שיטות להפעלת תעתיק מרחבי של רקמות עצם

Summary

כאן, אנו מתארים שיטה המאפשרת decalcification של רקמות עצם שהושגו טרי ושימור של RNA באיכות גבוהה. שיטה מודגמת גם לחיתוך דגימות פורמלין קבוע פרפין משובץ (FFPE) של עצמות לא demineralized כדי להשיג תוצאות באיכות טובה אם רקמות טריות אינן זמינות או לא ניתן לאסוף.

Abstract

הבנת הקשר בין התאים ומיקומם בתוך כל רקמה היא קריטית כדי לחשוף את התהליכים הביולוגיים הקשורים להתפתחות תקינה ולפתולוגיה של מחלות. שעתוק מרחבי היא שיטה רבת עוצמה המאפשרת ניתוח של כל התעתיק בתוך דגימות רקמה, ובכך מספקת מידע על ביטוי הגן התאי ועל ההקשר ההיסטולוגי שבו שוכנים התאים. בעוד שיטה זו כבר בשימוש נרחב עבור רקמות רכות רבות, היישום שלה עבור ניתוח של רקמות קשות כגון עצם היה מאתגר. האתגר העיקרי טמון בחוסר היכולת לשמר RNA ומורפולוגיה של רקמות באיכות טובה בעת עיבוד דגימות הרקמה הקשה לחיתוך. לכן, מתוארת כאן שיטה לעיבוד דגימות רקמת עצם טריות שהושגו כדי ליצור ביעילות נתוני שעתוק מרחבי. השיטה מאפשרת דה-הסתיידות של הדגימות, תוך הענקת קטעי רקמה מוצלחים עם פרטים מורפולוגיים שהשתמרו תוך הימנעות מפירוק RNA. בנוסף, ניתנות הנחיות מפורטות לדגימות שהיו בעבר מוטמעות פרפין, ללא דה-מינרליזציה, כגון דגימות שנאספו מבנקי רקמות. באמצעות הנחיות אלה, מוצגים נתוני שעתוק מרחבי באיכות גבוהה המופקים מדגימות בנק רקמות של גידול ראשוני וגרורות ריאה של אוסטאוסרקומה בעצם.

Introduction

עצם היא רקמת חיבור מיוחדת המורכבת בעיקר מסיבים של קולגן מסוג 1 ומלחים אנאורגניים¹. כתוצאה מכך, העצם חזקה ונוקשה להפליא ובו בזמן קלה ועמידה בפני טראומה. כוחה הגדול של העצם נובע מתכולת המינרלים שלה. למעשה, עבור כל עלייה נתונה באחוז תכולת המינרלים, הנוקשות עולה פי חמישה². כתוצאה מכך, חוקרים נתקלים בבעיות משמעותיות כאשר הם מנתחים, באמצעות חתך היסטולוגי, את הביולוגיה של דגימת עצם.

היסטולוגיה של עצם לא מסוידת היא אפשרית ולפעמים נדרשת, בהתאם לסוג החקירה (למשל, כדי לחקור את המיקרו-ארכיטקטורה של העצם); עם זאת, זה מאתגר מאוד, במיוחד אם הדגימות גדולות. במקרים אלה, עיבוד רקמות למטרות היסטולוגיות דורש מספר שינויים של פרוטוקולים סטנדרטיים וטכניקות³. באופן כללי, כדי לבצע הערכות היסטולוגיות נפוצות, רקמות העצם מסוידות מיד לאחר הקיבוע, תהליך שעשוי להימשך מספר ימים עד מספר שבועות, תלוי בגודל הרקמה ובחומר ההסתיידות המשמש⁴. חלקים מסוידים משמשים לעתים קרובות לבדיקת מח עצם, אבחון גידולים וכו '. ישנם שלושה סוגים עיקריים של חומרי הסתיידות: חומצות חזקות (למשל, חומצה חנקתית, חומצה הידרוכלורית), חומצות חלשות (למשל, חומצה פורמית), וחומרים כלאטיים (למשל, חומצה אתילאנדיאמיןטטרצטית או EDTA)⁵. חומצות חזקות יכולות לפרק את העצם במהירות רבה, אך הן עלולות לפגוע ברקמות; חומצות חלשות נפוצות מאוד ומתאימות להליכי אבחון; סוכני כלציה הם ללא ספק הנפוצים ביותר והמתאימים ביותר ליישום מחקרי, שכן במקרה זה, תהליך הדה-מינרליזציה הוא איטי ועדין, ומאפשר שמירה על מורפולוגיה באיכות גבוהה ושימור מידע על גנים וחלבונים, כפי שנדרש על ידי הליכים רבים (למשל, הכלאה באתר , immunostaining). עם זאת, כאשר כל התעתיק צריך להישמר, כגון עבור ניתוח ביטוי גנים, אפילו דה-מינרליזציה איטית ועדינה עלולה להזיק. לכן, יש צורך בגישות ושיטות טובות יותר כאשר הניתוח המורפולוגי של הרקמות צריך להיות משולב עם ניתוחי ביטוי גנים של התאים.

הודות לשיפורים האחרונים בריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) ובשעתוק מרחבי, ניתן כעת לחקור את ביטוי הגנים של דגימת רקמה גם כאשר נעשה שימוש בהטבעה של פרפין קיבוע פורמלין (FFPE) לאחסון דגימות הרקמה ^6,7,8. הזדמנות זו פתחה גישה למספר גדול יותר של דגימות, כגון אלה המאוחסנות בבנקי רקמות ברחבי העולם. אם רוצים להשתמש ב-scRNA-seq, שלמות ה-RNA היא הדרישה החשובה ביותר; עם זאת, במקרה של תעתיק מרחבי של דגימות FFPE, הן קטעי רקמה באיכות גבוהה והן RNA באיכות גבוהה נחוצים כדי לדמיין את ביטוי הגן בהקשר ההיסטולוגי של כל קטע רקמה. אמנם זה הושג בקלות עם רקמות רכות, אותו הדבר לא ניתן לומר עבור רקמות קשות כמו עצם. למעשה, למיטב ידיעתנו, מעולם לא בוצע מחקר באמצעות תעתיק מרחבי על דגימות עצם מסוג FFPE. הסיבה לכך היא היעדר פרוטוקולים שיכולים לעבד ביעילות רקמות עצם FFPE תוך שמירה על תכולת ה- RNA שלהם. כאן, שיטה לעבד ו decalcize דגימות רקמת עצם שהושגו טרי תוך הימנעות השפלה RNA מסופק הראשון. לאחר מכן, מתוך הכרה בצורך בניתוח תמלול של דגימות FFPE שנאספו בבנקי רקמות ברחבי העולם, מוצגות גם הנחיות שפותחו לטיפול נכון בדגימות FFPE של עצמות לא דה-מינרליות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל ההליכים המתוארים להלן בבעלי חיים אושרו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה בבית הספר לרפואת שיניים באוניברסיטת פיטסבורג.

1. שיטה להכנת בלוקים FFPE של דגימות רקמת עצם הדורשים דה-מינרליזציה

1. הכנת ריאגנטים וחומרים
   1. הכינו EDTA 20% pH 8.0. עבור 1 L, להמיס 200 גרם של EDTA ב 800 מ"ל של מים טהורים במיוחד, להתאים pH ל 8.0 עם hydroxide נתרן 10 N ולבסוף להביא את נפח 1L עם מים טהורים במיוחד. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
      הערה: יש להשתמש תמיד ב-EDTA טרי 20% pH 8.0. נתרן הידרוקסידי (NaOH) 10 N מוכן על ידי המסת 400 גרם של NaOH ב 1 L של מים טהורים במיוחד.
   2. הכינו פרפורמלדהיד (PFA) 4% במכסה אדים תוך שימוש ב-PBS אחד ללא סידן ומגנזיום.
      הערה: הקצו אזור במכסה אדים לעבודה עם תמיסות פרפורמלדהיד מרוכזות, או מוצקי פרפורמלדהיד, ותייגו אותו ככזה. כדי למנוע חשיפה, יש לשמור על המכולות סגורות ככל האפשר. השתמש בכמויות המעשיות הקטנות ביותר הדרושות לניסוי המבוצע. אם לא ניתן להשתמש באבקת פרפורמלדהיד ובסולם השקילה במכסה אדים, יש ליטול תחילה מיכל, ולאחר מכן להוסיף אבקת PFA למכסה המנוע ולכסות לפני שתחזור למשקל האבקה. יש להשתמש תמיד ב-4% PFA טרי שהוכן.
   3. השתמש במיכל מתאים לכל דגימה.
      הערה: לדוגמה, עבור 1 מ"ג של רקמת עצם, השתמש במיכל המאפשר לפחות 1 מ"ל של כל תמיסה להיות במגע עם העצם.
   4. לעקר את כל ציוד הניתוח הדרוש לנתיחה.
   5. נקה את כל האזורים עם פתרון טיהור כדי להסיר RNases.
   6. אספו את שאר חומרי הניסוי, כולל מיכלי קרח, תרסיס אתנול 70%, וקבלו גישה לשייקר מסלולי.
2. בידוד דגימות רקמת עצם מעכברים
   1. הרדימו את העכבר על ידי חשיפה_ל-CO2 , ולאחר מכן בצעו נקע צוואר הרחם והשכיבו אותו על גבו. רססו את עור העכבר באתנול 70%.
   2. בעזרת מספריים סטריליים לניתוח, פותחים את העור וחושפים את שריר הרגל. חתכו את השריר לצד הרגל כדי לקבל תמונה ברורה של מיקום העצם, ופרקו בעדינות את העצם כדי להסיר אותה ללא נזק.
      הערה: אין צורך להסיר לחלוטין את כל השריר המחובר לעצם. נסו להיות מהירים ככל האפשר כדי להגביל את פירוק הרנ"א.
   3. הניחו מיד את דגימת העצם בצינור המכיל 4% PFA והניחו את הצינור על קרח.
   4. חזור על ההליך כדי לאסוף דגימות עצם אחרות לפי הצורך.
   5. שים דגימות עם 4% PFA בסערה על שייקר מסלול ב 140 סל"ד ב 4 ° C במשך 24 שעות לפחות כדי לאפשר קיבוע נכון.
3. הסתיידות של דגימות רקמת עצם
   1. אחזר את רקמת העצם מן המנער האורביטלי לאחר קיבוע.
   2. שטפו את רקמת העצם פעמיים עם 1x PBS במשך 3 דקות על שייקר אורביטלי ב-140 סל"ד כדי להסיר כל PFA שנותר.
   3. בעזרת מספריים סטריליים לניתוח, הסירו את השרירים שנותרו מחוברים לעצם.
   4. שטפו את רקמת העצם פעם נוספת עם 1x PBS למשך 3 דקות.
   5. הניחו את רקמת העצם במיכל חדש עם 20% EDTA pH 8.0. לאחר מכן, הניחו את המיכל על שייקר מסלול במהירות 140 סל"ד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
   6. השליכו את התמיסה, הוסיפו 20% EDTA pH 8.0 טרי למיכל, והניחו אותו על שייקר מסלולי במהירות 140 סל"ד למשך 30 דקות ב-RT.
   7. חזור על שלב 1.3.6 10 פעמים.
   8. השליכו את התמיסה, הוסיפו 20% EDTA pH 8.0 טרי במיכל, והניחו אותו בטמפרטורה של 4°C בחדר קר על שייקר מסלולי, ב-140 סל"ד למשך הלילה.
4. התייבשות דגימות רקמת עצם
   1. אחזר את דגימת רקמת העצם מהמיכל.
   2. בדוק את הרקמה ווידא את יעילות ההסתיידות על ידי סיבוב וסיבוב עדין של העצם. לחילופין, בצעו צילום רנטגן של העצם באמצעות מכונת רנטגן.
      הערה: אם הדגימה מתגמשת בקלות, הושגה דרגה טובה של הסתיידות. אם לא, יש להגדיל את פרמטרי ההסתיידות (זמן, מהירות התסיסה, נפח של 20% EDTA pH 8.0. בשימוש וכו ').
   3. שטפו את רקמת העצם פעמיים עם 1x PBS למשך 3 דקות כדי להסיר שאריות של EDTA.
   4. מניחים את רקמת העצם במיכל חדש ומתחילים התייבשות עם 70% אתנול. דוגרים במשך 15 דקות ב-140 סל"ד.
   5. השליכו את תמיסת האתנול 70%, הכניסו את הדגימה לתמיסת אתנול 90% ודגרו במשך 15 דקות ב-140 סל"ד.
   6. השליכו את תמיסת האתנול 90%, הכניסו את הדגימה ל-100% אתנול ודגרו במשך 15 דקות ב-140 סל"ד.
   7. השליכו את ה-100% אתנול, הכניסו את הדגימה לאתנול 100% חדש ודגרו במשך 15 דקות ב-140 סל"ד.
   8. השליכו את ה-100% אתנול, הכניסו את הדגימה לאתנול 100% חדש ודגרו במשך 15 דקות ב-140 סל"ד.
   9. השליכו את ה-100% אתנול, הכניסו את הדגימה לאתנול 100% חדש ודגרו במשך 30 דקות ב-140 סל"ד.
   10. השליכו את ה-100% אתנול, הכניסו את הדגימה לאתנול 100% חדש ודגרו במשך 45 דקות ב-140 סל"ד.
       הערה: ניתן לבצע התייבשות גם באמצעות מעבד אוטומטי. במקרה זה, הגדר את התוכנית עם אותם תנאים שדווחו עבור התייבשות ידנית. התנאים המדווחים הם עבור דגימות בעובי שאינו עולה על 4 מ"מ (כלומר, דגימות רקמת עצם שהתקבלו מעכברים). עבור דגימות בעובי של יותר מ-4 מ"מ, יש לקבוע את תזמון ההתייבשות באופן ניסיוני.
5. ניקוי דגימות רקמת עצם
   1. הניחו את דגימת רקמת העצם במיכל חדש והתחילו את תהליך הניקוי באמצעות קסילן. דגירה במשך 20 דקות ב-140 סל"ד.
   2. השליכו את הקסילן המשומש, הוסיפו קסילן חדש ודגרו במשך 20 דקות נוספות ב-140 סל"ד.
   3. השליכו את הקסילן המשומש, הוסיפו קסילן חדש ודגרו במשך 45 דקות ב-140 סל"ד.
      הערה: ניתן לבצע ניקוי גם באמצעות מעבד אוטומטי. במקרה זה, הגדר את התוכנית עם אותם תנאים שדווחו עבור הניקוי הידני. התנאים המדווחים הם עבור דגימות בעובי שאינו עולה על 4 מ"מ (כלומר, דגימות רקמת עצם שהתקבלו מעכברים). עבור דגימות בעובי של יותר מ-4 מ"מ, יש לקבוע את העיתוי באופן ניסיוני.
6. חדירה והטבעה של דגימות רקמת עצם
   1. אחזר את דגימת רקמת העצם מהשייקר האורביטלי / מעבד אוטומטי לאחר ניקוי.
   2. מניחים את דגימת רקמת העצם בקלטת הטבעה ומתחילים חדירה עם שעווה (ראו טבלת חומרים). יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורה של 60°C.
   3. יש להשליך את השעווה המשומשת, להוסיף שעווה חדשה ולדגור במשך 30 דקות בחום של 60°C.
   4. יש להשליך את השעווה המשומשת, להוסיף שעווה חדשה ולדגור במשך 45 דקות בטמפרטורה של 60°C.
   5. מניחים בזהירות את דגימת רקמת העצם בתבנית עם הכיוון הרצוי.
   6. אפשרו לגוש הדגימה להתמצק על משטח קר.
   7. אחסן את ה- FFPE המתקבל ב- 4 ° C עד מוכן להתחיל בחתך.
      הערה: ניתן לאחסן בלוק FFPE במשך שנים רבות לפני ביצוע החיתוך.

2. הנחיות לחלוקה של דגימות FFPE לא מינרליות

הערה: ההנחיות הבאות מספקות עצות והוראות חשובות שימושיות לשיפור משמעותי של איכות חלקי הרקמה תוך הימנעות מפירוק RNA, במיוחד במקרים של דגימות עצם קטנות ללא הסתיידות. הנחיות אלה עשויות להיות מיושמות גם על דגימות עצם מסוידות כאשר הן זמינות. עבור דגימות רקמת עצם גדולות יותר, demineralization צריך להתבצע כדי להשיג חלקים באיכות טובה יותר; במקרים כאלה, יש לעקוב אחר השיטה שדווחה לעיל, ולהתאים פרמטרים (תזמון, נפחי פתרונות וכו ') בהתאם. ההנחיות הבאות מתאימות כאשר רקמות עצם FFPE כבר עובדו (למשל, בלוק FFPE שנאסף מבנקי רקמות או מעבדות אחרות) או כאשר החלקים שנאספו ישמשו לביצוע כל סוג של ניתוח הדורש RNA באיכות טובה, קטעי רקמות באיכות גבוהה, או שניהם.

1. הכנת ציוד
   1. רססו את כל משטחי העבודה והמכשירים בתמיסות טיהור כדי להסיר RNases.
   2. הכינו אמבט מים עם מים מזוקקים כפול וקבעו את הטמפרטורה ל 42 מעלות צלזיוס.
   3. קח להב microtome, לרסס אותו עם 70% אתנול כדי להסיר שאריות שמן, ולאחר מכן לרסס אותו עם פתרונות טיהור כדי להסיר RNases.
   4. אבטחו את הלהב על המיקרוטום. ודא שזווית המרווח מוגדרת ל- 10°.
      הערה: השתמש תמיד בלהבים חדשים לחלוקה למקטעים.
   5. הכינו שני דליי קרח.
   6. קחו פינצטה, מברשות ובדיקות, רססו אותן בתמיסות טיהור כדי להסיר RNases, והניחו אותן באחד משני דליי הקרח.
   7. הכינו אמבט קרח על ידי הוספת מים מזוקקים פעמיים לדלי הקרח השני.
      הערה: בלוק FFPE לא צריך לצוף במים הנוספים; לכן, כמות המים המוספים לדלי הקרח חייבת להספיק כדי לאפשר לדגימה להיות רטובה מבלי לצוף.
2. חלוקה למקטעים
   1. אחזר את בלוק ה- FFPE מהאחסון ב- 4 ° C והנח אותו על המיקרוטום. הגדר את הפקודה לחיתוך או לעובי גלילה של 14 מיקרומטר, והתחל לחתוך את הדגימה עד לחשיפת הרקמה.
      הערה: אם בלוק FFPE כבר נחתך והרקמה כבר חשופה, דלג על שלב 2.2.1. ודא שהבלוק נקי מחורים וסדקים. אם כן, המשך ישירות לשלב 2.2.2. אם לא, לחתוך כמה חלקים כדי לשטח את פני השטח ולמנוע את החורים והסדקים, ולאחר מכן להמשיך לשלב 2.2.2.
   2. הניחו את בלוק ה-FFPE על אמבט הקרח כדי ללחלח את הדגימה. זמן ההידרציה חייב להיקבע באופן ניסיוני.
      1. התחל עם 2 דקות והגדל את הזמן אם הידרציה אינה מספיקה. אין לחרוג מ-10 דקות. ההידרציה תרחיב את הרקמה ותפחית את היווצרותם של "תריסים וקווים" ונציאניים. זמני הידרציה ארוכים יותר עלולים לגרום לסדקים בבלוק הפרפין ואולי גם להיפרדות רקמות.
      2. אם 10 דקות אינן מספיקות כדי לייבש את הדגימה, בצעו מחזורי הידרציה לא יותר מ-10 דקות ונסו שוב לחתוך.
      3. אם פני השטח של הבלוק אינם חלקים ונקיים עקב סדקים או חתכים, שקול להטביע מחדש את הדגימה. איכות ה-RNA לא תושפע מתהליך ההטבעה מחדש.
   3. שים את הדגימה במהדק הדגימה של המיקרוטום, יישר אותו עם הלהב, והתחל לחתך. הגדר את עובי הגלילה ל- 5 מיקרומטר.
   4. אספו את החלק והניחו אותו באמבט המים ב 42 מעלות צלזיוס באמצעות פינצטה קרה ומברשות.
      הערה: לחלופין, אם יבוצע בידוד RNA של חלקי רקמות, יש לאסוף את המקטעים בצינור צנטריפוגה ולעקוב אחר מפרט הייצור להכנת RNA (ראה טבלת חומרים).
   5. לדגור את החלק באמבט המים כדי למתוח את הרקמה ולחסל כל קמטים שיורית וקפלים.
      הערה: זמן הציפה באמבט המים עבור כל קטע חייב להיקבע באופן ניסיוני. שקול להשאיר את חלקי העצם דקה נוספת אם מתרחשות בעיות ניתוק רקמות. אל תשאירו את החלק צף זמן רב מדי מכיוון שזמני ציפה ארוכים עלולים לפגוע ברקמה.
   6. מניחים את החלק על מגלשת זכוכית, ולאחר מכן לדגור אותו במשך 3 שעות ב 42 מעלות צלזיוס.
   7. הניחו את מגלשת הזכוכית במייבש או בתנור למשך הלילה ב-RT לייבוש מתאים.
   8. אחסן את שקופית הזכוכית עם המקטע המצורף ב- RT בתיבת שקופיות.
      הערה: ניתן לאחסן שקופיות במשך שנים רבות ב- RT. אם יבוצע שעתוק מרחבי, במקום שקופית זכוכית, מקם את המקטע בשקופית ביטוי הגן המרחבי שסופקה על ידי היצרן ופעל לפי ההמלצות המדווחות (ראה טבלת חומרים).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

השיטה המוצגת כאן מתארת כיצד לעבד עצמות מבודדות טריות כדי לקבל דגימות FFPE נטולות מינרלים שניתן לחתוך בקלות באמצעות מיקרוטום תוך שמירה על שלמות הרנ"א (איור 1). השיטה יושמה בהצלחה על עצם הירך אך ניתן לעקוב אחריה עבור דגימות רקמת עצם אחרות בממדים דומים, או שניתן להתאים אותה לדגימ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

כאן, ניתנת שיטה מפורטת להכנת בלוקים FFPE של עצמות מסוידות ושמירה על שלמות RNA לריצוף (כלומר, ריצוף הדור הבא (NGS)) או לטכניקות אחרות הקשורות ל- RNA (כלומר, הכלאה באתר , תגובת שרשרת פולימראז כמותית של שעתוק לאחור (qRT-PCR) וכו ').

השיטה משתמשת ב- EDTA כדי להסיר דגימות רקמת עצם; הדגירה של EDTA ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced orbital shaker	VWR	76683-470	Use to keep tissues under agitation during incubation as reported in the method instructions.
Camel Hair Brushes	Ted Pella	11859	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Dual Index Kit TS Set A 96 rxns	10X Genomics	PN-1000251	Use to perform spatial transcriptomics.
Ethanol 200 Proof	Decon Labs Inc	2701	Use to perform tissue dehydration as reported in the method instructions.
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (EDTA)	Thermo Fisher Scientific	S312-500	Use to prepare EDTA 20% pH 8.0.
Fisherbrand Curved Medium Point General Purpose Forceps	Fisher Scientific	16-100-110	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Fisherbrand Fine Precision Probe	Fisher Scientific	12-000-153	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15	Use to attach sectioned scrolls as reported in the guidelines.
High profile diamond microtome blades	CL Sturkey	D554DD	Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines.
Novaseq 150PE	Novogene	N/A	Sequencer.
Paraformaldehyde (PFA) 32% Aqueous Solution EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Dilute to final concentration of 4% with 1x PBS  to perform tissue fixation.
Phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010-049	Ready to use. Use to dilute PFA and to perform washes as reported in the method instructions.
Premiere Tissue Floating Bath	Fisher Scientific	A84600061	Use to remove wrinkles from FFPE sections as reported in the guidelines.
RNase AWAY Surface Decontaminant	Thermo Fisher Scientific	7002	Use to clean all surfaces as reported in the method instructions.
RNeasy DSP FFPE Kit	Qiagen	73604	Use to isolate RNA from FFPE sections once they have been generated as reported in the guidelines.
Semi-Automated Rotary Microtome	Leica Biosystems	RM2245	Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines.
Sodium hydroxide	Millipore Sigma	S8045-500	Prepare 10 N solution by slowly dissolving 400 g in 1 liter of Milli-Q water.
Space Ranger	10X Genomics	2.0.1	Use to process sequencing data output .
Surgipath Paraplast	Leica Biosystems	39601006	Use to perform tissue infliltration and embedding as reported in the method instructions.
Visium Accessory Kit	10X Genomics	PN-1000194	Use to perform spatial transcriptomic experiments.
Visium Human Transcriptome Probe Kit Small	10X Genomics	PN-1000363	Use to perform spatial transcriptomic experiments.
Visium Spatial Gene Expression Slide Kit 4 rxns	10X Genomics	PN-1000188	Use to place the sections if performing spatial transcriptomic experiments.
Xylene	Leica Biosystems	3803665	Use to perform tissue clearing as reported in the method instructions.