뼈 조직의 공간 전사체학(spatial transcriptomics)을 가능하게 하는 방법

요약

여기에서는 갓 얻은 뼈 조직의 석회질을 제거하고 고품질 RNA를 보존할 수 있는 방법을 설명합니다. 또한 새로운 조직을 구할 수 없거나 채취할 수 없는 경우 우수한 품질의 결과를 얻기 위해 비탈염된 뼈의 FFPE(Formalin Fixed Paraffin Embedded) 샘플을 절편하는 방법이 예시되어 있습니다.

초록

세포와 각 조직 내 세포 위치 간의 관계를 이해하는 것은 정상적인 발달 및 질병 병리와 관련된 생물학적 과정을 밝히는 데 중요합니다. 공간 전사체학(Spatial transcriptomics)은 조직 샘플 내 전체 전사체를 분석할 수 있는 강력한 방법으로, 세포 유전자 발현과 세포가 존재하는 조직학적 맥락에 대한 정보를 제공합니다. 이 방법은 많은 연조직에 광범위하게 활용되어 왔지만 뼈와 같은 경조직 분석에 적용하는 것은 까다로웠습니다. 가장 큰 문제는 절편을 위해 경질 조직 샘플을 처리하는 동안 우수한 품질의 RNA 및 조직 형태를 보존할 수 없다는 것입니다. 따라서, 공간 전사체학 데이터를 효과적으로 생성하기 위해 갓 얻은 뼈 조직 샘플을 처리하는 방법을 여기에서는 설명합니다. 이 방법을 사용하면 샘플의 석회질을 제거할 수 있으며, RNA 분해를 피하면서 형태학적 세부 사항이 보존된 성공적인 조직 절편을 얻을 수 있습니다. 또한, 조직 은행에서 채취한 샘플과 같이 이전에 탈염 없이 파라핀이 내장되어 있던 샘플에 대한 자세한 지침이 제공됩니다. 이 가이드라인을 사용하여 뼈 골육종의 원발성 종양 및 폐 전이의 조직 은행 샘플에서 생성된 고품질 공간 전사체학 데이터를 보여줍니다.

서문

뼈는 주로 콜라겐 유형 1과 무기 염¹의 섬유로 구성된 특수 결합 조직입니다. 그 결과, 뼈는 믿을 수 없을 정도로 강하고 뻣뻣하며, 동시에 가볍고 외상에 강합니다. 뼈의 위대한 힘은 미네랄 함량에서 비롯됩니다. 실제로, 미네랄 함량의 비율이 증가할 때마다 강성은 5배 증가합니다². 결과적으로, 연구자들은 조직학적 절편을 통해 뼈 표본의 생물학을 분석할 때 심각한 문제에 직면하게 됩니다.

석회질화되지 않은 뼈 조직학은 실현 가능하며 조사 유형에 따라 때때로 필요합니다(예: 뼈의 미세 구조 연구). 그러나 특히 표본이 큰 경우 매우 어렵습니다. 이러한 경우, 조직학적 목적을 위한 조직 처리는 표준 프로토콜 및 기법의 몇 가지 수정을 필요로 한다³. 일반적으로 일반적인 조직학적 평가를 수행하기 위해 뼈 조직은 고정 직후 석회질을 제거하는데, 이 과정은 조직의 크기와 사용된 석회질 제거제에 따라 며칠에서 몇 주가 걸릴 수 있습니다⁴. 석회질을 제거한 절편은 골수 검사, 종양 진단 등에 자주 사용됩니다. 석회질 제거제에는 강산(예: 질산, 염산), 약산(예: 포름산) 및 킬레이트제(예: 에틸렌디아민테트라트산 또는 EDTA^)의 세 가지 주요 유형이 있습니다5. 강산은 뼈를 매우 빠르게 석회질을 제거할 수 있지만 조직을 손상시킬 수 있습니다. 약산은 매우 일반적이며 진단 절차에 적합합니다. 킬레이트제는 이 경우 탈염 과정이 느리고 부드러워 많은 절차(예: in situ hybridization, immunostaining)에서 요구하는 대로 고품질 형태를 유지하고 유전자 및 단백질 정보를 보존할 수 있기 때문에 연구 응용 분야에 가장 많이 사용되고 적합합니다. 그러나 유전자 발현 분석과 같이 전체 전사체를 보존해야 하는 경우 느리고 부드러운 탈염조차도 해로울 수 있습니다. 따라서 조직의 형태학적 분석이 세포의 유전자 발현 분석과 쌍을 이룰 필요가 있는 경우 더 나은 접근 방식과 방법이 필요합니다.

최근 단세포 RNA 염기서열분석(scRNA-seq) 및 공간 전사체학(spatial transcriptomics)의 개선 덕분에, 이제 포르말린 고정 파라핀 매매(FFPE)를 사용하여 조직 샘플을 보관한 경우에도 조직 샘플의 유전자 발현을 연구할 수 있습니다 ^6,7,8. 이 기회를 통해 전 세계 조직 은행에 보관된 것과 같은 더 많은 수의 샘플에 액세스할 수 있게 되었습니다. scRNA-seq를 사용하는 경우 RNA 무결성이 가장 중요한 요구 사항입니다. 그러나 FFPE 샘플의 공간 전사체학의 경우 각 조직 절편의 조직학적 맥락 내에서 유전자 발현을 시각화하기 위해 고품질 조직 절편과 고품질 RNA가 모두 필요합니다. 이것은 연조직에서는 쉽게 달성될 수 있지만 뼈와 같은 단단한 조직에서는 동일하게 말할 수 없습니다. 사실, 우리가 아는 한, 공간 전사체학을 사용한 연구는 FFPE 뼈 샘플에 대해 수행된 적이 없습니다. 이는 RNA 함량을 보존하면서 FFPE 뼈 조직을 효과적으로 처리할 수 있는 프로토콜이 없기 때문입니다. 여기에서는 RNA 분해를 피하면서 갓 얻은 뼈 조직 샘플을 처리하고 석회질을 제거하는 방법을 먼저 제공합니다. 그런 다음 전 세계 조직 은행에서 수집된 FFPE 샘플의 전사체학 분석의 필요성을 인식하여 탈염되지 않은 뼈의 FFPE 샘플을 적절하게 취급하기 위한 개발된 지침도 제시됩니다.

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프로토콜

아래에 설명된 모든 동물 시술은 University of Pittsburgh School of Dental Medicine의 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals에 따라 승인되었습니다.

1. 탈염이 필요한 뼈 조직 샘플의 FFPE 블록을 제조하는 방법

1. 시약 및 재료의 준비
   1. EDTA 20% pH 8.0을 준비합니다. 1L의 경우 초순수 800mL에 EDTA 200g을 용해시키고 수산화나트륨 10N으로 pH를 8.0으로 조정한 다음 마지막으로 초순수로 부피를 1L로 가져옵니다. 실온에서 보관하십시오.
      알림: 항상 신선하게 준비된 EDTA 20% pH 8.0을 사용하십시오. 수산화 나트륨 (NaOH) 10N은 400g의 NaOH를 1L의 초순수에 용해시켜 제조합니다.
   2. 칼슘과 마그네슘이 없는 4x PBS를 사용하여 흄 후드에 파라포름알데히드(PFA) 1%를 준비합니다.
      알림: 농축된 파라포름알데히드 용액 또는 파라포름알데히드 고체로 작업하기 위한 흄 후드의 영역을 지정하고 그렇게 라벨을 붙입니다. 노출을 피하려면 용기를 가능한 한 닫아 두십시오. 수행 중인 실험에 필요한 최소한의 실제 양으로 사용하십시오. 파라포름알데히드 분말을 계량하고 저울을 흄 후드에서 사용할 수 없는 경우, 먼저 용기를 취한 다음 후드와 덮개에 PFA 분말을 추가한 후 저울로 돌아가 분말의 무게를 측정합니다. 항상 신선하게 조리된 4% PFA를 사용하십시오.
   3. 각 표본에 적합한 용기를 사용하십시오.
      참고: 예를 들어, 뼈 조직 1mg의 경우 최소 1mL의 용액이 뼈와 접촉할 수 있는 용기를 사용하십시오.
   4. 해부에 필요한 모든 수술 장비를 멸균합니다.
   5. RNase를 제거하기 위해 오염 제거 용액으로 모든 영역을 청소합니다.
   6. 얼음 용기, 70% 에탄올 스프레이를 포함한 나머지 실험 재료를 수집하고 궤도 셰이커에 접근합니다.
2. 생쥐에서 뼈 조직 샘플의 분리
   1. CO₂ 노출로 쥐를 안락사 한 다음 자궁 경부 탈구를 수행하고 등을 눕히십시오. 쥐 피부에 70% 에탄올을 뿌립니다.
   2. 멸균 해부 가위를 사용하여 피부를 열고 다리 근육을 노출시킵니다. 뼈의 위치를 명확하게 볼 수 있도록 다리 옆의 근육을 자르고 뼈를 부드럽게 분리하여 손상 없이 제거합니다.
      참고: 뼈에 붙어있는 모든 근육을 완전히 제거할 필요는 없습니다. RNA 분해를 제한하기 위해 가능한 한 빨리 노력하십시오.
   3. 즉시 뼈 샘플을 4% PFA가 함유된 튜브에 넣고 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
   4. 원하는 대로 다른 뼈 샘플을 수집하려면 절차를 반복합니다.
   5. PFA가 4%인 샘플을 4°C에서 140rpm으로 오비탈 셰이커에 교반하여 최소 24시간 동안 넣어 적절하게 고정할 수 있도록 합니다.
3. 뼈 조직 샘플의 석회질 제거
   1. 고정 후 안와 쉐이커에서 뼈 조직을 회수합니다.
   2. 140rpm의 오비탈 셰이커에서 1x PBS로 2분 동안 뼈 조직을 세척하여 남은 PFA를 제거합니다.
   3. 멸균 절개 가위를 사용하여 뼈에 아직 붙어 있는 남아 있는 근육을 제거합니다.
   4. 1x PBS로 3분 동안 뼈 조직을 한 번 더 씻습니다.
   5. 뼈 조직을 20% EDTA pH 8.0의 새 용기에 넣습니다. 그런 다음 실온(RT)에서 30분 동안 140rpm의 오비탈 셰이커에 용기를 놓습니다.
   6. 용액을 버리고 용기에 새로운 20% EDTA pH 8.0을 추가한 다음 RT에서 30분 동안 140rpm으로 궤도 셰이커에 놓습니다.
   7. 1.3.6 단계를 10 번 반복합니다.
   8. 용액을 버리고 용기에 신선한 20% EDTA pH 8.0을 넣고 4°C의 냉장실에서 140rpm의 궤도 셰이커에 밤새 둡니다.
4. 뼈 조직 샘플의 탈수
   1. 용기에서 뼈 조직 샘플을 회수합니다.
   2. 조직을 검사하고 뼈를 부드럽게 돌리고 비틀어 석회질 제거 효과를 확인합니다. 또는 X-ray 기계를 사용하여 뼈의 X-ray를 수행합니다.
      알림: 표본이 쉽게 구부러지면 좋은 등급의 석회질 제거가 달성된 것입니다. 그렇지 않은 경우 석회질 제거 매개변수(시간, 교반 속도, 사용된 20% EDTA pH 8.0의 부피 등)를 늘려야 합니다.
   3. EDTA의 잔여물을 제거하기 위해 1x PBS로 3분 동안 뼈 조직을 2회 세척합니다.
   4. 뼈 조직을 새 용기에 넣고 70% 에탄올로 탈수를 시작합니다. 140 rpm에서 15분 동안 배양합니다.
   5. 70% 에탄올 용액을 버리고 샘플을 90% 에탄올 용액에 넣고 140rpm에서 15분 동안 배양합니다.
   6. 90% 에탄올 용액을 버리고 샘플을 100% 에탄올에 넣고 140rpm에서 15분 동안 배양합니다.
   7. 100% 에탄올을 버리고 샘플을 새 100% 에탄올에 넣고 140rpm에서 15분 동안 배양합니다.
   8. 100% 에탄올을 버리고 샘플을 새 100% 에탄올에 넣고 140rpm에서 15분 동안 배양합니다.
   9. 100% 에탄올을 버리고 샘플을 새 100% 에탄올에 넣고 140rpm에서 30분 동안 배양합니다.
   10. 100% 에탄올을 버리고 샘플을 새 100% 에탄올에 넣고 140rpm에서 45분 동안 배양합니다.
       알림: 탈수는 자동 프로세서를 사용하여 수행할 수도 있습니다. 이 경우 수동 탈수에 대해 보고된 것과 동일한 조건으로 프로그램을 설정합니다. 보고된 조건은 두께가 4mm 이하인 표본(즉, 마우스에서 얻은 뼈 조직 샘플)에 대한 것입니다. 두께가 4mm보다 두꺼운 시편의 경우 탈수 시기를 실험적으로 결정해야 합니다.
5. 뼈 조직 샘플의 투명화
   1. 뼈 조직 샘플을 새 용기에 넣고 크실렌을 사용하여 투명화 과정을 시작합니다. 140 rpm에서 20분 동안 배양합니다.
   2. 사용한 자일렌을 버리고 새 자일렌을 넣고 140rpm에서 20분 더 배양합니다.
   3. 사용한 크실렌을 버리고 새 크실렌을 넣고 140rpm에서 45분 동안 배양합니다.
      참고: 자동 프로세서를 사용하여 지우기를 수행할 수도 있습니다. 이 경우 수동 지우기에 대해 보고된 것과 동일한 조건으로 프로그램을 설정하십시오. 보고된 조건은 두께가 4mm 이하인 표본(즉, 마우스에서 얻은 뼈 조직 샘플)에 대한 것입니다. 4mm보다 두꺼운 시편의 경우 타이밍을 실험적으로 결정해야 합니다.
6. 뼈 조직 샘플의 침투 및 매립
   1. 세척 후 궤도 셰이커/자동 프로세서에서 뼈 조직 샘플을 회수합니다.
   2. 뼈 조직 샘플을 임베딩 카세트에 넣고 왁스로 침투를 시작합니다( 재료 표 참조). 60 °C에서 30분 동안 배양합니다.
   3. 사용한 왁스를 버리고 새 왁스를 넣고 60°C에서 30분 동안 배양합니다.
   4. 사용한 왁스를 버리고 새 왁스를 넣고 60°C에서 45분 동안 배양합니다.
   5. 뼈 조직 샘플을 원하는 방향의 금형에 조심스럽게 놓습니다.
   6. 시편 블록이 차가운 표면에서 응고되도록 합니다.
   7. 절단을 시작할 준비가 될 때까지 얻은 FFPE를 4°C에서 보관합니다.
      알림: FFPE 블록은 절편이 수행되기 전에 수년 동안 보관할 수 있습니다.

2. 비탈염 FFPE 시료 절단 지침

참고: 다음 지침은 특히 석회질화되지 않은 작은 뼈 표본의 경우 RNA 분해를 피하면서 조직 절편의 품질을 크게 향상시키는 데 유용한 유용한 팁과 지침을 제공합니다. 이 지침은 가능한 경우 석회질이 제거된 뼈 표본에도 적용될 수 있습니다. 더 큰 뼈 조직 샘플의 경우 더 나은 품질의 절편을 얻기 위해 탈염을 수행해야 합니다. 이러한 경우 위에 보고된 방법을 따라야 하며 매개변수(타이밍, 용액의 양 등)를 그에 따라 조정해야 합니다. 다음 가이드라인은 FFPE 뼈 조직이 이미 처리된 경우(예: 조직 은행 또는 기타 실험실에서 수집된 FFPE 블록) 또는 수집된 절편이 양질의 RNA, 고품질 조직 절편 또는 둘 다를 필요로 하는 모든 유형의 분석을 수행하는 데 사용될 경우에 적합합니다.

1. 장비 준비
   1. 모든 작업 표면과 기기에 오염 제거 용액을 분무하여 RNase를 제거합니다.
   2. 이중 증류수로 수조를 준비하고 온도를 42°C로 설정합니다.
   3. 마이크로톰 블레이드에 70% 에탄올을 분무하여 오일 잔류물을 제거한 다음 오염 제거 용액을 분무하여 RNase를 제거합니다.
   4. 마이크로톰에 칼날을 고정합니다. 여유 각도가 10°로 설정되어 있는지 확인합니다.
      알림: 단면화에는 항상 새 날을 사용하십시오.
   5. 얼음 두 통을 준비합니다.
   6. 핀셋, 브러시 및 프로브를 가져와 오염 제거 용액을 뿌려 RNase를 제거한 다음 두 개의 얼음 양동이 중 하나에 넣습니다.
   7. 다른 얼음 양동이에 이중 증류수를 추가하여 얼음 목욕을 준비합니다.
      알림: FFPE 블록은 추가된 물에 뜨지 않아야 합니다. 따라서 얼음 양동이에 첨가되는 물의 양은 샘플이 뜨지 않고 젖을 수 있을 만큼만 해야 합니다.
2. 단면화
   1. 4°C의 보관에서 FFPE 블록을 꺼내 마이크로톰에 놓습니다. 명령을 Trim 또는 스크롤 두께 14μm로 설정하고 조직이 노출될 때까지 샘플 트리밍을 시작합니다.
      알림: FFPE 블록이 이미 트리밍되었고 조직이 이미 노출된 경우 2.2.1단계를 건너뜁니다. 블록에 구멍과 균열이 없는지 확인합니다. 그렇다면 2.2.2단계로 바로 진행하십시오. 그렇지 않은 경우 몇 개의 섹션을 잘라 표면을 평평하게 하고 구멍과 균열을 피한 다음 2.2.2단계로 진행합니다.
   2. FFPE 블록을 얼음 수조에 올려 샘플을 수화합니다. 수화 시간은 실험적으로 결정해야 합니다.
      1. 2분으로 시작하여 수분 공급이 충분하지 않으면 시간을 늘리십시오. 10분을 초과하지 마십시오. 수분 공급은 조직을 확장하고 "베네치안 블라인드"와 라인의 형성을 줄입니다. 수화 시간이 길어지면 파라핀 블록에 균열이 생기고 조직이 분리될 수 있습니다.
      2. 10분이 샘플을 수화하기에 충분하지 않은 경우 10분을 넘지 않는 수화 주기를 수행하고 절편을 다시 시도하십시오.
      3. 균열이나 절단으로 인해 블록의 표면이 매끄럽고 깨끗하지 않은 경우 샘플을 다시 삽입하는 것이 좋습니다. RNA 품질은 재임베딩 공정의 영향을 받지 않습니다.
   3. 샘플을 마이크로톰의 표본 클램프에 넣고 블레이드에 맞춘 다음 절단을 시작합니다. 스크롤 두께를 5μm로 설정합니다.
   4. 단면을 모아 차가운 핀셋과 브러시를 사용하여 42°C의 수조에 넣습니다.
      참고: 또는 조직 절편의 RNA 분리를 수행하는 경우 원심분리기 튜브에서 절편을 수집하고 RNA 준비를 위한 제조 사양을 따르십시오( 재료 표 참조).
   5. 수조에서 단면을 배양하여 조직을 늘리고 잔여 주름과 주름을 제거합니다.
      알림: 각 섹션의 수조에 떠 있는 시간은 실험적으로 결정해야 합니다. 조직 박리 문제가 발생하는 경우 뼈 부분을 1분 더 남겨두는 것이 좋습니다. 떠 있는 시간이 길면 조직이 손상될 수 있으므로 섹션을 너무 오래 떠 있는 상태로 두지 마십시오.
   6. 단면을 유리 슬라이드에 놓고 42°C에서 3시간 동안 배양합니다.
   7. 적절한 건조를 위해 유리 슬라이드를 RT에서 밤새 데시케이터나 오븐에 넣습니다.
   8. RT에서 부착된 부분이 있는 유리 슬라이드를 슬라이드 박스에 보관하십시오.
      참고: 슬라이드는 RT에서 수년 동안 보관할 수 있습니다. 공간 전사체학을 수행하는 경우 유리 슬라이드 대신 제조업체에서 제공한 공간 유전자 발현 슬라이드에 섹션을 배치하고 보고된 권장 사항을 따릅니다( 재료 표 참조).

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결과

여기에 제시된 방법은 RNA 무결성을 유지하면서 마이크로톰으로 쉽게 절단할 수 있는 탈염된 FFPE 샘플을 얻기 위해 갓 분리된 뼈를 처리하는 방법을 설명합니다(그림 1). 이 방법은 대퇴골 쥐에 성공적으로 사용되었지만, 유사한 치수의 다른 뼈 조직 샘플에 대해 따를 수 있으며, 모든 매개변수(타이밍, 용액의 부피 등)를 증가시켜 더 큰 뼈 표본(예: 인간 샘플)에 적용할 수 있?...

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토론

여기에서는 석회질이 제거된 뼈의 FFPE 블록을 준비하고 염기서열분석(즉, 차세대 염기서열분석(NGS)) 또는 기타 RNA 관련 기술( 즉, in situ hybridization, 정량적 역전사 중합효소연쇄반응(qRT-PCR) 등)을 위해 RNA 무결성을 보존하기 위한 자세한 방법을 제공합니다.

이 방법은 EDTA를 사용하여 뼈 조직 샘플을 석회질화합니다. EDTA 배양은 샘플의 느리지만 미세한 탈염을 가능하게 ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced orbital shaker	VWR	76683-470	Use to keep tissues under agitation during incubation as reported in the method instructions.
Camel Hair Brushes	Ted Pella	11859	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Dual Index Kit TS Set A 96 rxns	10X Genomics	PN-1000251	Use to perform spatial transcriptomics.
Ethanol 200 Proof	Decon Labs Inc	2701	Use to perform tissue dehydration as reported in the method instructions.
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (EDTA)	Thermo Fisher Scientific	S312-500	Use to prepare EDTA 20% pH 8.0.
Fisherbrand Curved Medium Point General Purpose Forceps	Fisher Scientific	16-100-110	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Fisherbrand Fine Precision Probe	Fisher Scientific	12-000-153	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15	Use to attach sectioned scrolls as reported in the guidelines.
High profile diamond microtome blades	CL Sturkey	D554DD	Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines.
Novaseq 150PE	Novogene	N/A	Sequencer.
Paraformaldehyde (PFA) 32% Aqueous Solution EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Dilute to final concentration of 4% with 1x PBS  to perform tissue fixation.
Phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010-049	Ready to use. Use to dilute PFA and to perform washes as reported in the method instructions.
Premiere Tissue Floating Bath	Fisher Scientific	A84600061	Use to remove wrinkles from FFPE sections as reported in the guidelines.
RNase AWAY Surface Decontaminant	Thermo Fisher Scientific	7002	Use to clean all surfaces as reported in the method instructions.
RNeasy DSP FFPE Kit	Qiagen	73604	Use to isolate RNA from FFPE sections once they have been generated as reported in the guidelines.
Semi-Automated Rotary Microtome	Leica Biosystems	RM2245	Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines.
Sodium hydroxide	Millipore Sigma	S8045-500	Prepare 10 N solution by slowly dissolving 400 g in 1 liter of Milli-Q water.
Space Ranger	10X Genomics	2.0.1	Use to process sequencing data output .
Surgipath Paraplast	Leica Biosystems	39601006	Use to perform tissue infliltration and embedding as reported in the method instructions.
Visium Accessory Kit	10X Genomics	PN-1000194	Use to perform spatial transcriptomic experiments.
Visium Human Transcriptome Probe Kit Small	10X Genomics	PN-1000363	Use to perform spatial transcriptomic experiments.
Visium Spatial Gene Expression Slide Kit 4 rxns	10X Genomics	PN-1000188	Use to place the sections if performing spatial transcriptomic experiments.
Xylene	Leica Biosystems	3803665	Use to perform tissue clearing as reported in the method instructions.