלופיים להנעת ביטוי, התאמת קודון של הגנים המקודדים את החלבון הפלואורסצנטי עבור מיני הפתוגנים, שימוש במבנים אפיזומליים עם מספר העתקים גבוה יותר, או ייצוב קלטות ביטוי על ידי אינטגרציה כרומוזומלית או השלמה מאוזנת-קטלנית29. הבחירה בחלבון פלואורסצנטי חשובה גם היא, אך זיהוי אפשרי באמצעות GFP.mut2, mWasabi, YPet ו-TIMERbac. אם הסגמנטציה אינה מדויקת, הדבר עלול להיגרם על ידי פלואורסצנטיות פתוגן חלשה מדי שניתן לטפל בה כמתואר לעיל, או רקע אוטופלואורסצנטי גבוה מדי ברקמות. זילוח נרחב של תמיסת שטיפה או דגירה ממושכת במאגר האחסון מיד לפני ההטבעה בבלוק האגרוז ובטומוגרפיה עשויים לפתור בעיות אלה. לבסוף, נדרש אימון מספיק של הרשת העצבית לסיווג מדויק, אך אימון מוגזם עלול להוביל להתאמת יתר הפוגעת בביצועים של דגימות חדשות.
כיום, אין שיטה אחרת שיכולה לצלם איברים שלמים ברזולוציה מרחבית מספקת בתלת-ממד לאיתור חיידקים בודדים. שיפורים עתידיים בניקוי רקמות ומיקרוסקופ יריעות אור עשויים להשיג רזולוציה דומה. זה עשוי לאפשר הדמיה במהירות גבוהה יותר ועם יותר תעלות פלואורסצנטיות.
מגבלה חשובה של STP היא רזולוציית הפיקסלים במישור של ~0.5 מיקרומטר ורזולוציה אנכית של 5 עד 10 מיקרומטר, שאינה מספיקה לפתרון חיידקים הממוקמים קרוב, למשל, בתוך מיקרו-מושבה צפופה. עם זאת, ניתן לאחזר קטעי רקמות לאחר טומוגרפיה עבור מיקרוסקופ קונפוקלי משני ברזולוציה גבוהה של חלקי רקמה נבחרים. מגבלה נוספת של STP היא זמינותם של שלושה תעלות פלואורסצנטיות בלבד, המגבילות את מספר הפלואורופורים שניתן לצלם בו זמנית. שוב, ניתוח משני של קטעי רקמה שאוחזרו בשיטות ריבוב יכול לחשוף את המיקום והעוצמה של סמנים רבים נוספים עבור חלקי רקמה נבחרים. מידע זה יכול להיות משולב במבנה התלת-ממדי הכולל של הרקמה הסובבת כפי שנקבע באמצעות STP.
לסיכום, פרוטוקול זה מאפשר חקירות מפורטות של אינטראקציות מארח-פתוגן ברמה המקומית וברמת האיבר כולו. הפרוטוקול צריך להיות ניתן להתאמה בקלות לפתוגנים אחרים (בתנאי שניתן להשיג אותם כזנים פלואורסצנטיים), איברים אחרים ומינים מארחים שונים.
למחברים אין מה לחשוף.
העבודה נתמכה על ידי הקרן הלאומית השוויצרית למדע 310030_156818, 310030_182315 ו-NCCR_ 180541 AntiResist (ל-DB).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals | |||
Agarose Low Melt | Roth | Art. 6351.5 25g | |
Boric acid | Sigma-Aldrich | 6768-500G | |
Instant adhesive Loctite 435 | Henkel | ||
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Poly(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | P5413-1kg | |
Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | PVP-100G | |
Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 71321-25g | |
Sodium hydroxide | Merck | 106453 | |
Sodium periodate | Sigma-Aldrich | 311448-100G | |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 71640-250G | |
Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71500-1KG | |
Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732-100g | |
Sucrose | AppliChem | A4734,1000 | |
Tris-buffered saline (TBS) | Merck | T5912-1L | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
Vacuum filtration 500 | TPP | TPP99250 | |
Equipment | |||
Blade | Campden Instruments Limited | 01-01-4692 | |
MAITAI Laser | Spectra-Physics | ||
Peel away plastic mold | Sigma-Aldrich | E6032-1CS | |
TissueCyte 1000 tomograph | TissueVision | ||
Antibody/dyes | |||
DAPI | Merck | D9542-5MG | |
Primary antibodies | |||
anti-LPS Salmonella, rabbit | Sifin | REF TS 1624 | |
anti-CD169-PE, clone 3D6.112 | Biolegend | 142403 | |
anti-Ly-6G-PE, clone 1A8 | Biolegend | 127608 | |
Secondary antibodies | Invitrogen | ||
chicken anti-rabbit Alexa 647 | Invitrogen | A-21443 | |
Software | Company | Version | |
Fiji | Image J | 1.54g or later | |
MATLAB | MathWorks | 2017b/2018b or later | |
Orchestrator (tomograph) | TissueVision | ||
Visualization software Imaris | Oxford Instruments | 9.9.0 or later |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved