Metodi per abilitare la trascrittomica spaziale dei tessuti ossei

Riepilogo

Qui descriviamo un metodo che consente la decalcificazione dei tessuti ossei appena ottenuti e la conservazione di RNA di alta qualità. Viene inoltre illustrato un metodo per il sezionamento di campioni FFPE (Formalin Fixed Paraffin Embedded) di ossa non demineralizzate per ottenere risultati di buona qualità se i tessuti freschi non sono disponibili o non possono essere raccolti.

Abstract

Comprendere la relazione tra le cellule e la loro posizione all'interno di ciascun tessuto è fondamentale per scoprire i processi biologici associati al normale sviluppo e alla patologia della malattia. La trascrittomica spaziale è un potente metodo che consente l'analisi dell'intero trascrittoma all'interno di campioni di tessuto, fornendo così informazioni sull'espressione genica cellulare e sul contesto istologico in cui risiedono le cellule. Sebbene questo metodo sia stato ampiamente utilizzato per molti tessuti molli, la sua applicazione per l'analisi di tessuti duri come l'osso è stata impegnativa. La sfida principale risiede nell'incapacità di preservare l'RNA di buona qualità e la morfologia dei tessuti durante l'elaborazione dei campioni di tessuto duro per il sezionamento. Pertanto, qui viene descritto un metodo per elaborare campioni di tessuto osseo appena ottenuti per generare efficacemente dati di trascrittomica spaziale. Il metodo consente la decalcificazione dei campioni, garantendo sezioni di tessuto di successo con dettagli morfologici preservati ed evitando la degradazione dell'RNA. Inoltre, vengono fornite linee guida dettagliate per i campioni precedentemente inclusi in paraffina, senza demineralizzazione, come i campioni raccolti dalle banche dei tessuti. Utilizzando queste linee guida, vengono mostrati dati di trascrittomica spaziale di alta qualità generati da campioni di banche di tessuti di tumore primario e metastasi polmonari dell'osteosarcoma osseo.

Introduzione

L'osso è un tessuto connettivo specializzato composto principalmente da fibre di collagene di tipo 1 e sali inorganici¹. Di conseguenza, l'osso è incredibilmente forte e rigido pur essendo allo stesso tempo leggero e resistente ai traumi. La grande forza dell'osso deriva dal suo contenuto di minerali. Infatti, per ogni dato aumento della percentuale di contenuto di minerali, la rigidità aumenta di cinque volte². Di conseguenza, i ricercatori si trovano di fronte a problemi significativi quando analizzano, mediante sezionamento istologico, la biologia di un campione osseo.

L'istologia ossea non decalcificata è fattibile e talvolta richiesta, a seconda del tipo di indagine (ad esempio, per studiare la microarchitettura dell'osso); È, tuttavia, molto impegnativo, soprattutto se gli esemplari sono di grandi dimensioni. In questi casi, il processamento tissutale a fini istologici richiede diverse modifiche dei protocolli e delle tecniche standard³. In generale, per eseguire le comuni valutazioni istologiche, i tessuti ossei vengono decalcificati subito dopo la fissazione, un processo che può richiedere da alcuni giorni a diverse settimane, a seconda delle dimensioni del tessuto e dell'agente decalcificante utilizzato⁴. Le sezioni decalcificate sono spesso utilizzate per l'esame del midollo osseo, la diagnosi di tumori, ecc. Esistono tre tipi principali di agenti decalcificanti: acidi forti (ad es. acido nitrico, acido cloridrico), acidi deboli (ad es. acido formico) e agenti chelanti (ad es. acido etilendiamminotetracetico o EDTA)⁵. Gli acidi forti possono decalcificare l'osso molto rapidamente, ma possono danneggiare i tessuti; gli acidi deboli sono molto comuni e adatti per le procedure diagnostiche; Gli agenti chelanti sono di gran lunga i più utilizzati e appropriati per l'applicazione della ricerca poiché, in questo caso, il processo di demineralizzazione è lento e delicato, consentendo il mantenimento di una morfologia di alta qualità e la conservazione delle informazioni geniche e proteiche, come richiesto da molte procedure (ad esempio, ibridazione in situ , immunocolorazione). Tuttavia, quando l'intero trascrittoma deve essere preservato, ad esempio per le analisi dell'espressione genica, anche una demineralizzazione lenta e delicata può essere dannosa. Pertanto, sono necessari approcci e metodi migliori quando l'analisi morfologica dei tessuti deve essere abbinata all'analisi dell'espressione genica delle cellule.

Grazie ai recenti miglioramenti nel sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) e nella trascrittomica spaziale, è ora possibile studiare l'espressione genica di un campione di tessuto anche quando l'inclusione di paraffina per fissazione in formalina (FFPE) è stata utilizzata per conservare i campioni di tessuto ^6,7,8. Questa opportunità ha permesso di accedere a un numero maggiore di campioni, come quelli conservati nelle banche dei tessuti di tutto il mondo. Se lo scRNA-seq deve essere impiegato, l'integrità dell'RNA è il requisito più importante; tuttavia, nel caso della trascrittomica spaziale di campioni FFPE, sono necessarie sia sezioni di tessuto di alta qualità che RNA di alta qualità per visualizzare l'espressione genica nel contesto istologico di ciascuna sezione di tessuto. Mentre questo è stato facilmente ottenuto con i tessuti molli, lo stesso non si può dire per i tessuti duri come le ossa. Infatti, per quanto ne sappiamo, nessuno studio che utilizzi la trascrittomica spaziale è mai stato condotto su campioni ossei FFPE. Ciò è dovuto alla mancanza di protocolli in grado di elaborare efficacemente i tessuti ossei FFPE preservandone il contenuto di RNA. In questo caso, viene fornito prima un metodo per elaborare e decalcificare i campioni di tessuto osseo appena ottenuti, evitando la degradazione dell'RNA. Quindi, riconoscendo la necessità di un'analisi trascrittomica dei campioni FFPE raccolti nelle banche dei tessuti di tutto il mondo, vengono presentate anche le linee guida sviluppate per gestire correttamente i campioni FFPE di ossa non demineralizzate.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali descritte di seguito sono state approvate in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio presso la School of Dental Medicine dell'Università di Pittsburgh.

1. Metodo per preparare blocchi FFPE di campioni di tessuto osseo che richiedono demineralizzazione

1. Preparazione dei reagenti e dei materiali
   1. Preparare EDTA 20% pH 8.0. Per 1 L, sciogliere 200 g di EDTA in 800 mL di acqua ultrapura, regolare il pH a 8,0 con idrossido di sodio 10 N e infine portare il volume a 1L con acqua ultrapura. Conservare a temperatura ambiente.
      NOTA: Utilizzare sempre EDTA 20% pH 8.0 appena preparato. L'idrossido di sodio (NaOH) 10 N viene preparato sciogliendo 400 g di NaOH in 1 L di acqua ultrapura.
   2. Preparare la paraformaldeide (PFA) al 4% in una cappa aspirante utilizzando 1x PBS senza calcio e magnesio.
      NOTA: Designare un'area in una cappa aspirante per lavorare con soluzioni concentrate di paraformaldeide o solidi di paraformaldeide ed etichettarla come tale. Per evitare l'esposizione, tenere i contenitori chiusi il più possibile. Utilizzare nelle quantità minime necessarie per l'esperimento in corso. Se la pesata della polvere di paraformaldeide e la bilancia non possono essere utilizzate in una cappa aspirante, prendere prima un contenitore, quindi aggiungere la polvere di PFA nella cappa e coprire prima di tornare alla bilancia per pesare la polvere. Utilizzare sempre il 4% di PFA appena preparato.
   3. Utilizzare un contenitore adatto per ogni campione.
      NOTA: Ad esempio, per 1 mg di tessuto osseo, utilizzare un contenitore che consenta ad almeno 1 ml di qualsiasi soluzione di entrare in contatto con l'osso.
   4. Sterilizzare tutte le attrezzature chirurgiche necessarie per la dissezione.
   5. Pulire tutte le aree con una soluzione decontaminante per rimuovere le RNasi.
   6. Raccogli i materiali sperimentali rimanenti, inclusi contenitori di ghiaccio, spray all'etanolo al 70% e accedi a un agitatore orbitale.
2. Isolamento di campioni di tessuto osseo da topi
   1. Sopprimere il topo mediante esposizione a CO₂ , quindi eseguire la lussazione cervicale e adagiarlo sulla schiena. Spruzzare la pelle del topo con etanolo al 70%.
   2. Usando le forbici da dissezione sterili, aprire la pelle ed esporre il muscolo della gamba. Taglia il muscolo lungo la gamba per ottenere una visione chiara della posizione dell'osso e disarticola delicatamente l'osso per rimuoverlo senza danni.
      NOTA: Non è necessario rimuovere completamente tutto il muscolo attaccato all'osso. Cerca di essere il più veloce possibile per limitare la degradazione dell'RNA.
   3. Posizionare immediatamente il campione osseo in una provetta contenente il 4% di PFA e posizionare la provetta sul ghiaccio.
   4. Ripetere la procedura per raccogliere altri campioni di osso come desiderato.
   5. Mettere i campioni con il 4% di PFA in agitazione su un agitatore orbitale a 140 giri/min a 4 °C per almeno 24 ore per consentire un corretto fissaggio.
3. Decalcificazione di campioni di tessuto osseo
   1. Recuperare il tessuto osseo dall'agitatore orbitale dopo la fissazione.
   2. Lavare il tessuto osseo 2 volte con 1x PBS per 3 minuti su uno shaker orbitale a 140 giri/min per rimuovere il PFA rimasto.
   3. Utilizzando le forbici da dissezione sterili, rimuovere i muscoli rimanenti ancora attaccati all'osso.
   4. Lavare il tessuto osseo ancora una volta con 1x PBS per 3 minuti.
   5. Posizionare il tessuto osseo in un nuovo contenitore con EDTA al 20% a pH 8,0. Quindi, posizionare il contenitore su un agitatore orbitale a 140 giri/min per 30 minuti a temperatura ambiente (RT).
   6. Scartare la soluzione, aggiungere il 20% di EDTA pH 8.0 fresco nel contenitore e posizionarlo su un agitatore orbitale a 140 giri/min per 30 minuti a RT.
   7. Ripetere il passaggio 1.3.6 10 volte.
   8. Scartare la soluzione, aggiungere il 20% di EDTA pH 8.0 fresco nel contenitore e porlo a 4 °C in una cella frigorifera su un agitatore orbitale a 140 giri/min per una notte.
4. Disidratazione di campioni di tessuto osseo
   1. Recuperare il campione di tessuto osseo dal contenitore.
   2. Ispezionare il tessuto e verificare l'efficienza della decalcificazione ruotando e torcendo delicatamente l'osso. In alternativa, eseguire una radiografia dell'osso utilizzando una macchina a raggi X.
      NOTA: Se il campione si flette facilmente, è stato raggiunto un buon grado di decalcificazione. In caso contrario, i parametri di decalcificazione (tempo, velocità di agitazione, volume del 20% di EDTA pH 8.0 utilizzato, ecc.) devono essere aumentati.
   3. Lavare il tessuto osseo 2 volte con 1x PBS per 3 minuti per rimuovere i residui di EDTA.
   4. Mettere il tessuto osseo in un nuovo contenitore e iniziare la disidratazione con etanolo al 70%. Incubare per 15 minuti a 140 giri/min.
   5. Scartare la soluzione di etanolo al 70%, immergere il campione in una soluzione di etanolo al 90% e incubare per 15 minuti a 140 giri/min.
   6. Scartare la soluzione di etanolo al 90%, immergere il campione in etanolo al 100% e incubare per 15 minuti a 140 giri/min.
   7. Scartare l'etanolo al 100%, immergere il campione in etanolo nuovo al 100% e incubare per 15 minuti a 140 giri/min.
   8. Scartare l'etanolo al 100%, immergere il campione in etanolo nuovo al 100% e incubare per 15 minuti a 140 giri/min.
   9. Scartare l'etanolo al 100%, immergere il campione in un nuovo etanolo al 100% e incubare per 30 minuti a 140 giri/min.
   10. Scartare l'etanolo al 100%, immergere il campione in un nuovo etanolo al 100% e incubare per 45 minuti a 140 giri/min.
       NOTA: La disidratazione può essere eseguita anche utilizzando un processore automatico. In questo caso, impostare il programma con le stesse condizioni riportate per la disidratazione manuale. Le condizioni riportate si riferiscono a campioni di spessore non superiore a 4 mm (cioè campioni di tessuto osseo ottenuti da topi). Per i campioni di spessore superiore a 4 mm, il tempo di disidratazione deve essere determinato sperimentalmente.
5. Pulizia di campioni di tessuto osseo
   1. Posizionare il campione di tessuto osseo in un nuovo contenitore e avviare il processo di chiarificazione utilizzando lo xilene. Incubare per 20 minuti a 140 giri/min.
   2. Scartare lo xilene usato, aggiungere nuovo xilene e incubare per altri 20 minuti a 140 giri/min.
   3. Scartare lo xilene usato, aggiungere nuovo xilene e incubare per 45 minuti a 140 giri/min.
      NOTA: La cancellazione può essere eseguita anche utilizzando un processore automatico. In questo caso, impostare il programma con le stesse condizioni riportate per lo svuotamento manuale. Le condizioni riportate si riferiscono a campioni di spessore non superiore a 4 mm (cioè campioni di tessuto osseo ottenuti da topi). Per i campioni di spessore superiore a 4 mm, la tempistica deve essere determinata sperimentalmente.
6. Infiltrazione e inclusione di campioni di tessuto osseo
   1. Recuperare il campione di tessuto osseo dall'agitatore orbitale/processore automatico dopo la pulizia.
   2. Collocare il campione di tessuto osseo in una cassetta di inclusione e avviare l'infiltrazione con la cera (vedere Tabella dei materiali). Incubare per 30 minuti a 60 °C.
   3. Scartare la cera usata, aggiungere nuova cera e incubare per 30 minuti a 60 °C.
   4. Scartare la cera usata, aggiungere nuova cera e incubare per 45 minuti a 60 °C.
   5. Posizionare con cura il campione di tessuto osseo in uno stampo con l'orientamento desiderato.
   6. Lasciare solidificare il blocco di campioni su una superficie fredda.
   7. Conservare il FFPE ottenuto a 4 °C fino al momento di iniziare il sezionamento.
      NOTA: Il blocco FFPE può essere conservato per molti anni prima di eseguire il sezionamento.

2. Linee guida per il sezionamento di campioni FFPE non demineralizzati

NOTA: Le seguenti linee guida forniscono preziosi consigli e istruzioni utili a migliorare notevolmente la qualità delle sezioni di tessuto evitando la degradazione dell'RNA soprattutto nei casi di piccoli campioni ossei non decalcificati. Queste linee guida possono essere applicate anche ai campioni di osso decalcificato, quando disponibili. Per campioni di tessuto osseo più grandi, è necessario eseguire la demineralizzazione per ottenere sezioni di migliore qualità; In tali casi, deve essere seguito il metodo sopra riportato e i parametri (tempi, volumi di soluzioni, ecc.) devono essere regolati di conseguenza. Le seguenti linee guida sono adatte sia quando i tessuti ossei FFPE sono già stati processati (ad esempio, blocco FFPE raccolto da banche dei tessuti o altri laboratori) sia quando le sezioni raccolte verranno utilizzate per eseguire qualsiasi tipo di analisi che richieda RNA di buona qualità, sezioni di tessuto di alta qualità o entrambi.

1. Preparazione dell'attrezzatura
   1. Spruzzare tutte le superfici di lavoro e gli strumenti con soluzioni decontaminanti per rimuovere le RNasi.
   2. Preparare un bagnomaria con acqua distillata doppia e impostare la temperatura a 42 °C.
   3. Prendi una lama per microtomo, spruzzala con etanolo al 70% per rimuovere i residui di olio, quindi spruzzala con soluzioni decontaminanti per rimuovere le RNasi.
   4. Fissare la lama sul microtomo. Assicurarsi che l'angolo di spoglia sia impostato su 10°.
      NOTA: Utilizzare sempre lame nuove per il sezionamento.
   5. Prepara due secchi di ghiaccio.
   6. Prendi pinzette, spazzole e sonde, spruzzali con soluzioni decontaminanti per rimuovere le RNasi e mettili in uno dei due secchi per il ghiaccio.
   7. Preparare un bagno di ghiaccio aggiungendo acqua distillata doppia all'altro secchiello del ghiaccio.
      NOTA: il blocco FFPE non deve galleggiare nell'acqua aggiunta; Pertanto, la quantità di acqua aggiunta al secchiello del ghiaccio deve essere appena sufficiente per consentire al campione di essere bagnato senza galleggiare.
2. Taglio
   1. Recuperare il blocco FFPE dal deposito a 4 °C e posizionarlo sul microtomo. Impostare il comando su Trim o su 14 μm di spessore di scorrimento e iniziare a tagliare il campione fino a quando il tessuto non è esposto.
      NOTA: Se il blocco FFPE è già stato tagliato e il tessuto è già esposto, saltare il passaggio 2.2.1. Verificare che il blocco sia privo di buchi e crepe. In tal caso, procedere direttamente al passaggio 2.2.2. In caso contrario, tagliare alcune sezioni per appiattire la superficie ed evitare buchi e crepe, quindi procedere al passaggio 2.2.2.
   2. Posizionare il blocco FFPE sul bagno di ghiaccio per idratare il campione. Il tempo di idratazione deve essere determinato sperimentalmente.
      1. Inizia con 2 minuti e aumenta il tempo se l'idratazione non è sufficiente. Non superare i 10 min. L'idratazione espanderà il tessuto e ridurrà la formazione di "veneziane" e linee. Tempi di idratazione più lunghi potrebbero causare crepe nel blocco di paraffina e, possibilmente, distacco dei tessuti.
      2. Se 10 minuti non sono sufficienti per idratare il campione, eseguire cicli di idratazione non più lunghi di 10 minuti e riprovare il sezionamento.
      3. Se la superficie del blocco non è liscia e pulita a causa di crepe o tagli, prendere in considerazione la possibilità di incorporare nuovamente il campione. La qualità dell'RNA non sarà influenzata dal processo di re-inclusione.
   3. Inserire il campione nel morsetto del microtomo, allinearlo con la lama e iniziare il sezionamento. Impostare lo spessore della coclea su 5 μm.
   4. Raccogliere la sezione e metterla nel bagnomaria a 42 °C utilizzando una pinzetta fredda e spazzole.
      NOTA: In alternativa, se si desidera eseguire l'isolamento dell'RNA di sezioni di tessuto, raccogliere le sezioni in una provetta da centrifuga e seguire le specifiche di produzione per la preparazione dell'RNA (vedere la Tabella dei materiali).
   5. Incubare la sezione nel bagnomaria per distendere il tessuto ed eliminare eventuali rughe e pieghe residue.
      NOTA: Il tempo di galleggiamento nel bagno d'acqua per ogni sezione deve essere determinato sperimentalmente. Prendi in considerazione la possibilità di lasciare le sezioni ossee un minuto in più se si verificano problemi di distacco dei tessuti. Non lasciare la sezione galleggiante troppo a lungo poiché lunghi tempi di galleggiamento potrebbero danneggiare il tessuto.
   6. Posizionare la sezione su un vetrino, quindi incubarla per 3 ore a 42 °C.
   7. Posizionare il vetrino in un essiccatore o in un forno per una notte a RT per una corretta asciugatura.
   8. Conservare il vetrino con la sezione attaccata su RT in una scatola per vetrini.
      NOTA: I vetrini possono essere conservati per molti anni presso RT. Se verrà eseguita la trascrittomica spaziale, invece di un vetrino, posizionare la sezione sul vetrino di espressione genica spaziale fornito dal produttore e seguire le raccomandazioni riportate (vedere la Tabella dei materiali).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

Il metodo qui presentato descrive come elaborare ossa appena isolate per ottenere campioni di FFPE demineralizzati che possono essere facilmente sezionati con un microtomo preservando l'integrità dell'RNA (Figura 1). Il metodo è stato impiegato con successo su femori murini, ma può essere seguito per altri campioni di tessuto osseo di dimensioni simili, oppure può essere adattato per campioni ossei più grandi (ad esempio, campioni umani) aumentando tutti i parametri (tempistiche, volumi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

Qui, viene fornito un metodo dettagliato per preparare blocchi FFPE di ossa decalcificate e preservare l'integrità dell'RNA per il sequenziamento (ad esempio, sequenziamento di nuova generazione (NGS)) o per altre tecniche correlate all'RNA (ad esempio, ibridazione in situ , reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa quantitativa (qRT-PCR), ecc.).

Il metodo utilizza l'EDTA per decalcificare campioni di tessuto osseo; l'incubazione con EDTA consente una demineralizzazio...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced orbital shaker	VWR	76683-470	Use to keep tissues under agitation during incubation as reported in the method instructions.
Camel Hair Brushes	Ted Pella	11859	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Dual Index Kit TS Set A 96 rxns	10X Genomics	PN-1000251	Use to perform spatial transcriptomics.
Ethanol 200 Proof	Decon Labs Inc	2701	Use to perform tissue dehydration as reported in the method instructions.
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (EDTA)	Thermo Fisher Scientific	S312-500	Use to prepare EDTA 20% pH 8.0.
Fisherbrand Curved Medium Point General Purpose Forceps	Fisher Scientific	16-100-110	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Fisherbrand Fine Precision Probe	Fisher Scientific	12-000-153	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15	Use to attach sectioned scrolls as reported in the guidelines.
High profile diamond microtome blades	CL Sturkey	D554DD	Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines.
Novaseq 150PE	Novogene	N/A	Sequencer.
Paraformaldehyde (PFA) 32% Aqueous Solution EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Dilute to final concentration of 4% with 1x PBS  to perform tissue fixation.
Phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010-049	Ready to use. Use to dilute PFA and to perform washes as reported in the method instructions.
Premiere Tissue Floating Bath	Fisher Scientific	A84600061	Use to remove wrinkles from FFPE sections as reported in the guidelines.
RNase AWAY Surface Decontaminant	Thermo Fisher Scientific	7002	Use to clean all surfaces as reported in the method instructions.
RNeasy DSP FFPE Kit	Qiagen	73604	Use to isolate RNA from FFPE sections once they have been generated as reported in the guidelines.
Semi-Automated Rotary Microtome	Leica Biosystems	RM2245	Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines.
Sodium hydroxide	Millipore Sigma	S8045-500	Prepare 10 N solution by slowly dissolving 400 g in 1 liter of Milli-Q water.
Space Ranger	10X Genomics	2.0.1	Use to process sequencing data output .
Surgipath Paraplast	Leica Biosystems	39601006	Use to perform tissue infliltration and embedding as reported in the method instructions.
Visium Accessory Kit	10X Genomics	PN-1000194	Use to perform spatial transcriptomic experiments.
Visium Human Transcriptome Probe Kit Small	10X Genomics	PN-1000363	Use to perform spatial transcriptomic experiments.
Visium Spatial Gene Expression Slide Kit 4 rxns	10X Genomics	PN-1000188	Use to place the sections if performing spatial transcriptomic experiments.
Xylene	Leica Biosystems	3803665	Use to perform tissue clearing as reported in the method instructions.