מודל מורין מהונדס טריקולור לחקר פגיעה בלוחיות גדילה

Summary

פרוטוקול זה מתאר מודל עכבר משופר עבור פציעות לוחיות גדילה של עצם בגיל ההתבגרות. באמצעות עכברים טרנסגניים עם כתבים פלואורסצנטיים תלת-שושלותיים עבור סוגי קולגן I, II ו-X, המטריצות העיקריות הקשורות לשלוש תת-שכבות שונות של לוחית הגדילה, מיקום הפציעה מונחה על ידי פלואורסצנטיות טבעית מתחת למיקרוסקופ.

Abstract

לוחיות צמיחת הסחוס בעצמות ילדים מאפשרות הארכת גפיים אך הן חלשות ביחס לעצם, מה שהופך אותן מועדות להישבר כאשר העצמות עמוסות יתר על המידה. יש צורך בטיפולים טובים יותר עבור לוחיות גדילה שבורות קשות מכיוון שהתגובה לפציעה היא גשר גרמי שמתיך בטרם עת את לוחית הצמיחה, מה שמוביל לגפיים מעוותות ו / או עקומות. מודלים של פגיעה בלוחיות גדילה מועילים למחקרים מכניסטיים, אך הם מאתגרים מכיוון שקשה לדמיין ולפצוע במדויק את לוחיות הגדילה הקטנות בעכברים צעירים. אנו מתארים כאן מודל משופר של פגיעה בלוחיות גדילה באמצעות עכברים טרנסגניים עם כתבים פלואורסצנטיים תלת-שושלות עבור סוגי קולגן I, II ו-X.

עכברים אלה מראים פלואורסצנטיות טבעית הקשורה לשלוש תת-השכבות העיקריות של לוחית הגדילה. פגיעה בלוחית גדילה הדומה לפגיעה מסוג II של סולטר-האריס נוצרת באופן שניתן לשכפל באמצעות בור באמצעות החלק ההיפרטרופי של לוחית הגדילה כהתייחסות במהלך הדמיה חיה תחת הנחיית מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי. ניתוח היסטולוגיה קפואה של הפלואורסצנטיות הטבעית מפשט את הערכת התגובה התאית לפציעה. מתודולוגיה זו מייצגת קפיצה משמעותית במחקר הפגיעה בלוחיות הגדילה, ומספקת שיטה מפורטת וניתנת לשחזור לחקירת פתולוגיה ולהערכת אסטרטגיות טיפוליות חדשות.

Introduction

לוחיות צמיחת עצם ממלאות תפקיד מרכזי בצמיחה אורכית של עצמות ארוכות במהלך הילדות וההתבגרות¹. צלחת הגדילה, הממוקמת בקצות עצמות ארוכות, מורכבת ממספר אזורים, כאשר כונדרוציטים הם המרכיבים התאיים העיקריים האחראים לייצור ושמירה על אזור צמיחה דינמי זה. אוסיפיקציה אנדוכונדרלית של צלחת הצמיחה מתרחשת כדי להאריך ולהרחיב את העצמות באמצעות התקדמות רציפה של התפשטות chondrocyte, היפרטרופיה, אפופטוזיס, פלישה על ידי כלי הדם, גיוס של תאים osteoprogenitor, ולבסוף, היווצרות עצם². מכיוון שלוח הגדילה רך יחסית לעצם, הוא רגיש מאוד לשבר כאשר העצמות עמוסות יתר על המידה במהלך ספורט או פעילויות אחרות. סיווג סולטר-האריס מתאר חמישה סוגים שונים של פציעות לוחיות גדילה³. השבר מסוג II דרך האזור ההיפרטרופי של לוחית הצמיחה ורקמת העצם התחתונה הסמוכה הוא^{השכיח ביותר 4}. גשר גרמי נוצר לעיתים קרובות בתגובה לפציעות של האזור ההיפרטרופי או העצם הסמוכה ומוביל לאיחוי מוקדם מדי של חלקי העצם הארוכים הסמוכים⁵. גשרים גרמיים מעכבים את ההתרחבות הרגילה של לוח הצמיחה. נכון לעכשיו, אין טיפולים מונעים זמינים להיווצרות הגשר הגרמי, וחלקם נותרים ללא טיפול בהתאם לגיל המטופל וגודל הגשר הגרמי ומיקומו⁶. כאשר המום בגפיים חמור, האפשרויות הכירורגיות כוללות הסרה ואחריה השתלת חומרים אינטרפוזיציוניים כמו גומי שומן או סיליקון או אוסטאוטומיה מתקנת והליכי הארכת עצם; עם זאת, גשר גרמי עדיין עשוי לבצע רפורמה⁶. יש צורך במחקר נוסף כדי למנוע היווצרות גשרים גרמיים ולשפר את התוצאות של ילדים עם פציעות בלוחיות צמיחת עצם.

מספר מודלים של בעלי חיים הוקמו כדי לחקור את המנגנונים הבסיסיים ולפתח אסטרטגיות חדשות למניעת פגיעה בגשר הגרמי של לוחיות גדילה לאחר פציעה 7,8,9,10,11,12. מודלים אלה של בעלי חיים מתמקדים לעתים קרובות בלוחית הגדילה הטיביאלית הפרוקסימלית ובלוחית הגדילה של עצם הירך הדיסטלית כאתר הפציעה העיקרי, בהתחשב בכך שבדרך כלל מתרחשות פציעות אנושיות. הפגמים בעצמות בעלי החיים נוצרים על ידי גישה צידית הדומה למסלול שבר ממשי או על ידי גישה מעל או מתחת ללוחית הצמיחה המובילה לחור קידוח מרכזי בלוח הצמיחה. במודל חולדות שדווח בעבר, פגם בלוחית הגדילה נוצר על ידי החדרת בור שיניים דרך חלון קליפת המוח בפיר האמצע הטיביאלי וקידוח כלפי מעלה דרך מח העצם לכיוון מפרק הברך כדי לפגוע במרכז לוחית הצמיחה ^7,13. לחלופין, מודל עכבר עדכני משתמש בגישה רוחבית עם מחט קטנה כדי ליצור מסלול מחט מישורי דרך צלחת הצמיחה⁸. במודל חולדה נפוץ, הפגם נוצר בצלחת הצמיחה של עצם הירך הדיסטלית על ידי קידוח דרך הסחוס המפרקי בין הקונדילים ^9,14. בבעלי חיים גדולים יותר כמו ארנבות וכבשים, פגמים בלוחיות הצמיחה הושרו לרוחב ישירות בשוקה הפרוקסימלית ובעצם הירך הדיסטלית על ידי קידוח או חיתוך לתוך לוחית הצמיחה או על ידי התקרבות מלמטה ויצירת פגם מרכזי המשאיר את שולי לוחית הצמיחה ללא שינוי 10,11,12,15.

מודלים של מורין לפציעות של לוחיות גדילה הם יתרון למחקרים מכניסטיים שניתן להשיג עם עכברים מהונדסים גנטית, כגון מחקרי מעקב אחר שושלת תאי גזע⁸. עם זאת, אתגר משמעותי במודלים של חיות מורין או חולדה הוא השגת פגיעה עקבית ומדויקת בתת-אזור מסוים של לוחית הגדילה. פגיעה באזורים מסוימים של לוחית הצמיחה והעצם הסמוכה נדרשת כדי לחקות את אחד מנתיבי השבר הרלוונטיים מבחינה קלינית המתוארים בסיווגי סולטר-האריס. האתגרים עד כה במודלים של מכרסמים נובעים בעיקר מהיעדר אמצעי חזותי לזיהוי תת-השכבות של לוחית הגידול במהלך היצירה הכירורגית של הפגיעה. פרוטוקול זה מתאר טכניקה מעודנת ליצירת פגמים בלוחיות גדילה בשכבות ממוקדות של לוחית הגידול של מורין על ידי שימוש בעכברים טרנסגניים משולשים המבטאים קולגן I, II ו- X כתבי פלורסנט 16,17,18. הפלואורסצנטיות הצבעונית השונה של קולגנים אלה בכל אחד מהאזורים העיקריים של לוחית הגידול מאפשרת הבחנה חזותית של החלקים השונים של לוחית הגידול תחת מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי במהלך היצירה הכירורגית של הפגיעה בלוחית הגדילה. השימוש בעכברים טרנסגניים אלה מאפשר דיוק פציעות חסר תקדים בעכבר צעיר בשלב התפתחותי דומה לילדים שנפצעו.

Protocol

המחקר בוצע בהתאם להנחיות המוסדיים. כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מרכז הבריאות של אוניברסיטת קונטיקט (IACUC) לפני תחילת העבודה. מתווה של הפרוטוקול מתואר בסכמה של איור 1 .

איור 1: מתאר פרוטוקול הפגיעה בלוחיות גדילה בעכברי טריקולור קולגן ריפורטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

1. גידול עכברים והכנה לניתוח

1. גזע עכברי קולגן מהונדס טריקולור המבטאים Col1a1-GFPTpz, Col2a1-CFP ו- Col10a1-mCherry 16,17,18,19,20,21 לכל הליכי גידול סטנדרטיים להשגת גורים לניתוח בני שבועיים (± יום). אמת את ביטוי הטרנסגן המשולש על ידי גנוטיפ של מקטע קצה זנב תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. השתמש רק בעכברים החיוביים לכל שלושת הצבעים כדי למקסם את היתרון של מערכת הכתב במהלך ניתוח היסטולוגי עוקב.
   הערה: גיל זה של 2 שבועות (± 1 יום) נבחר כי לוחיות צמיחת העצם שלהם נמצאים בשלב דומה של התפתחות המתבגר האנושי²². פרוטוקול זה חל על שני המינים של עכברים.
2. ביום הניתוח או יום לפניו, יש לזהות באופן ייחודי כל עכבר המשמש לניתוח באמצעות ניקוב אוזניים לאחר חיטוי האוזן ואגרוף האוזן באמצעות רפידות חיטוי אלכוהוליות, לשקול כל עכבר ולרשום את הערך.
3. יש לגלח את כל הגפה האחורית הימנית מהירך ועד כף הרגל באמצעות קוצץ חשמלי בזמן שהעכבר נמצא תחת השפעת הרדמה איזופלורנית. כדי לגרום להרדמה בעכברים, יש להשתמש בתערובת של איזופלורן (2-3%) ו-100% חמצן, הניתנת בקצב זרימה של 1 ליטר/דקה בתוך תא אינדוקציה של 1-2 ליטר. הסר את העכבר וודא שעומק ההרדמה מספיק עם צביטת בוהן שלא אמורה לגרום לעכבר לזוז.
   הערה: עומק זה של הרדמה יחזיק מעמד מספיק זמן כדי לבצע את הגילוח ללא צורך בקונוס אף בהרדמה.
4. השתמש בהדמיית רנטגן עם הגדרת הספק של 26 kV (800 mA) כדי ללכוד תמונות טיביאליות בעכברים חיים תחת הרדמה הנגרמת על ידי איזופלורן כדי להקליט את אורך הגפיים הראשוני.
   1. לפני הכנסת העכברים לארון הרנטגן, יש לבצע הרדמה עמוקה באמצעות תערובת של איזופלורן (2-3%) ו-100% חמצן, הניתנת בקצב זרימה של 1 ליטר/דקה בתוך תא אינדוקציה של 1-2 ליטר.
   2. הניחו שלושה עכברים מורדמים במקביל על קיבתם בארון הרנטגן בגובה מדף המאפשר קבלת תמונה אחת הכוללת את כל שלושת העכברים. שחקו את הרגליים כך שהעצמות הטיביאליות לא יוסתרו מתחת לעכבר. לקבלת דיוק מדידה משופר, מקם סולם רדיופאק ליד העכבר במהלך הדמיה (איור 2A).
5. החזירו את העכברים המוכנים לכלוב הדיור שלהם עם עכבר האם כדי להמתין להליכים הכירורגיים הבאים.

2. הכנת ציוד כירורגי ואזור עבודה סטרילי

1. לעקר את הפריטים הבאים: 10-20 רפידות גזה, מקלוני מוליך כותנה, בורות שיניים (בקוטר 0.5 מ"מ), חתיכות שיניים, מלקחיים Graefe, מלקחיים המוסטטיים יתושים מעוקלים, מספריים עדינים מעוקלים, מחזיקי מחטים, בדיקות חניכיים, וגילופי דיסקואידים דנטליים.
2. אסוף אספקה סטרילית נחוצה נוספת: תרחיף להזרקה של buprenorphine, 20 G מחטים, מזרקים 1 מ"ל, וילונות מגבות, 5-0 לא צבוע, קלוע, מצופה, תפרים vicryl, povidone-יוד, מלוחים חוצצים פוספט, רפידות חיטוי אלכוהול, # 15 אזמלים, כפפות כירורגיות, צינור מחסום פני השטח הסביבתי, חומר סיכה לעיניים, תרסיס אתנול 70%. הפעל מעקר חרוזי זכוכית לעיקור נוסף של פריטים במהלך הניתוח וכרית חימום חשמלית מתחת לכלוב עכבר נקי עם מצעים מעוקרים.
3. נקו ועיקרו את שלב המיקרוסקופ הפלואורסצנטי, את המשטחים הסמוכים ואת מעמד מכשיר הניתוח באמצעות 70% אתנול. כסו אזורים אלה שיהפכו לסביבת העבודה הכירורגית בוילונות מגבות סטריליים.
4. הרכיבו את מערכת הקידוח הדנטלי האלקטרונית במהירות גבוהה. חבר את בקר כף הרגל האלקטרוני ליחידת הבקרה וכסה את כבל הידית בצינור מחסום משטח שעבר חיטוי. חבר את בור השיניים העגול הסטרילי בקוטר 0.5 מ"מ. הפעל את הבקר והגדר אותו ליחס הנעה של 1:1 ולכל היותר 30,000 סל"ד.
5. אבטח, בעזרת נייר דבק, את צינור מכונת האיזופלורן הגמיש המסתיים כשחרוט האף מכוסה בצינור מחסום משטח שעבר חיטוי על במת המיקרוסקופ הפלואורסצנטי.
6. הפעל את הסטריאומיקרוסקופ הפלואורסצנטי ואת הציוד הנלווה ופתח את תוכנת רכישת התמונה.

איור 2: שלבים עיקריים בהליך הפציעה של לוחית הגידול של הכתב הפלואורסצנטי התלת-שושלת. (A) מדידת אורך טיביאלי באמצעות הדמיית רנטגן של פקסיטרון באמצעות סרגל רדיופאק המונח לצד העכברים בארון הרנטגן. (B) מיקום תקין של עכבר מורדם לניתוח תחת סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי. טיביה פרוקסימלית מסומנת על ידי חץ שחור. (C) דוגמה לחתך שנעשה כדי לגשת ללוחית הצמיחה. (D) מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי המאיר את האזור ההיפרטרופי של לוח הגידול (חץ לבן). אזור ההתרבות הסמוך מסומן על ידי חץ צהוב. (E) תאורת אור בהירה של המנתח המניח את בור השיניים בקוטר 0.5 מ"מ כנגד לוחית הצמיחה. (F) מיקום מדויק של בור השיניים מונחה על ידי מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי לאזור ההיפרטרופי. (G) דוגמה לפגם בלוח גדילה מסוג Salter-Harris Type II (חץ לבן). פסי קנה מידה = 1 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. הליך פציעה של לוחית גידול טיביה פרוקסימלית

1. מרדימים את העכבר בתא ההרדמה איזופלורן, מכוונים את ריכוז האיזופלורן ל-2-3% ואת קצב זרימת החמצן ל-1 ליטר/דקה. ממתינים להשראת מצב הרדמה עמוק, מאומת על ידי בדיקת צביטת בוהן ותצפית על דפוסי נשימה.
2. לנהל מחצית המינון שנקבע של buprenorphine תת עורית מיד לאחר הסרת העכבר מן החדר. המינון של buprenorphine הוא בהתאם לפרוטוקול בעלי חיים מאושר.
3. מרחו חומר סיכה עיני כדי להגן על עיני העכבר מפני התייבשות במהלך הניתוח, והעבירו את העכבר במצב שכיבה לחרוט האף של מכונת האיזופלורן בשלב הסטריאומיקרוסקופ (איור 2B). התאימו את זרימת ההרדמה דרך חרוט האף ל-2% ואת קצב זרימת החמצן ל-1 ליטר/דקה.
4. יש לחטא את הגפה האחורית הימנית, אזור האגן, האספקט הקדמי של הגפה האחורית השמאלית והזנב ברצף עם פובידון-יוד ואחריו 70% אתנול.
5. יש לוודא המשך עומק יציב של הרדמה באמצעות בדיקת צביטת בוהן נוספת ותצפית על דפוסי הנשימה לפני תחילת הניתוח.
6. תחת תאורת אור בהירה, השתמשו באזמל #15 כדי ליצור חתך בעור ממש מתחת למפרק הברך באורך התחלתי של כ-5 מ"מ, כדי לחשוף את הקצה הפרוקסימלי של השוקה הימנית (איור 2C). השתמש מספריים כדי להאריך את החיתוך במידת הצורך. שמור על השוקה הנגדית השמאלית ללא פגע כך שתשמש כבקרה פנימית ללא פגיעה.
7. בצע דיסקציה קהה אנכית דרך השריר העליון בשוקה הפרוקסימלית באמצעות הצד האחורי של אזמל #15, הסרת הרקמה הרכה לחשיפה ברורה של צלחת הצמיחה.
8. כבו את אורות חדר הניתוח ובחרו את תעלת הפלואורסצנטיות הנכונה כדי להאיר את האזור הרצוי של לוחית הגידול. ערכות המסננים הדרושות כדי לצלם כל קולגן פלואורסצנטי הן Col 2 ציאן: ET436/20x (עירור), ET480/40 m (פליטה), Col 10 mCherry: ET577/20x (עירור), ET640/40 m (פליטה), Col 1 Topaz: ET500/20x (עירור), ET535/30 m (פליטה). מקמו את העכבר כך שיתבונן בלוח הגדילה הטיביאלי הפרוקסימלי (איור 2D). כוונן את פתח העור מעט יותר פרוקסימלי ולאחר מכן, דיסטלי כדי לוודא שלוח הגידול הטיביאלי נמצא בתצוגה ולא לוחית צמיחת עצם הירך.
9. צרו נגע דמוי סולטר-האריס מסוג II תוך כדי התבוננות דרך עינית המיקרוסקופ על-ידי מיקום מקדח השיניים בקוטר 0.5 מ"מ במקביל לציר הטיביאלי באמצע אזור לוחית הגידול ההיפרטרופית, תוך שימוש בגישה רוחבית (איור 2E,F). כדי ליצור פגם המחקה נגע מסוג סולטר-האריס מסוג II, יש לשמור על הגפה מקבילה למשטח העבודה, כך שמסלול הכניסה לבור לא יתנגש באפיפיזה. הפעילו לחץ על דוושת המקדחה כדי להתחיל סיבוב בור, ולחצו בעדינות על הבור לתוך לוחית הגדילה לפני שהפגם נכנס עמוק יותר מקוטר הבור (איור 2G).
   הערה: זוג ידיים שני המסייע בייצוב איבר העכבר מועיל.
10. השקו את אתר הנגע בטיפת PBS סטרילית כדי להסיר לכלוך.
11. יש לוודא את עומק הפגם ב-0.5 מ"מ באמצעות בדיקת חניכיים.

4. הליכים לאחר פציעה וסגירה

1. לאפיון פגם אפס זמן, יש לקצור את הגפה האחורית הפגועה ולשלוט באיבר לפני סגירת הרקמות. עקוב אחר קצירת הרקמה וההכנה לטומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת עוקבת (microCT) והדמיית קריו-היסטולוגיה בסעיף 6.
   הערה: בניסויים הכוללים השתלת חומר טיפולי בפגם בלוח הגדילה, הפגם עצמו יכול להכיל רק פיסת חומר ביולוגי שהיא בערך כדורית וקוטר 0.5 מ"מ או 0.082 מ"מ³ (0.082 μL) בנפח.
2. השתמש במלקחיים תחת הדמיה מיקרוסקופית כדי להחדיר את החומר הביולוגי או להזריק טיפול נוזלי לתוך הפגם בתוך צלחת הגידול. השתמש בנפח גדול יותר של חומר ביולוגי או חומר מוזרק אם תכנון המחקר אינו דורש שהטיפול יוגבל רק לפגם.
3. יישרו בזהירות מחדש את קצוות העור, וודאו שהחומר המושתל, אם בכלל, נשאר בטוח בתוך אתר הפגם.
4. השתמש בטכניקות תפירה קטועות עם 5-0 תפרים של חומצה פוליגליקולית כדי לאטום את החתך בעור ביעילות.
5. לנקות ביסודיות את האזורים שמעבר לאזור הכירורגי של שאריות פובידון-יוד באמצעות מטושים עם מים סטריליים, החלת זהירות כדי למנוע מגע עם הפצע ואזורים קרובים.
6. מוציאים את העכבר מחרוט האף האיזופלורני בשלב המיקרוסקופ לכלוב התאוששות, ומניחים אותו לרוחב על מצעים טריים מעל כרית חימום.
7. התבונן מקרוב בקצב הנשימה של העכבר במשך כ -5 דקות, מתן מינון buprenorphine הנותר עבור שיכוך כאבים בדיוק כמו ההשפעות של הרדמה isoflurane פוחתת, מסומן על ידי עלייה בקצב הנשימה, אבל לפני תחילת הניידות. החזיקו את העכבר בכלוב התאוששות מבודד עד שיפגין יכולות אמבולטוריות מלאות, ולאחר מכן יאחדו אותו עם אמו ואחיו.
8. בצע בדיקות יומיות במשך 48 השעות הראשונות לאחר הניתוח, ולאחר מכן הערכות שבועיות עד לנקודה של המתת חסד. דגש על סימני זיהום, יעילות תנועה, נגישות למזון ותקינות התפרים.
9. לגמול את העכברים בזמן הסטנדרטי (כלומר, 3 שבועות של גיל).

5. מדידות אורך גפיים

1. בהתבסס על נקודות הזמן שנקבעו על-ידי השערת הניסוי ותכנונו, הרדימו את העכברים באמצעות איזופלורן ובצעו הדמיית רנטגן לכל אורכה של עצם השוקה הפגועה והלא פצועה, כפי שמוצג באיור 2A ומתואר בסעיף 1.4. ציוני דרך מתאימים לביצוע מדידות עקביות של אורך הגפיים כוללים את החלק העליון של האפיפיזה הטיביאלית ואת הקצה הדיסטלי של השוקה במפרק הטיביוטלרי כפי שמוצג באיור 3.
   הערה: הדמיה משמשת להערכת פערים באורך הגפיים ובאורך הגפיים עקב הפציעה, כמו גם התפתחות הגשר הגרמי בתוך רקמות לוחית הצמיחה במרווחי זמן ספציפיים לאחר הניתוח.

6. דיסקציה של רקמות, קיבוע, הדמיית microCT והטבעה

1. יש להרדים את העכבר באמצעות חנק_CO2 , רצוי באמצעות מערכת אינדוקציה אוטומטית של CO₂ עם אישור מוות בשיטה חלופית כגון פריקת צוואר הרחם.
2. בודדו את שתי הגפיים האחוריות השלמות והסירו עור ושרירים מאזור הקופסית של העצם והברך כהכנה לניתוח היסטולוגי ומיקרו-CT.
   1. לפני הכנסת הגפיים האחוריות לתוך הקיבוע, הבלו את הפטלה בזהירות על ידי חיתוך שלה באמצעות מספריים מיקרו לנתח כדי להקל על חדירה קיבוע לתוך חלל הברך. השתמשו במזרק אינסולין 29 גרם לפיזור יסודי של פורמלין קר 10% חוצץ בכל אזורי חלל הברך. חמור האזור diaphyseal של עצם הירך ואת השוקה כדי לשפר את הגישה קיבוע לחלל המח. שמור על רקמת המפרק במצב מורחב לחלוטין בתוך קיבוע במשך 24-36 שעות ב 4 ° C על ידי קשירת אותו עם גזה למגבת דקה.
      אזהרה: פורמלין הוא רעיל ויש לטפל בו במכסה אדים תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים.
3. לאחר 24-48 שעות של קיבוע פורמלין ב -4 מעלות צלזיוס, בצע מיקרו-CT רנטגן ברזולוציה גבוהה של דגימות קונטרלטרליות ופגועות על ידי הדמיית microCT לאחר העברת דגימות ל- PBS, להערכת התפתחות גשר גרמי. השתמש בגודל ווקסל של 6.0 מיקרומטר, זמני דגימה של 330,000 אלפיות השנייה, והגדרות אנרגיה של 55,000 וולט בעוצמה של 145 μA.
4. לאחר הדמיית microCT ו-24 שעות נוספות של קיבוע פורמלין ב-4°C, שטפו את הדגימות ב-1X PBS במשך 3X5 דקות ולאחר מכן, טבלו את הדגימות ב-10% סוכרוז ב-1X PBS למשך שעה אחת, 20% סוכרוז ב-1X PBS למשך שעה אחת, ו-30% סוכרוז ב-1X PBS למשך הלילה. השתמשו במזרק אינסולין 29 גרם מלא בתמיסת סוכרוז כדי להבטיח שתמיסת הסוכרוז תחלחל לכל אזורי חלל הברך. מעבירים למקפיא בטמפרטורה של -80°C אם לא מטמיעים לאחר טבילת הסוכרוז למשך הלילה, כדי להבטיח שמירה על כתב GFP ופעילות אנזימטית של רקמות.
5. הסר כל רקמת שריר שארית מאזור המפרק לפני ההטבעה. אזנו את הדגימה עם מדיום הטבעה בהקפאה למשך הלילה, מה שמקל על חדירה בינונית לחלל הברך.
6. צפה בתמונות ה- microCT כדי לקבוע היכן ממוקמים הפגם והגשר הגרמי לפני ההטבעה. יש למרוח שכבה דקה של תווך ההטבעה הקריו-קריו-טבועה לתוך קריומולד ולמקם את השוקה/עצם הירך/מפרק המנותחים והמחוברים עדיין, כך שאזור העניין פונה ב-90° לפני השטח של תווך ההטבעה.
   הערה: כיוון זה מאפשר לחתך ללכוד את התצוגה הרוחבית של הפגם שנוצר לרוחב. אם הגשר הגרמי קרוב לקצה הפגם, אז כיוון זה גם ימנע את האפשרות להחמיץ את אזור העניין במהלך החלקים העבים הראשונים שנלקחו דרך הרקמה.
7. הניחו את הקריומולד על קרח יבש עד שמדיום ההטבעה בהקפאה יתמצק, ויאבטח את הדגימה. המשיכו למלא את הקריומולד במדיום תוך שמירה על קרח יבש.
8. לאחר אבטחת הדגימה, טבלו את הקריומולד ב-2-מתיל-בוטאן מקורר בקרח יבש עד להקפאה מלאה. לאחר ההקפאה, הסירו עודפי 2-מתיל-בוטאן, עטפו את הקריומולדים בצלופן, ואחסנו בטמפרטורה של -20°C או -80°C.
   הערה: לאחסון ממושך מעבר לחודש-חודשיים בתווך הטבעה בהקפאה, מומלץ -80°C כדי למנוע התייבשות. הקפאה בסיוע סרט והדבקה של הקטעים לשקופיות הזכוכית מתוארים קודם לכן²³.

7. הדמיה רציפה, צביעה והדמיה מחדש

1. ליישם הליך רציף של הדמיה, צביעה והדמיה מחדש כדי להקל על זיהוי וקולוקליזציה של אותות ביולוגיים מרובים באותו קטע רקמה כפי שתואר קודם לכן²³. באופן ספציפי עבור חלקי לוחית הגדילה של עכברי טריקולור קולגן ריפורטר, מומלץ לבצע את השלבים הבאים. גישה מסודרת זו מבטיחה הדמיה מקיפה הן של אותות מולקולריים והן של פרטים מבניים.
   1. בתחילה, לכוד אותות פלואורסצנטיים אנדוגניים עבור שלושת הקולגן בסבב הראשון של ההדמיה.
   2. החל צביעה כחולה calcein ותמונה עבור רקמה מינרלית²³, ואחריו חומצה phosphatase עמיד tartrate (TRAP) פעילות אנזימטית צביעה והדמיה²³.
      הערה: בעוד שתוצאות צביעת הפעילות האנזימטית של TRAP אינן מוצגות כאן, שלב צביעה זה מבוצע מכיוון שהוא חיוני להסרת מינרלים לפני תוצאות הצביעה של ספרנין O/Fast Green המוצגות בסעיף התוצאות המייצגות.
   3. בצע צביעה גרעינית 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) כמתואר להלן ולאחר מכן תמונה.
      1. הכניסו שקופיות שעברו הדמיה קודמת לצנצנת קופלין המכילה 1x PBS. השאירו אותם שקועים עד שהכיסויים יתנתקו מהמגלשות. לאחר הניתוק, יש להסיר ולייבש היטב את הכיסויים.
      2. יש למרוח תמיסת צביעה נגדית מסוג DAPI על החלקות הכיסוי, תוך שימוש בדילול של DAPI ביחס של 1:1,000 בתערובת של 50% גליצרול ו-1x PBS. המשך בתהליך ההדמיה לאחר היישום.
   4. סיימו עם היישום של Safranin O/Fast Green Stain כדי להדגיש את ארכיטקטורת הרקמה ולאחר מכן תמונה.
      הערה: בצע זאת כשלב המסכם כדי להתאים תמונות כרומוגניות לאותות פלואורסצנטיים.
      1. הכינו את תמיסות המטוקסילין ברזל של וייגרט. הכינו תמיסה A על ידי המסת 1 גרם של hematoxylin ב 100 מ"ל של 95% אתנול ותמיסה B על ידי שילוב של 4 מ"ל של 29% תמיסת ברזל כלורי, 95 מ"ל של מים נטולי יונים, ו 1 מ"ל של HCl מרוכז. ערבבו חלקים שווים של תמיסה A ו-B כדי ליצור את תמיסת המטוקסילין העובדת של וייגרט, יציבה למשך כ-4 שבועות.
      2. יש לטבול את המגלשות במים נטולי יונים, למשך 2X2 דקות כדי להתייבש.
      3. מרחו את תמיסת המטוקסילין העובדת של Weigert למשך 5 דקות.
      4. שטפו את המגלשות במי ברז במשך 5 דקות, ולאחר מכן לזמן קצר במים נטולי יונים, למשך דקה אחת.
      5. יש לצבוע בתמיסה ירוקה מהירה 0.2% (0.2 גרם FCF ירוק מהיר ב-100 מ"ל מים נטולי יונים) למשך 2 דקות.
      6. יש לשטוף בקצרה בחומצה אצטית 1% למשך דקה אחת.
      7. מכתים עם תמיסת 0.1% ספרנין O (0.1 גרם ספרנין O ב-100 מ"ל מים נטולי יונים) למשך דקה אחת.
      8. יש לשטוף במים נטולי יונים, עד לקבלת צבע מאוזן ויזואלית, כ-5 דקות.
      9. הרכיבו מחליקים ב-30% גליצרול במים שעברו דה-יוניזציה (הימנעו מ-PBS) והמשיכו מיד להדמיה כדי למנוע פיזור צבע מהרקמה. כדי להדגיש את תאי אזור המנוחה של לוחית הגדילה תמונת מוליך עם מסנן Cy5: ET640/30x (EX), ET690/50 m (EM).

תוצאות

פרוטוקול זה משתמש בעכברי כתב פלואורסצנטיים תלת-שושלת כדי לגרום לפגם בלוחית הגדילה הצידית בשוקה הפרוקסימלית בדיוק על ידי מינוף הפלואורסצנטיות האדומה הטבועה בקולגן מסוג X לצורך הדרכה כירורגית. התצוגה שיש למנתח בזמן שהוא מסתכל דרך עינית המיקרוסקופ עם ערכת המסננים mCherry מוצגת באיור 2D. הפלואורסצנטיות הטבעית מסוג X מאפשרת למנתח למקם את הבור באזור ההיפרטרופי וליצור פציעה שמחקה סוג נפוץ של פגיעה בלוחיות גדילה שמובילה לגשר גרמי (איור 2F). הפלואורסצנטיות מתחת לתעלה האדומה היא הבהירה ביותר, ולכן מומלצת לשימוש במהלך מיקום הבור. לחלופין, יצירת פגמים יכולה להיות מונחית על ידי שימוש בצבעים אחרים של הפלואורסצנטיות הטבעית של עכברים טרנסגניים משולשים אם מטרת הניסוי היא לחקור פציעות באזורים אחרים של לוחית הגדילה מאשר האזור ההיפרטרופי והאזור המסויד הסמוך.

יצירת פגם דמוי סולטר-האריס מסוג II באזור ההיפרטרופי של לוחית הגידול ורקמת העצם התחתונה הסמוכה, באמצעות בור שיניים בקוטר 0.5 מ"מ, אומתה באמצעות מיקרו-CT והדמיה קריו-היסטולוגית של הטיביאס הפרוקסימלי הפגוע (זמן 0) בהשוואה לבקרות הצידיות שלא נפגעו בעכברים N=3 (איור 4). קשה היה לראות את הפגמים בתמונות המיקרו-CT התלת-ממדיות, אך ניתן היה להבחין בהם בחתכים הדו-ממדיים (איור 3A,B,E,F). איור 3G מציג את ההתפלגות של תאי עצם מייצרי קולגן מסוג I (פלואורסצנטיות ירוקה), כונדרוציטים מתרבים מייצרי קולגן מסוג II (פלואורסצנטיות ציאן), וכונדרוציטים היפרטרופיים מייצרי קולגן מסוג X. בתמונה של העכבר הפגוע (איור 4G), יש הפרעה של האזור ההיפרטרופי, השכבה המסוידת זמנית, וחלק מהעצם החדשה ביותר שנוצרה ביחס לקבוצת הביקורת, כאשר אזור ההתרבות מופרע רק במעט. צביעת ספרנין O/Fast Green (איור 4H) ממחישה בצורה הטובה ביותר את מיקום הפגם בתוך לוחית הגדילה הפגועה, מאחר שכל התאים נראים בבירור.

ניתוח קרני רנטגן מספק תובנה מסוימת לגבי עכברים חיים לגבי ההשפעה של סוג זה של פגיעה בלוחיות גדילה על אורך השוקה והיווצרות גשר גרמי לאורך זמן (איור 3). הדמיה השוואתית בין טיביה לא פצועה (איור 3A) לפצועה (איור 3B), שצולמה לפני הניתוח ו-3 שבועות לאחר הניתוח, חושפת כמות גדולה של צמיחת גפיים, הידלדלות של לוחיות הגדילה ואזור אטום מובהק שהתפתח באזור לוחית הגדילה הפגועה לאחר 3 שבועות. אטימות זו בתוך לוחית הגדילה אינה קיימת אצל המקבילה שלא נפגעה וגם לא אצל העכברים לפני הניתוח. פקסיטרון הוא אפוא אחת הדרכים להתבונן בשינויים פתולוגיים הנגרמים על ידי הפציעה בעכברים חיים, כגון היווצרות גשר גרמי ושינויים באורך הגפיים.

הדמיית MicroCT של עצמות מנותחות מציעה הדמיה מפורטת של היווצרות גשר גרמי בתוך לוחיות הצמיחה הפגועות שלושה שבועות לאחר הניתוח (איור 5). כפי שניתן לראות בתמונות משישה עכברים פצועים שונים שמוצגים באיור 5, יש התפתחות עקבית של גשר גרמי בכל העכברים. באמצעות תוכנת Scanco Medical, נפח הגשר הגרמי חושב על-ידי סקירת כל קטע של לוחית הגידול הטיביאלית הפרוקסימלית, תיחום שטח הגשר הגרמי (איור 5B) בעזרת הכלי שנבחר, ולאחר מכן, שילוב כל אזור חתך לאורך כל נפח לוחית הגידול כדי לקבל את הנפח הכולל²⁴. נפח הגשר הגרמי שחושב בדרך זו היה 0.0761 מ"מ³ ± 0.0246 (ממוצע ± סטיית תקן, N = 6). רוב הגשרים הגרמיים נוצרים בסמוך לאמצע לוחית הגידול למרות הגישה הרוחבית, הפוגעת בקצה החיצוני כמו גם במרכז לוחית הצמיחה. ניתן לייחס תופעה זו לעובדה שתאי גזע מזנכימליים (MSCs) ממח העצם, ולא מהפריכונדריה, אחראים להיווצרות גשר גרמי²⁵.

בעכברים טרנסגניים טריקולור אלה, ניתוח קריו-היסטולוגי של לוחית הגדילה הפגועה מועשר על-ידי פלואורסצנטיות הקולגן הטבעית (איור 6). הוא חושף את יחסי הגומלין המורכבים של תאי עצם וכונדרוציטים באתר הפציעה. תמונות MicroCT המוצגות באיור 6J,K סופקו לטכנאי ההיסטולוגיה כדי להנחות את ההטבעה והחיתוך. תאי עצם מייצרי קולגן מסוג I נראים באיור 6L,O,P (פלואורסצנטיות ירוקה), בעוד שכונדרוציטים מייצרי קולגן מסוג II נראים באיור 6L,O,Q (פלואורסצנטיות של ציאן). כונדרוציטים היפרטרופיים מייצרי קולגן מסוג X נראים באיור 6L,O,R (פלואורסצנטיות אדומה). גישה פלואורסצנטית צבעונית זו מאפשרת בחינה מפורטת של התמיינות כונדרוציטים לאחר ניתוח באזור הגשר הגרמי על רקע רקמה מינרלית. צביעת DAPI שימשה כדי לאשר את ההתפלגות של כל סוגי התאים באזור לוחית הגידול (איור 6M). צביעת ספרנין O/Fast Green מדגימה את הארגון המרוכב והמבני של הסחוס והעצם בתוך לוחית הגדילה הפגועה (איור 6N). הדמיה של חלקים מוכתמים אלה תחת מערך פילטרים Cy5 מבהירה במיוחד את תאי אזור המנוחה בממשק שבין עצם האפיפיזה לסחוס.

איור 3: צילומי רנטגן של בקרה קונטרלטרלית וטיביה עכברית פצועה. (A) צילומי רנטגן של שוקת הבקרה הנגדית נלקחים ממש לפני הפציעה כאשר העכברים בני שבועיים ו-3 שבועות לאחר הניתוח כאשר העכברים בני 5 שבועות, מה שמדגים את מידת הגדילה המתרחשת בתקופה זו. (B) עצם השוקה הפגועה מאותן עכברים באותן נקודות זמן כמו ב-(A). ציוני הדרך המשמשים למדידות אורך השוקה הם קודקוד ראש השוקה הפרוקסימלי עד קצה השוקה במפרק הקרסול (חיצים דו-ראשיים אדומים). הגשר הגרמי האטום נראה בלוח צמיחת השוקה הפרוקסימלי הפגוע לאחר 5 שבועות. מוטות קנה מידה = 5.00 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: מיקרו-CT ותמונות היסטולוגיות של שליטה נגדית בזמן אפס ועצם השוקה הפרוקסימלית של עכבר פצוע. (A,E) ו-(B,F) מתארות תצוגות microCT תלת-ממדיות ודו-ממדיות רוחביות, כאשר הפגם מצוין על-ידי חיצים אדומים ב-(E) וב-(F). (ג,ז) תמונות קריו-היסטולוגיות מורכבות ממוזגות וממזגות שלוש שכבות פלואורסצנטיות מולדות עם שכבת רקמה מינרלית. תאים ירוקים (Col3.6GFPtpz) הם תאי עצם מייצרי קולגן מסוג I, תאים בצבע כחול ציאן (Col2A1GFPcyan) הם כונדרוציטים המייצרים קולגן מסוג II, ותאים אדומים (Col10A1RFPchry) הם כונדרוציטים היפרטרופיים מייצרי קולגן מסוג X. (ד,ח) ספרנין O/צביעה ירוקה מהירה של אותו אזור כמו (C) ו-(G). פסי קנה מידה = 1.0 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: תמונות MicroCT של גשרים גרמיים שנוצרו על-ידי פרוטוקול זה. (A,C,E,G,I,K) חתכים רוחביים של לוחית הגדילה הטיביאלית הפרוקסימלית של שישה עכברים שונים לאחר 3 שבועות לאחר יצירת פגם בור. גשר גרמי המסומן בקו אדום מקווקו ב-(A). (B,D,F,H,J,L) שחזורים תלת-ממדיים עם מישור אורכי שנחתך. גשר גרמי המסומן בקו אדום מקווקו ב-(B). פסי קנה מידה = 1.0 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: מיקרו-CT ותמונות היסטולוגיות של בקרה נגדית וטיביה פרוקסימלית של עכבר פצוע עם היווצרות גשר גרמי. (A,J) ו-(B,K) מתארות תצוגות microCT תלת-ממדיות ודו-ממדיות רוחביות, כאשר הגשר הגרמי מסומן על-ידי חיצים צהובים ב-(J) וב-(K). (ג,יב) תמונות קריו-היסטולוגיות מורכבות ממוזגות וממזגות שלוש שכבות פלואורסצנטיות מולדות עם שכבת רקמה מינרלית. תאים ירוקים (Col3.6GFPtpz) הם תאי עצם מייצרי קולגן מסוג I, תאים בצבע כחול ציאן (Col2A1GFPcyan) הם כונדרוציטים המייצרים קולגן מסוג II, ותאים אדומים (Col10A1RFPchry) הם כונדרוציטים היפרטרופיים מייצרי קולגן מסוג X. התיבה הלבנה מציינת את ההגדלה הגבוהה יותר המוצגת בחלוניות F ו - O. (ד,ז) הרקמה המינרלית וצביעת DAPI באזור לוחית הגידול של לוחות C ו - L. (ה,נ) ספרנין O/צביעה ירוקה מהירה של אותו אזור כמו (D) ו-(M) נסרקת עם פלואורסצנטיות cy5. (ו,א) הגדלה גבוהה יותר של שטח לוח הגידול בתמונה הממוזגת של לוחות C ו- L. (ג-י, פ-ר) תעלות בודדות של הפלואורסצנטיות המקומית מוצגות על רקע רקמה מינרלית. פסי קנה מידה = 1.0 מ"מ (A-E) ו- (J-N), = 250 מיקרומטר אינץ' (F-I) ו- (O-R). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

השימוש החדשני בעכברי כתב קולגן טריקולור מאפשר יצירת פגמים בלוחיות גדילה בגודל ובמיקום שנקבעו מראש, מה שמשפר משמעותית את הדיוק של מודלים ניסיוניים של מורין לפציעות של לוחיות גדילה. בהתחשב בגודל הקטן של עכברים בני שבועיים, זה קריטי להשתמש בור קטן 0.5 מ"מ כדי ליצור את הפציעה כדי למנוע החלשת הגפה וגרימת שבר בעובי מלא. המנתח חייב גם להפעיל מספיק לחץ בעת יצירת הפגם כדי למנוע קידוח עמוק מדי לתוך העצם מאותה סיבה. השימוש בפריופרוב הוא קריטי לאישור עומק פציעה עקבי.

כמו בכל ניתוח, חשוב לוודא עומק הרדמה מספיק, המאושר על ידי צביטת בוהן מדי פעם וסטריליות נשמרת לאורך כל הדרך. נקודה כירורגית נוספת בעלת חשיבות היא שדיסקציה קהה עם מגלף תוארה מכיוון שהיא מונעת פגיעה ברקמה רכה ומסייעת להבטיח שהעכברים יוכלו לארוב מיד לאחר ההתאוששות מההרדמה כדי להגיע לעכבר האם לתזונה ונוחות. מניסיוננו, הפצעים שנסגרו בתפרים נותרו סגורים בהצלחה ואין צורך בקליפים לפצעים. ניתוח בעכברים בגיל שבועיים מומלץ לחקות בצורה הטובה ביותר את הילד הצעיר שחווה שברים בלוחית הצמיחה. אחד החסרונות של פרוטוקול זה הוא שבהתחשב באופי הבלתי צפוי של הלידה, השימוש במודל עכבר זה דורש את זמינותו של המנתח בהתראה קצרה.

באשר למיקום הבור ליצירת הפגם, הפרוטוקול מתאר את יצירת הפציעה באמצעות סט פילטרים אדום mCherry/Texas שמאיר את האזור ההיפרטרופי בתוך לוחית הגידול בגלל בהירות הפלואורסצנטיות של קולגן X. כדי להבטיח שהפגיעה תיווצר בתוך לוחית הגדילה הטיביאלית, כדאי להזיז מעט את פתח הרקמה הרכה שמאלה וימינה כדי לוודא שלוח הצמיחה הטיביאלי הפרוקסימלי נמצא בעין, ולא עצם הירך. מעבר בין תעלות קבועות מסנן כדי להאיר את אזור הכונדרוציטים המתרבים או את חלקי העצם הסמוכים שימושי לאישור מיקום מדויק ביחס למיקום אזור השגשוג ומקטעי העצם הסמוכים.

בעוד שניתן להבחין בין אזור הכונדרוציטים המתרבים לבין העצם האפיפיזה והמטפיזה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בעכברים חיים, הערך האמיתי של מדווחי הקולגן מסוג II וסוג I מתממש במהלך הניתוח ההיסטולוגי של לוחית הגדילה. בהתחשב באופי המימי של תהליכים קריו-היסטולוגיים, פרוטוקולי משקעים כרומוגניים מסורתיים אינם מתאימים בשל חוסר התאמה פוטנציאלי של צבע עם הדמיה פלואורסצנטית הנגרמת על ידי שלבי התייבשות. למרות שהפרוטוקול המימי מניב דפוסי צביעה דומים לאלה שבמקטעי פרפין, הדמיה מהירה לאחר הצביעה חיונית למניעת דיפוזיית צבע מהרקמה. ניצול 30% גליצרול במים מזוקקים כאמצעי הרכבה יכול להאט דיפוזיה זו, ולאפשר צביעה כרומוגנית מרובה באותו קטע, כולל סחוס עם ספרנין O/Fast Green.

תהליך האוסיפיקציה האנדוכונדרלי נראה בבירור עם כונדרוציטים אדומים המצפים את הגשר הגרמי המתפתח (איור 6). שימוש נוסף בטכניקות אימונוהיסטוכימיות, שעבורן קיימים נוגדנים רבים למורין, עשוי לשפר עוד יותר מחקרים מכניסטיים שנערכו בעכברים טרנסגניים אלה. בסך הכל, השילוב של טכניקות פקסיטרון, מיקרו-CT והדמיה קריו-היסטולוגית במודל עכבר מהונדס זה מציע הבנה מקיפה של שינויים מקרוסקופיים ומיקרוסקופיים המתרחשים בתגובה לפציעות בלוחיות גדילה, וסולל את הדרך להתערבויות טיפוליות עתידיות כדי למתן תוצאות שליליות כאלה. מניפולציות גנטיות נוספות של עכברים טרנסגניים אלה יכולות להיעשות כדי לאפשר למחקרי מעקב אחר שושלות להבין את מקורם של התאים המעורבים באופן זמני ומרחבי בריפוי. ניסויים בעכברים עם שינויים נוספים יאפשרו לחקור מחלות סחוס כגון אוסטאוכונדרומה - צמיחת יתר של סחוס ועצם ליד צלחת הצמיחה.

העקביות של המודל שלנו מודגמת על ידי היווצרות ניתנת לשחזור של גשרים גרמיים בכל העכברים ללא צורך להשליך עכברים מהקבוצה עקב פגיעה בסחוס המפרקי. מדובר בשיפור לעומת מודלים קודמים שהתקרבו ללוחית הגדילה מחלון קליפת המוח מתחת ללוחית הגדילה וכיוונו כלי חד או בור כלפי מעלה לכיוון לוחית הגדילה ומדי פעם היו גולשים לסחוס המפרקי. פגיעה נוספת בסחוס המפרקי אינה מחקה את הפגיעות הנפוצות בלוחיות גדילה בילדים. הפגיעה המדויקת יותר של מודל בעלי חיים זה מפחיתה את מספר העכברים הנדרש לניסוי וזהו שיפור נוסף. השימוש בעכברים טרנסגניים מאפשר לחוקר למקד את הפגיעה בתת-מקטעים של לוחית הגדילה, כגון האזור ההיפרטרופי/הסתיידות זמנית או אזור האפיפיזה/אזור המנוחה/אזור השגשוג, מבלי להשפיע על הסחוס המפרקי. עם זאת, מגבלה של מודל זה היא השונות בנפח הגשר הגרמי, אשר יכול להיות שונה עד 30% בקרב בעלי חיים פצועים. כתוצאה מכך, גילוי השפעה משמעותית מבחינה קלינית על היווצרות גשרים גרמיים עדיין מחייב מספר רב של בעלי חיים כדי להשיג רלוונטיות סטטיסטית.

היתרונות למודל עכבר כפי שמתואר כאן בהשוואה למודלים של פציעה של לוחית גדילה של חולדה או ארנב שפורסמו בעבר 7,9,10,14, כוללים מספר נמוך יותר של בעלי חיים בשימוש, הפחתת עלויות, גודל שכפול יעיל עקב היווצרות מוטות גרמיים הניתנים לשחזור, מסגרת זמן מחקר קצרה יותר, ומיקום פציעה מדויק יותר עקב הדמיה חיה של עכברים טרנסגניים משולשים. למרות שלא נדון בפירוט, מודל עכבר זה יכול לשמש לבדיקת שתלים מהונדסים רקמות או ביו-חומרים המספקים גורמי גדילה. מגבלה בולטת של שיטת מורין זו היא שגודלו של שתל המשמש להעברת תרופות או תאים טיפוליים מוגבל לנפח פגם של כדור בקוטר 0.5 מ"מ בערך. רק מודלים גדולים יותר של בעלי חיים יכולים להכיל את נפח חומר הבדיקה שישמש בחולים אנושיים. פגם הבור שנוצר בפרוטוקול זה אינו זהה לגיאומטריה כמו שבר דק ולכן שונה מפגיעות אנושיות בפועל. עם זאת, היתרונות של מודל עכבר זה הם רבים, והגישה הצידית נמנעת מפגיעה בסחוס המפרקי שתתרחש כאשר מתקרבים בצורה עיוורת מעל או מתחת ללוחית הצמיחה בקו אחד עם הציר הארוך הטיביאלי. מתודולוגיה זו מייצגת קפיצה משמעותית במחקר הפגיעה בלוחיות הגדילה, ומספקת שיטה מפורטת וניתנת לשחזור לחקירת פתולוגיה ולהערכת אסטרטגיות טיפוליות חדשות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-methyl-butane	Sigma Aldrich	M32631
Alcohol antiseptic pads	Acme United Corporation	H305-200
Axio Scan.Z1	Carl Zeiss AG	Axio Scan.Z1
AxioVision software	Carl Zeiss AG
Betadine solution (10% povidone-iodine)	Avrio Health L.P.	67618-150-01
Calcein	Sigma Aldrich	C0875
Calcein Blue	Sigma Aldrich	M1255
CFP filter set	Chroma Technology Corp.	49001
Cryomatrix	Thermo Scientific	6769006
Cryomolds	Fisher Scientific	Fisherbrand #22-363-554
Cryostat	Leica Biosystems	3050s
Cryostat blades	Thermo Scientific	3051835
Cryotape	Section Lab	Cryofilm 2C
Curved fine scissor	Fine Science Tools	14061-11
Curved mosquito hemostatic forceps	HuFriedyGroup	H3
cy5 filter set	Chroma Technology Corp.	49009
DAPI	ThermoFisher Scientific	62247
DAPI filter set	Chroma Technology Corp.	49000
Dental bur (0.5 mm diameter)
Dental cleoid discoid carver	ACE Surgical Supply Inc.	6200097A-EA
Dry glass bead sterilizer (Inotech Steri 350)	Inotech Bioscience, LLC	IS-250
Ear punch	Fine Science Tools	24212-01
Electric heating pad
Electronic foot control	Nouvag AG	1866nou
Electronic motors 31 ESS	Nouvag AG	2063nou
Environmental surface barrier (3 x 12 inch tube sox)	Patterson Companies, Inc.	BB-0312H
Ethanol (70%)
Ethiqa XR (buprenorphine extended-release injectable suspension) 1.3 mg/mL	Fidelis Animal Health	86084-100-30
Faxitron x-ray cabinet	Kubtech Scientific	Parameter
Fluorescence Stereomicroscope	Carl Zeiss AG	Lumar V12
GFP filter set	Chroma Technology Corp.	49020
Glacial acetic acid	Sigma Aldrich	ARK2183
Glass microscope slides	Thermo Scientific	3051
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516
Graefe forceps	Fine Science Tools	11051-10
Handpiece (contra angle 32:1 push button)	Nouvag AG	5201
Implantology/oral surgery system control unit (Straumann)	Nouvag AG	SEM
Instant sealing sterilization pouch with dual internal/external process indicators (3 1/2 x 5 1/4  inch)	Fisher Scientific	01-812-50
Instant sealing sterilization pouch with dual internal/external process indicators (5 4/1 x 10 inch)	Fisher Scientific	01-812-54
Insulin syringe (29 G)	Exel International	26028
Isoflurane	Dechra Pharmaceuticals plc	17033-091-25
Isoflurane anesthetic system
mCherry filter set	Chroma Technology Corp.	39010
Micro-dissecting scissor	Fine Science Tools	14084-08
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761
Needle (20 G)	Becton, Dickinson and Company	305178
Needle holder	HuFriedyGroup	NHCW
Neutral buffered formalin (10%)	Sigma Aldrich	HT501128-4L
Non-sterile applicator swabs	Allegro Industries	205
Non-woven gauze (3 x 3 inch)	Fisher Scientific	22028560
Norland Optical Adhesive, 61	Norland Optical	Norland Optical Adhesive, 61
Ophthalmic ointment (Optixcare eye lube)	CLC Medica
PBS	Sigma Aldrich	P5368
Periodontal probe	HuFriedyGroup	PQW
Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 (1x)	Gibco, by Life Technologies	10-010-023
Plastic microscope slides	Electron Microscopy Sciences	71890-01
Professional clipper/trimmer (Wahl Classic Peanut)	Wahl Clipper Corporation	8685
Roller	Electron Microscopy Sciences	62800-46
Scanco Medical software	SCANCO Medical	Scanco μCT 50
Sodium acetate anhydrous	Sigma Aldrich	S2889
Sodium nitrite	Sigma Aldrich	S2252
Sodium tartrate dibasic dihydrate	Sigma Aldrich	T6521
Specimen disc	Leica Biosystems	14037008587
Stainless steel #15 surgical blade	Aspen Surgical Products, Inc.	371615
Sterile surgical gloves	Cardinal Health, Inc.	2D72PT65X
Sterile towel drape (18 x 26 inch)	IMCO	4410-IMC
Sucrose	Sigma Aldrich	S9378
Syringe (1 mL)	Becton, Dickinson and Company	309659
Undyed braided coated vicryl suture (5-0)	Ethicon Inc.	J490G
UV black light	General Electric	F15T8-BLB